陳泓宇，董樹廷，郭妙弦，羅紅梅

茯苓基因組中MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定及表達(dá)分析

陳泓宇，董樹廷，郭妙弦，羅紅梅*

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

從全基因組水平挖掘茯苓M(jìn)YB轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，并分析其在菌絲、菌核等部位及茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）誘導(dǎo)后菌絲中的表達(dá)模式，以期發(fā)現(xiàn)與茯苓發(fā)育及次生代謝物生物合成調(diào)控相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子?；谲蜍呋蚪M數(shù)據(jù)，通過序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析挖掘MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，利用ExPASy在線工具預(yù)測分析MYB蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建茯苓M(jìn)YB蛋白進(jìn)化樹，利用MEME在線工具分析保守基序，利用Plant CARE進(jìn)行啟動子區(qū)順式作用元件分析，通過MeJA誘導(dǎo)菌絲并采用qRT-PCR方法檢測基因相對表達(dá)量。在茯苓基因組中共鑒定到10個(gè)含有特征性保守結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中4個(gè)屬于1R類型，4個(gè)屬于2R類型，2個(gè)屬于4R類型。進(jìn)化樹及保守基序顯示，相同進(jìn)化枝的MYB蛋白所含基序類型相似。啟動子區(qū)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)了多類激素及逆境響應(yīng)順式作用元件?；虮磉_(dá)譜分析顯示有2個(gè)基因（和）在菌絲中的表達(dá)量高于菌核中的表達(dá)量，而則是在菌核中表達(dá)量相對較高。MeJA誘導(dǎo)后，有3個(gè)基因（和）在誘導(dǎo)3 h時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)。從茯苓全基因組中系統(tǒng)鑒定MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族，為進(jìn)一步研究基因在調(diào)控茯苓發(fā)育及次生代謝物合成方面的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

茯苓；MYB轉(zhuǎn)錄因子；全基因組鑒定；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)分析

茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核，其干燥菌核作為藥食兩用的傳統(tǒng)大宗藥材，在中國有上百年的商業(yè)化種植歷史。在《中國藥典》2020年版記載具有利水滲濕、健脾寧心的功效[1]，國內(nèi)市場年需求量約2萬t，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥、保健食品、洗化用品等領(lǐng)域[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，茯苓菌核中富含多糖類、氨基酸類、甾醇類、萜類等多種化學(xué)成分[3]，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。

目前，對茯苓的研究多集中于化學(xué)成分、藥理作用、炮制加工、中藥復(fù)方等領(lǐng)域[5]。作為一種應(yīng)用廣泛的藥用真菌，近年來茯苓的次生代謝產(chǎn)物生物合成、能量來源、生長發(fā)育以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究引起廣泛關(guān)注，例如，茯苓三萜合成途徑中的磷酸甲羥戊酸激酶基因（）[6]、鯊烯合酶基因（）[7]、羊毛甾醇合酶基因（）[8]先后被鑒定。Yang等[9]報(bào)道山梨醇脫氫酶（SORD）、α-半乳糖苷酶（galA）等是茯苓多糖合成途徑中的關(guān)鍵酶。Zhang等[10]對茯苓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)基因在松木降解和菌核形成過程中發(fā)揮了重要作用。此外，也有研究表明，真菌的形態(tài)發(fā)育與次生代謝物的生物合成通常具有密切關(guān)聯(lián)[11]。例如，Velvet復(fù)合體和CBC復(fù)合體在靈芝發(fā)育與次生代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[12]；真菌特異性Zn2Cys6轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控菌絲分枝生長以及色素合成[13]。目前，茯苓全基因組已測序完成[14]，共鑒定到包括GATA zinc finger、bZIP、MYB等在內(nèi)的307個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，為茯苓發(fā)育及次生代謝調(diào)控機(jī)制的研究提供了候選基因。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是普遍存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一[15]，具有廣泛的生物學(xué)功能，在生物體生長發(fā)育、次生代謝、抗病抗逆等過程中發(fā)揮重要作用[16-21]。MYB具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由50～55個(gè)堿基組成，含有1～3個(gè)不完全重復(fù)的R結(jié)構(gòu)，并形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）結(jié)構(gòu)，參與轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合過程[15,22]。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4種類型，即1R-MYB、2R-MYB、3R-MYB和4R-MYB[23]。在植物中，MYB轉(zhuǎn)錄因子參與黃酮、三萜等物質(zhì)的合成與調(diào)控[24-25]。真菌中的MYB轉(zhuǎn)錄因子同樣廣泛參與發(fā)育及次生代謝調(diào)控等多種生理過程。例如，在構(gòu)巢曲霉中MYB轉(zhuǎn)錄因子通過促進(jìn)分生孢子和無性孢子的產(chǎn)生來調(diào)控有性孢子和無性孢子的發(fā)育過程[26]；在禾谷鐮刀菌中系統(tǒng)鑒定了MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族，并發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控次生代謝物合成、環(huán)境脅迫響應(yīng)以及致病性過程[27]；此外，牛樟芝[28]、金針菇[29]、靈芝[30]、側(cè)耳[31]、冬蟲夏草[32]等重要大型真菌MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族均在全基因組水平得到鑒定，并發(fā)現(xiàn)其在真菌發(fā)育及代謝調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。但目前，茯苓M(jìn)YB轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定及生物學(xué)功能尚未見報(bào)道。

本研究在茯苓基因組中系統(tǒng)鑒定了茯苓M(jìn)YB（PcMYB）轉(zhuǎn)錄因子基因家族，并對其蛋白理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、啟動子中的順式作用元件等進(jìn)行預(yù)測分析；基于茯苓菌絲和菌核的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析PcMYB在不同發(fā)育階段中的表達(dá)譜；同時(shí)檢測了在外源激發(fā)子茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）誘導(dǎo)下的PcMYB差異表達(dá)情況，以期為PcMYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

茯苓菌株(F. A. Wolf) Ryvarden & Gilb.（菌株編號CGMCC5.78）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（北京），超低溫保存于本實(shí)驗(yàn)室菌種庫，經(jīng)ITS2序列鑒定為茯苓[14]。營養(yǎng)菌絲體于馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)。茯苓全基因組序列、cDNA序列和氨基酸序列均來源于已發(fā)表的茯苓基因組。

1.2 儀器

RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit，TB Green?Premix Ex Taq?購自TaKaRa公司；MeJA購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。本實(shí)驗(yàn)所用引物由蘇州安升達(dá)生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 PcMYB家族基因鑒定

基于茯苓全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSA：CRA003688），利用Pfam（http://pfam.xfam.org/ search）工具，以MYB結(jié)構(gòu)域（PF00249）為搜索模型，利用HMM 3.0軟件篩選茯苓中含有該結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步利用NCBI數(shù)據(jù)庫的CDD、SMART等在線軟件篩選并確認(rèn)PcMYB蛋白序列中是否含有SANT結(jié)構(gòu)域。

2.2 PcMYB蛋白特征、保守基序及啟動子順式作用元件分析

利用在線工具ExPASy protparam tool （https:// web.expasy.org/protparam/）分析PcMYB蛋白的理化性質(zhì)，利用SOPMA軟件（http://npsa- pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白質(zhì)的脂肪系數(shù)及二級結(jié)構(gòu)，利用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ Cell- PLoc-2/）預(yù)測亞細(xì)胞定位情況。利用在線工具M(jìn)EME（http://meme-suite.org/index.html）對PcMYB蛋白的保守基序（Motif）進(jìn)行預(yù)測，Motif的查找數(shù)量設(shè)置為15，其他參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。使用TBtools[33]提取ATG上游2000 bp的MYB基因啟動子序列，利用Plant CARE在線網(wǎng)站（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動子區(qū)域順式作用元件。

2.3 PcMYB進(jìn)化樹構(gòu)建

使用MEGA 7.0軟件將10條WcMYB蛋白序列與赤芝(Leyss. Ex Fr.)、側(cè)耳(Jacq. ex Fr.) P. Kumm.、牛樟芝(M. Zang & C.H. Su) Sheng H. Wu, Ryvarden & T.T. Chang、稻瘟菌Couch.的MYB序列采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap method設(shè)置為1000，其余參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。

2.4 PcMYB基因在不同部位表達(dá)量分析

以茯苓的菌絲、菌核的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)（GSA：CRA003688）為基礎(chǔ)，獲取PcMYB轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)譜，利用TBtools軟件以FPKM值繪制基因表達(dá)量交互熱圖。

2.5 MeJA處理后基因表達(dá)量分析

MeJA作為一種信號分子，可以模擬外界環(huán)境刺激，誘導(dǎo)植物的應(yīng)激化學(xué)防御反應(yīng)以及多種次生代謝物的生物合成。選擇在固體培養(yǎng)基上生長15天的茯苓菌絲體，噴灑濃度為200 μmol/L的MeJA溶液，處理0（對照）、3、6、12 h取樣，檢測基因是否響應(yīng)MeJA處理。利用RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。使用CFX96熒光定量PCR儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，通過序列比對選擇特異性較高的序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，所用引物見表1。根據(jù)此前實(shí)驗(yàn)選擇茯苓中的基因?yàn)閮?nèi)參[34]，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。qRT-PCR的體系為：2×SYBR 7.5 μL，上下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 4.5 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，結(jié)果采用2–ΔΔCt法進(jìn)行分析，基因相對表達(dá)量利用Graphpad Prism 9.0進(jìn)行方差分析。

表1 qRT-PCR引物序列

3 結(jié)果與分析

3.1 PcMYB轉(zhuǎn)錄因子鑒定和蛋白理化性質(zhì)分析

基于茯苓基因組[14]數(shù)據(jù)，通過Pfam注釋篩選到10個(gè)包含MYB_DNA_binding的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，將其命名為～。這些基因編碼的氨基酸序列長度范圍為371 aa（PcMYB5）～1963 aa（PcMYB8），相對分子質(zhì)量范圍為40.76（PcMYB5）～217.430（PcMYB8）。PcMYB蛋白的理論等電點(diǎn)值范圍為4.83（PcMYB6）～6.91（PcMYB7）。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)表示，α-螺旋和無規(guī)卷曲在所有PcMYB蛋白中占主導(dǎo)，其次是延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角。所有蛋白的GRAVY值均為負(fù)，說明PcMYB均為親水性蛋白。此外，PcMYB蛋白的脂肪系數(shù)范圍為57.84（PcMYB3）～73.94（PcMYB5），而不穩(wěn)定系數(shù)顯示，所有的PcMYB蛋白具有較高的不穩(wěn)定性（不穩(wěn)定系數(shù)＞40）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，有9個(gè)PcMYB轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中定位，符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位特點(diǎn)，僅PcMYB9預(yù)測定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（表2）。

表2 PcMYB蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析

3.2 PcMYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族的保守結(jié)構(gòu)分析

使用在線工具SMART對PcMYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在PcMYB基因家族中全部MYB蛋白具有共同的SANT保守結(jié)構(gòu)域，且保守域不只存在于蛋白質(zhì)序列的N端，而且在蛋白質(zhì)的中間序列或者C端區(qū)域均有分布（圖1-A）。PcMYB2、PcMYB4、PcMYB5、PcMYB6含有1個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，屬于1R類MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中PcMYB2和PcMYB6除SANT結(jié)構(gòu)域外還分別含有HAS和ZnFZZ結(jié)構(gòu)域。PcMYB1、PcMYB3、PcMYB7、PcMYB9含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，屬于2R類的MYB轉(zhuǎn)錄因子。而PcMYB8和PcMYB10含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，屬于4R類型。使用WebLogo3對茯苓的1R-MYB和2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PcMYB轉(zhuǎn)錄因子的R1、R2結(jié)構(gòu)域中有多個(gè)保守的氨基酸殘基（圖1-B），其中色氨酸殘基（W）最為保守。此外，在1R結(jié)構(gòu)域中的甘氨酸（G）、谷氨酸（E）、亮氨酸（L）也相對保守；在2R結(jié)構(gòu)域中異亮氨酸（I）、蘇氨酸（T）等較為保守（圖1-B）。

3.3 PcMYB轉(zhuǎn)錄因子基序分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步研究PcMYB基因家族各個(gè)成員間的進(jìn)化關(guān)系及其進(jìn)化保守性，本課題組選擇了擔(dān)子菌門以及子囊菌門部分已經(jīng)鑒定的真菌MYB基因家族成員與茯苓M(jìn)YB基因家族的成員進(jìn)行了進(jìn)化樹分析。利用MEGA 7.0將茯苓10個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子與靈芝中的11個(gè)MYB蛋白、牛樟芝中的8個(gè)MYB蛋白、側(cè)耳中的15個(gè)MYB蛋白、稻瘟菌中的8個(gè)MYB蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。分析進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)茯苓的10個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員被聚類到不同的進(jìn)化枝上，表明茯苓的MYB基因家族成員可能具有不同的功能。PcMYB5、PcMYB6、PcMYB7進(jìn)化關(guān)系相對較近。PcMYB1與側(cè)耳的PoMYB5、稻瘟菌的MoMYB4聚類到1個(gè)進(jìn)化枝。此外，PcMYB10與PoMYB7、MoMYB1聚類到1個(gè)進(jìn)化枝。

進(jìn)一步使用MEME Suite進(jìn)行Motif分析，發(fā)現(xiàn)PcMYB基因家族中PcMYB8、PcMYB10所含的Motif數(shù)目最多為7個(gè)，其余包含的Motif數(shù)目為4或5，Motif1、Motif2、Motif3出現(xiàn)的頻率最高。此外，不同真菌中所含基序表現(xiàn)出進(jìn)化分枝間的特異性，相同進(jìn)化枝的MYB蛋白序列所含的Motif的類型也較為相似，例如在GlMYB09、AcMYB04、PcMYB7、PoMYB12、PcMYB6這一進(jìn)化枝中含有相同的Motif2、Motif3和Motif8。PoMYB07、PcMYB10、AcMYB1和GlMYB07這一進(jìn)化枝中所含的Motif類型與位置也較為一致。

圖1 PcMYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域(A)及其保守氨基酸殘基(B)

圖2 PcMYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和保守基序

3.4 PcMYB基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

為了分析基因潛在的生物學(xué)功能，使用Plant CARE工具鑒定了基因起始密碼子（ATG）上游2000 bp區(qū)域中的順式作用元件。基因啟動子區(qū)中，主要包含生長發(fā)育、植物激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)相關(guān)的3類順式作用元件。其中CAAT-box在10個(gè)基因啟動子中所含數(shù)量最多。除此之外，還含有多種激素響應(yīng)的順式作用元件：例如MeJA響應(yīng)的順式作用元件（TGACG-motif/ CGTCA-motif）、脫落酸響應(yīng)的順式作用元件（ABRE）、水楊酸響應(yīng)的順式作用元件（as-1）。在、、、基因啟動子中，MeJA響應(yīng)的順式作用元件數(shù)目較多。在啟動子區(qū)中，脫落酸響應(yīng)的順式作用元件（ABRE）最多。在脅迫響應(yīng)的順式作用元件中，發(fā)現(xiàn)10個(gè)基因中大多都含有應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件（STRE）、參與環(huán)境適應(yīng)性的MYB元件和MYC元件（圖3）。這些結(jié)果表明基因可能在茯苓的非生物脅迫響應(yīng)和逆境環(huán)境應(yīng)答中發(fā)揮重要功能。

圖3 PcMYB基因啟動子中多種順式作用元件

3.5 PcMYB基因表達(dá)模式分析

基于茯苓基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSA：CRA003688），根據(jù)10條基因的FPKM值，利用TBtools繪制不同部位的基因表達(dá)量熱圖（圖4），結(jié)果表明，茯苓中10個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因均在菌絲和菌核中有不同程度的表達(dá)，其中、在菌絲和菌核中的表達(dá)量顯著高于其他基因的表達(dá)量。、在菌核中表達(dá)量相對較高；其中，在菌核中表達(dá)量明顯高于在菌絲中的表達(dá)量；而、在菌絲中表達(dá)量顯著高于菌核；另外，其他基因、在菌絲和菌核中的表達(dá)量差異不明顯。

圖4 PcMYB基因在菌絲和菌核中的表達(dá)量

MeJA作為一種重要的信號分子，參與生物體中多糖、萜類等多種化合物的合成與調(diào)控[35]。為研究茯苓中MYB基因是否響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)，本研究利用MeJA處理生長旺盛的茯苓菌絲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)程度不同（圖5）。其中、、3個(gè)基因表達(dá)量變化較為明顯。在MeJA處理3 h后表達(dá)量升至對照組的1.47倍；在MeJA處理3 h后表達(dá)量升至對照組的2.2倍，在MeJA處理12 h后表達(dá)量升高至對照組的2.08倍；受MeJA誘導(dǎo)表達(dá)量變化最為明顯，在MeJA處理3 h后表達(dá)量升高至對照組的2.8倍，在MeJA處理12 h后表達(dá)量升高至對照組的3.04倍；而且，這3個(gè)基因在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中位于同一進(jìn)化支（圖2），推測它們可能具有相似的功能。此外還發(fā)現(xiàn)，在MeJA處理6 h后，相較于3 h處理，除外的其他基因表達(dá)量均下降，但在處理12 h后，它們的表達(dá)量又有所上升，顯示出基因?qū)eJA誘導(dǎo)具有不同的響應(yīng)模式。

不同小寫字母（a, b, c, d）表示組間差異顯著；相同小寫字母表示組間無顯著差異（P＜0.05）

4 討論

茯苓廣泛分布于世界各地，在中國幾個(gè)世紀(jì)以來一直用作美食和藥材，其菌核常在針葉樹和硬木樹等宿主的根部附近形成，富含多種化學(xué)成分，包括三萜類、二萜類、甾醇類、多糖類，以及氨基酸、脂肪酸、微量元素和揮發(fā)油等[4]。其中，三萜和多糖類化合物為主要的活性成分。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在真菌菌核發(fā)育與代謝產(chǎn)物調(diào)控過程中發(fā)揮主要作用[11]。多種轉(zhuǎn)錄因子在茯苓基因組中被發(fā)現(xiàn)，但其功能都尚未被鑒定，MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族是其中重要的一類[14]。

在真菌中僅有少數(shù)物種的基因家族被鑒定，例如，牛樟芝中有9個(gè)基因[28]，金針菇中有13個(gè)基因[29]，在赤芝中有12個(gè)MYB基因[30]。本研究從茯苓全基因組中篩選得到10個(gè)PcMYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，PcMYB數(shù)量與赤芝、牛樟芝等真菌中所鑒定到的基因數(shù)量相近。此前，有研究表明，植物基因家族的大量擴(kuò)張是由于基因的串聯(lián)復(fù)制而導(dǎo)致的[36]，而在赤芝、茯苓等基因組中篩選到較少的基因家族成員，這可能與真菌基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生較少量的串聯(lián)復(fù)制有關(guān)。除此之外，在植物中，2R（R2R3）-MYB是主要的MYB轉(zhuǎn)錄因子類型，而在茯苓M(jìn)YB基因家族中的主要類型為1R-MYB和2R-MYB，這表明可能在真菌中主要發(fā)揮功能的是1R-MYB和2R-MYB 2種類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子。

在進(jìn)化樹中，10個(gè)PcMYB轉(zhuǎn)錄因子和赤芝、側(cè)耳等其他真菌中41個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子被聚類為13個(gè)進(jìn)化枝。其中，PcMYB4與牛樟芝AcMYB6、側(cè)耳PoMYB16聚類到一起且具有相同的保守基序，而AcMYB6可能調(diào)控牛樟芝菌絲的生長[28]，從茯苓的基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)在菌絲和菌核中均表達(dá)，在菌絲中的表達(dá)量略高于菌核，根據(jù)結(jié)構(gòu)和序列上的高度保守以及類似的表達(dá)模式，推測PcMYB4可能也具有類似AcMYB6調(diào)控菌絲發(fā)育的功能。另外，在側(cè)耳中，、基因在子實(shí)體中表達(dá)量最高，且受熱脅迫表達(dá)量顯著升高[31]，可能與子實(shí)體生長和熱脅迫響應(yīng)相關(guān)。而在稻瘟菌細(xì)胞壁完整性和抑制幾丁質(zhì)生物合成方面發(fā)揮重要的作用[37]，進(jìn)而提升真菌對環(huán)境壓力的應(yīng)對能力。本研究中的PcMYB1與PoMYB2、PoMYB17、MoMYB8的進(jìn)化關(guān)系較近，且在菌絲和菌核中均有較高水平的表達(dá)量，推測PcMYB1在茯苓菌絲、菌核生長發(fā)育與環(huán)境脅迫響應(yīng)中具有重要作用。另外，和在菌絲中的表達(dá)量高于菌核中的表達(dá)量，而則是在菌核中的表達(dá)量相對較高，這可能暗示這些基因在茯苓菌絲和菌核中發(fā)揮不同功能。在基因啟動子順式作用元件分析中，也同樣發(fā)現(xiàn)基因的啟動子區(qū)富含多種激素和逆境脅迫響應(yīng)的順式作用元件。這些順式作用元件的類型和數(shù)量可能影響基因的表達(dá)水平和生物學(xué)功能。在真菌中，有研究表明MeJA可以調(diào)控大型真菌靈芝中的三萜類合成途徑，提高靈芝酸含量[38-39]；此外，還有報(bào)道稱MeJA可以調(diào)節(jié)靈芝菌絲分枝，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧含量[40]。在本研究中，10條基因啟動子中均存在數(shù)目較多的MeJA響應(yīng)的順式作用元件。因此，本課題組選用了MeJA對茯苓菌絲進(jìn)行處理。結(jié)果表明，這些基因在MeJA處理下顯示出不同的響應(yīng)模式，尤其是和在誘導(dǎo)3 h時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)，推測這2個(gè)基因可能參與茯苓對外界環(huán)境的化學(xué)防御，也可能參與次生代謝途徑的調(diào)控。在茯苓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，在菌絲和菌核中的表達(dá)量相對較高，但是對于MeJA處理其表達(dá)量并未發(fā)現(xiàn)明顯變化，這可能是因?yàn)榛虿恢苯禹憫?yīng)MeJA信號途徑。

綜上所述，本研究基于茯苓基因組鑒定到10個(gè)PcMYB轉(zhuǎn)錄因子。利用生物信息學(xué)分析方法對PcMYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員進(jìn)行預(yù)測分析，并通過菌絲、菌核不同部位表達(dá)量分析及MeJA誘導(dǎo)表達(dá)分析，篩選到可能參與茯苓菌絲或菌核發(fā)育（、和）及MeJA信號響應(yīng)途徑的候選基因（和），后者還可能參與茯苓次生代謝途徑的調(diào)控過程，后續(xù)將進(jìn)一步對這些基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，以期為探究茯苓生長發(fā)育與次生代謝物合成調(diào)控的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Genome-wide characterization and expression analysis of MYB transcription factor gene family in

CHEN Hong-yu, DONG Shu-ting, GUO Miao-xian, LUO Hong-mei

Engineering Research Center of Chinese Medicine Resource, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To discover the MYB transcription factors which related to the regulation on fungal development and secondary metabolsome in, the MYB transcription factor gene family have been mined and identified in the genome of.. In this study, the expression patterns of these genes in different tissues (sclerotium and mycelium) and the relative expression level in the mycelium after treatment by methyl jasmonate (MeJA) were analyzed.Based on the.genome, the MYB gene were identified by Blast and the identification of the conserved domains. The ExPASy protparam tool was used to predict the physicochemical properties of these MYB proteins. The phylogenetictree was constructed by MEGA7.0 software, and the conserved motifs were identified by MEME method. Plant CARE was used to analyze the-acting elements in the promoter regions of these genes. The relative expression levels of these genes were detected by RT-qPCR method.A total of 10 MYB transcription factors with conserved domains were identified in the.genome, among which, four genes belonged to 1R type and 2R type, respectively, and the remaining two genes belonged to 4R type. The phylogenetic analysis and the conserved motif identification showed that the similar conserved motifs were existed in the MYB proteins belonging to the same evolutionary branch. A large number of-elements related to hormones and stress response have been discovered in the promoter regions of these MYB genes. The gene expressional profiles showed that two genes (and) were more highly expressed in mycelium than that in sclerotium, based on the transcriptome data generated from these two tissues. On the contrary,was expressed more abundantly insclerotium. Furthermore, the expression of、和was up-regulated by MeJA induction for 3 h.The MYB transcription factor gene family of.was systematically identified in.genome in this study. This study provides foundation for further identification of the biological functions ofgenes in regulating the development and secondary metabolite biosynthesis in.

(Schw.) Wolf; MYB transcription factor; gene family; bioinformatics analysis; gene expression profiles

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0245 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.026

2022-07-07

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973422）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2021-I2M-1-071）

陳泓宇，碩士研究生，主要從事藥用植物和藥用真菌次生代謝研究。Tel: 18600286727 E-mail: chenhongyu@implad.ac.cn

通信作者：羅紅梅，研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参锎紊x途徑解析。Tel: (010)57833116 E-mail: hmluo@implad.ac.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]