楊梅花， 黃 祥， 韓彥奇， 郭佳星， 李卓怡， 鐘 敏， 徐迎春， 劉長(zhǎng)青

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003； 2.石河子市園林研究所，新疆石河子 832003；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)林業(yè)和草原資源監(jiān)測(cè)中心，新疆烏魯木齊 830011)

睡蓮為睡蓮科(Nymphaeaceae)睡蓮屬(NymphaeaL.)多年生水生植物，在多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1]，具有觀賞性[2]、食用性[3]、藥用性[4]和生態(tài)修復(fù)[5-6]等重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。根據(jù)其生態(tài)習(xí)性，可分為耐寒睡蓮(hardy waterlily)和熱帶睡蓮(tropical waterlily)。其中耐寒睡蓮具有較高的抗寒性，主要分布在20°N以北的地域[7]，而熱帶睡蓮主要分布于熱帶地區(qū)，其在花色、氣味、用途上均優(yōu)于耐寒睡蓮，但耐寒能力差，在北方地區(qū)不能露地越冬，是限制其在北方地區(qū)引種栽培的主要因素。

在低溫脅迫下，植物細(xì)胞的各項(xiàng)生理指標(biāo)等會(huì)發(fā)生顯著變化[8]。同時(shí)，植物的抗寒性由多個(gè)因素綜合控制，抗寒機(jī)制復(fù)雜，抗寒性評(píng)價(jià)必須是多方面的[9]。目前，關(guān)于水生植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)及抗寒性評(píng)價(jià)的研究頗多。梁雪等通過(guò)綜合比較各指標(biāo)，得到了3種濕地植物的耐寒性強(qiáng)弱[10]。李欣等發(fā)現(xiàn)，荷花不同品種對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)能力有一定差異[11]。吉琴針對(duì)6種睡蓮葉片相關(guān)生理指標(biāo)在低溫脅迫下的變化特征，探討了熱帶睡蓮種間的抗寒性差異[12]。而針對(duì)不同生態(tài)類(lèi)型睡蓮的抗寒性生理研究及抗寒性綜合評(píng)價(jià)卻鮮有報(bào)道。

本研究以4種耐寒睡蓮，雪白睡蓮(N.candida)、伊麗莎白(N. ‘Princess Elizabeth’)、科羅拉多(N. ‘Colorado’)、墨西哥黃(N.mexicanaZucc.)，4種熱帶睡蓮黑美人(N. ‘Black Beauty’)、蒂娜(N. ‘Tina’)、九品香(N. ‘hybrid’)、伊斯蘭達(dá)(N. ‘Islamorada’)為試驗(yàn)材料，在低溫脅迫下測(cè)定其葉片相關(guān)生理指標(biāo)，研究8種睡蓮對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制差異，并建立抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系，以期為睡蓮的推廣應(yīng)用和選育抗寒性強(qiáng)的睡蓮種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2021年在石河子大學(xué)進(jìn)行，地理坐標(biāo)86°3′9″E，44°17′49″N附近，海拔430 m。試驗(yàn)區(qū)年平均氣溫7～8 ℃，年日照2 300～2 700 h，年降水量180～270 mm。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)共選用4種耐寒睡蓮、4種熱帶睡蓮，其中雪白睡蓮為分布在我國(guó)新疆的原生種(表1)。8種睡蓮于2021年4月采用溫室內(nèi)自然光照的盆栽方式培養(yǎng)，盆深50 cm，口徑45 cm，正常水肥管理，當(dāng)植株長(zhǎng)至9～11張葉片時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，取樣進(jìn)行低溫處理。

表1 參試睡蓮材料基本信息

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)選取長(zhǎng)勢(shì)相同的浮水功能葉，取離體葉片，在10、5、0、-5 ℃低溫脅迫下分別處理4 h，以15 ℃為對(duì)照，共5個(gè)溫度梯度，每處理重復(fù)3次。處理后的試驗(yàn)材料分為2個(gè)部分，一份葉片剪碎后測(cè)定電導(dǎo)率(REC)和葉綠素(Chl)含量指標(biāo)，另一份液氮凍存后置于-80 ℃保存，測(cè)定葉片丙二醛(MDA)含量、酶活性、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量。

1.4 項(xiàng)目測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用電導(dǎo)儀法[13]；丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定分別采用氮藍(lán)四唑還原法、愈創(chuàng)木酚法和紫外吸收法[13]；可溶性糖、可溶性蛋白含量的測(cè)定分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[14]；葉綠素含量測(cè)定采用分光光度法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)隸屬函數(shù)法計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，抗寒性負(fù)相關(guān)的參數(shù)(REC、MDA含量)采用降型分布函數(shù)：U(Xijk)=(Xmax-Xijk)/(Xmax-Xmin)，與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)(葉綠素、SS、SP含量，SOD、POD、CAT酶活性)采用升型分布函數(shù)：U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)[15]。隸屬函數(shù)值乘以相應(yīng)的權(quán)重，累加求和得出綜合評(píng)價(jià)值。運(yùn)用 SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)睡蓮細(xì)胞膜透性的影響

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片REC均呈上升趨勢(shì)。在對(duì)照處理15 ℃下，8種睡蓮葉片REC均保持在20%～30%。在-5 ℃低溫脅迫時(shí)，8種睡蓮葉片REC達(dá)到最大值，其中九品香睡蓮葉片REC最大，為84%，雪白睡蓮葉片REC最小，為67%。其中雪白睡蓮葉片的REC在-5 ℃低溫脅迫下均小于其他7種睡蓮葉片。8種睡蓮葉片REC達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為蒂娜(225.0%)>伊麗莎白(221.7%)>雪白睡蓮(204.5%)>伊斯蘭達(dá)(200.0%)>科羅拉多(196.0%)>九品香(189.7%)>墨西哥黃(180.8%)>黑美人(158.1%)(圖1-A)。

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片MDA含量均呈上升趨勢(shì)。在對(duì)照15 ℃處理下，8種睡蓮葉片MDA含量保持在0.03～0.05 μmol/g FW。在 -5 ℃ 低溫脅迫時(shí)，8種睡蓮葉片MDA含量達(dá)到最大值，蒂娜睡蓮葉片MDA含量最大，為 0.24 μmol/g FW，雪白睡蓮葉片最小，為 0.14 μmol/g FW。其中雪白睡蓮葉片的MDA含量在低溫脅迫下均小于其他7種睡蓮。8種睡蓮葉片MDA含量達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為蒂娜(500.0%)>伊斯蘭達(dá)(475.0%)>伊麗莎白(466.7%)>黑美人(375.0%)>雪白睡蓮(366.7%)>九品香(360.0%)>科羅拉多、墨西哥黃(300.0%)(圖1-B)。

2.2 低溫脅迫對(duì)睡蓮抗氧化酶活性的影響

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片SOD酶活性均呈先升后降趨勢(shì)。九品香睡蓮葉片在5 ℃低溫脅迫時(shí)SOD活性最大，其余睡蓮在10 ℃低溫脅迫時(shí)SOD活性最大。8種睡蓮葉片SOD酶活性最大值均不同，雪白睡蓮葉片SOD酶活性最大值最大，為673.46 U/g FW，九品香睡蓮葉片SOD酶活性最大值最小，為454.99 U/g FW。8種睡蓮葉片SOD酶活性在達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮(33.6%)>九品香(19.3%)>蒂娜(18.7%)>墨西哥黃(18.7%)>黑美人(13.7%)>伊麗莎白(13.0%)>伊斯蘭達(dá)(11.8%)>科羅拉多(11.7%)(圖2-A)。

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片POD酶活性均呈先升后降趨勢(shì)。在10 ℃低溫脅迫時(shí)，伊麗莎白、科羅拉多、伊斯蘭達(dá)、九品香、墨西哥黃、雪白睡蓮葉片POD酶活性達(dá)最大，黑美人、蒂娜睡蓮葉片在5 ℃低溫脅迫時(shí)酶活性最大。8種睡蓮葉片POD酶活性最大值均不同，伊麗莎白睡蓮葉片POD酶活性最大值最大，為329.49 U/(g FW·min)，九品香睡蓮葉片POD酶活性最大值最小，為 152.05 U/(g FW·min)。8種睡蓮葉片POD酶活性在達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮(56.7%)>蒂娜(53.9%)>伊麗莎白(36.1%)>科羅拉多(25.4%)>伊斯蘭達(dá)(23.0%)>墨西哥黃(21.9%)>黑美人(21.3%)>九品香(18.8%)(圖2-B)。

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片CAT酶活性均呈先升后降趨勢(shì)。伊斯蘭達(dá)、九品香睡蓮葉片在10 ℃低溫脅迫時(shí)CAT酶活性最大，其余睡蓮葉片在5 ℃低溫脅迫時(shí)酶活性最大。8種睡蓮葉片CAT酶活性最大值均不同，雪白睡蓮葉片CAT酶活性最大值最大，為3 532.54 μmol/g FW，蒂娜睡蓮葉片CAT酶活性最大值最小，為2 471.91 μmol/g FW。8種睡蓮葉片CAT酶活性在達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮(51.8%)>黑美人(40.4%)>伊斯蘭達(dá)(38.0%)>科羅拉多(34.7%)>伊麗莎白(28.7%)>九品香(23.0%)>墨西哥黃(19.0%)>蒂娜(3.8%)(圖2-C)。

2.3 低溫脅迫對(duì)睡蓮可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片SS含量均呈先升后降趨勢(shì)?？屏_拉多、九品香、雪白睡蓮葉片在5 ℃低溫脅迫時(shí)SS含量最高，其余睡蓮葉片在10 ℃低溫脅迫時(shí)SS含量最高。8種睡蓮葉片SS含量最大值均不同，伊斯蘭達(dá)睡蓮葉片SS含量最大值最大，為36.68 mg/g FW，雪白睡蓮葉片SS含量最大值最小，為13.40 mg/g FW。8種睡蓮葉片SS含量達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為伊斯蘭達(dá)(207.7%)>雪白睡蓮(114.7%)>黑美人(113.5%)>墨西哥黃(99.3%)>科羅拉多(68.1%)>蒂娜(53.7%)>九品香(45.2%)>伊麗莎白(38.6%)(圖3-A)。

隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片SP含量均呈先升后降趨勢(shì)。伊斯蘭達(dá)睡蓮葉片在5 ℃低溫脅迫時(shí)SP含量最高，其余睡蓮葉片在10 ℃低溫脅迫時(shí)SP含量最高。8種睡蓮葉片SP含量最大值均不同，九品香睡蓮葉片SP含量最大值最大，為 9.59 mg/g FW，伊斯蘭達(dá)睡蓮葉片SP含量最小，為7.4 mg/g FW。8種睡蓮葉片SP含量在達(dá)到最大值時(shí)相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮(212.4%)>九品香(209.4%)>蒂娜(200.0%)>墨西哥黃(151.9%)>黑美人(95.5%)>伊斯蘭達(dá)(76.6%)>科羅拉多(50.9%)>伊麗莎白(38.1%)(圖3-B)。

2.4 低溫脅迫對(duì)葉綠素總含量的影響

由圖4可知，隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片的Chl含量逐漸下降，其下降的速率隨著溫度的降低而減小。在15 ℃下，除科羅拉多睡蓮，其他7種睡蓮葉片Chl含量均保持在1.5 mg/g FW左右。在-5 ℃低溫脅迫時(shí)Chl含量達(dá)到最小值，其中科羅拉多睡蓮葉片Chl含量最大值最大，為2.4 mg/g FW，伊斯蘭達(dá)睡蓮葉片Chl含量最大值最小，為 1.33 mg/g FW。科羅拉多睡蓮葉片的Chl含量在低溫脅迫下均高于其他7種睡蓮葉片。8種睡蓮葉片Chl含量達(dá)到最低值時(shí)相比對(duì)照降幅為黑美人(66.5%)>伊麗莎白(64.6%)>蒂娜(58.3%)>墨西哥黃(56.5%)>科羅拉多(50.0%)>伊斯蘭達(dá)(49.6%)>九品香(40.0%)>雪白睡蓮(37.5%)。

2.5 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

2.5.1 抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系的建立 抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系中，提取累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到80%以上的主成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[16]。由表2可知，前3個(gè)指標(biāo)貢獻(xiàn)率分別為36.277%、26.689%、17.365%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為80.331%。以前3個(gè)主成分分析各指標(biāo)的權(quán)重，由表3可知，睡蓮葉片中抗寒性相關(guān)性最大的指標(biāo)是CAT活性、Chl含量，其次是SP、SS含量。

表2 8種睡蓮材料抗寒性指標(biāo)的特征根和貢獻(xiàn)率

表3 8種睡蓮材料抗寒性指標(biāo)的權(quán)重

2.5.2 各指標(biāo)隸屬度值及抗寒性綜合指數(shù) 抗寒性綜合指數(shù)是各指標(biāo)隸屬度與各指標(biāo)權(quán)重的乘積，綜合指數(shù)的大小反映綜合抗寒性能力的差異[17]，綜合指數(shù)值越大，表明睡蓮抗寒性越強(qiáng)。從表4可知，在8種睡蓮中，科羅拉多的抗寒能力最強(qiáng)，蒂娜抗寒能力最差，抗寒能力強(qiáng)弱依次為科羅拉多(0.64)>雪白睡蓮(0.54)>伊麗莎白(0.52)>墨西哥黃、伊斯蘭達(dá)、黑美人(0.48)>九品香(0.47)>蒂娜(0.43)。

表4 8種睡蓮材料各指標(biāo)隸屬度值及抗寒性綜合指數(shù)

3 討論與結(jié)論

REC和MDA含量的變化反映細(xì)胞膜的損傷程度[18-19]，可作為植物抗寒性鑒定的指標(biāo)。本試驗(yàn)中隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片的REC與MDA含量均呈上升趨勢(shì)。這與張艷俠等在5個(gè)石榴品種的抗寒性評(píng)價(jià)中REC與MDA含量變化趨勢(shì)[20]相同。反映出在低溫脅迫下，睡蓮細(xì)胞膜受到損傷，透性增大而引起了REC的變化。其中，蒂娜睡蓮葉片REC增幅最大，黑美人睡蓮葉片的REC增幅最小。同時(shí)，植物脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA大量積累，其濃度越高對(duì)植物細(xì)胞的損害越大。其中，蒂娜睡蓮葉片MDA含量增幅最大，墨西哥黃睡蓮葉片的MDA含量增幅最小。本試驗(yàn)中，蒂娜睡蓮葉片REC和MDA含量變化幅度均為最大，表明其細(xì)胞膜的損傷程度為最大，在一定程度上反映了其抗寒能力較弱。雪白睡蓮的REC與MDA含量在低溫脅迫下均保持最小值，也可反映其抗寒能力較強(qiáng)。

SOD、POD和CAT酶是植物重要的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)的保護(hù)酶[21-24]。本試驗(yàn)中SOD、POD和CAT酶活性呈先升后降趨勢(shì)，表明低溫脅迫破壞了植物正常的氧化代謝，活性氧產(chǎn)生過(guò)快導(dǎo)致積累，抗氧化酶活性因而增強(qiáng)；但隨著溫度的進(jìn)一步降低，SOD、POD和CAT酶活性均有下降，推測(cè)可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到了破壞，保護(hù)酶系統(tǒng)清除活性氧的能力降低。這與陳明輝等研究低溫處理下果樹(shù)的抗氧化酶活性變化趨勢(shì)[25]一致。本研究中，科羅拉多、九品香和蒂娜的睡蓮葉片分別在SOD、POD和CAT酶活性的測(cè)定中增幅最小，雪白睡蓮葉片SOD、POD和CAT酶活性增幅均為最大，表明其在低溫脅迫下細(xì)胞抗氧化能力最強(qiáng)，推測(cè)雪白睡蓮對(duì)低溫變化的適應(yīng)性較強(qiáng)。

SS、SP是重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[26-27]。本試驗(yàn)中8種睡蓮葉片SS和SP含量呈先升后降趨勢(shì)。在低溫脅迫初期，睡蓮葉片SS和SP含量升高，調(diào)節(jié)了其細(xì)胞滲透壓，增強(qiáng)了其抗寒能力，但隨著溫度的進(jìn)一步降低，細(xì)胞膜被破壞，有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外滲，SS和SP含量下降。這與劉杜玲等對(duì)早實(shí)核桃的研究結(jié)果[28]一致。本試驗(yàn)中，伊斯蘭達(dá)睡蓮和雪白睡蓮葉片在SS、SP含量中分別增幅最大，伊麗莎白睡蓮葉片SS和SP含量增幅均最小。伊麗莎白為耐寒性睡蓮，其SS、SP含量增幅卻遠(yuǎn)小于熱帶的伊斯蘭達(dá)睡蓮SS含量增幅，推測(cè)原因是伊麗莎白葉片本身SS含量較高，受到低溫脅迫后，細(xì)胞組織中SS含量小幅度提高即可降低膜內(nèi)細(xì)胞受低溫的傷害。

葉綠素是反映低溫脅迫下植物光合作用能力的重要指標(biāo)[29]。本試驗(yàn)中，隨脅迫溫度的降低，8種睡蓮葉片的Chl含量逐漸下降，并且逐漸趨于平緩，推測(cè)低溫加速了葉綠素的分解，導(dǎo)致睡蓮葉片內(nèi)Chl含量減少。其中黑美人睡蓮葉片Chl含量下降幅度最大，雪白睡蓮葉片Chl含量下降幅度最小，在一定程度上表明雪白睡蓮的抗寒性較強(qiáng)，黑美人睡蓮的抗寒性較弱。而科羅拉多睡蓮葉片Chl含量在試驗(yàn)中均保持最大值，可反映其抗寒能力最強(qiáng)。

植物在逆境脅迫過(guò)程中，多種因素影響其生理指標(biāo)的變化[30-31]，因此不能用單個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)睡蓮植物的抗逆性。本研究結(jié)果中CAT活性、Chl、SP、SS含量可作為評(píng)價(jià)睡蓮抗寒性的主要指標(biāo)。這與姜麗娜等研究的小麥抗寒性主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]不完全一致，表明抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重在不同物種中存在差異。

植物抗寒能力的研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值[32]。本研究通過(guò)對(duì)8種睡蓮葉片的相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行分析，采用隸屬函數(shù)法對(duì)其抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，抗寒能力為科羅拉多>雪白睡蓮>伊麗莎白>墨西哥黃、伊斯蘭達(dá)、黑美人>九品香>蒂娜。本研究結(jié)果可為睡蓮抗寒性選育推廣和栽培養(yǎng)護(hù)提供科學(xué)方法和相關(guān)理論依據(jù)。