高松城 王立雅 王惠潔 余秋鋒 黃智勇

隨著體外受精(in vitro fertilization,IVF)技術(shù)的不斷改進(jìn),人們正在尋找改進(jìn)實(shí)驗(yàn)的方法,以此產(chǎn)生更高質(zhì)量的胚胎和更高的臨床妊娠率［1］。然而,仍然有一些IVF 周期中卵子未完全發(fā)育,約為10%～20%［2,3］。為了避免IVF 失敗,越來越多的生殖中心采用短時(shí)受精方案,以盡早確認(rèn)卵子的受精狀態(tài),并提供補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)的可能性［4,5］。常規(guī)的長(zhǎng)時(shí)IVF 胚胎移植是在培養(yǎng)基中加入精子和卵子,培養(yǎng)過夜(16～18 h),受精后繼續(xù)培養(yǎng)。然而,研究表明,哺乳動(dòng)物在遇到配偶后20 min 發(fā)生受精,精子可以在平均15 min 內(nèi)進(jìn)入人類的卵子細(xì)胞［6］。80%的卵子在大約1 h 內(nèi)通過與精子接觸而發(fā)生改變。此外,顆粒細(xì)胞和精細(xì)胞代謝產(chǎn)生的活性氧化物引起不飽和脂肪酸的過氧化影響細(xì)胞膜流動(dòng)性,強(qiáng)化細(xì)胞質(zhì)膜,有助于胚胎的分裂、發(fā)育和促進(jìn)發(fā)育；相關(guān)研究表明,短時(shí)IVF和早期補(bǔ)救ICSI 可以防止由于IVF 完全不受精而導(dǎo)致的周期中斷,并產(chǎn)生更好的臨床結(jié)局［7］。然而,短期精卵共培養(yǎng)和早期受精是否會(huì)改變IVF 周期中卵子的正常受精能力、胚胎發(fā)育潛力和臨床結(jié)局仍存在爭(zhēng)議。因此本研究對(duì)長(zhǎng)時(shí)和短時(shí)受精患者進(jìn)行回顧性分析,分析其對(duì)胚胎參數(shù)及妊娠結(jié)局的影響,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析本院2020 年6 月～2022 年5 月725 例進(jìn)行IVF 的不孕患者的臨床資料,根據(jù)IVF方式分為短時(shí)組(347 例)和常規(guī)組(378 例)。兩組一般資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較()

表1 兩組一般資料比較()

注：兩組比較,P＞0.05；HCG：人絨毛膜促性腺激素

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方符合IVF指征且為第一助孕周期；②患者均為原發(fā)性不孕；③男方精液常規(guī)檢查符合IVF 標(biāo)準(zhǔn)；④臨床資料完整；⑤均為長(zhǎng)效長(zhǎng)方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≥40 歲；②合并有其他重大疾病者；③女方基礎(chǔ)內(nèi)分泌異常；所有研究對(duì)象均簽署知情同意書,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 控制性促超排卵 所有患者均接受長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素(GnRHa)降調(diào),達(dá)到下調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后給予促性腺激素(Gn)并利用陰道B 超及激素測(cè)定監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況,當(dāng)卵泡達(dá)到收針標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行HCG 注射促進(jìn)卵子成熟,32～34 h 后B 超下經(jīng)陰道穿刺采集卵細(xì)胞。

1.3.2 精液處理 根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn),通過標(biāo)準(zhǔn)精液分析和巴氏染色對(duì)精子進(jìn)行嚴(yán)格的形態(tài)學(xué)檢查。取卵當(dāng)天男子手淫取精,并將所有精子收集在無菌、無毒的容器中。收集的精液在37℃下液化并通過密度梯度離心洗滌及上游處理,將用于添加精子的濃度調(diào)整為5×106/ml,并置于37°C、6% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,然后用于加精。

1.3.3 受精方案 常規(guī)組采用常規(guī)長(zhǎng)時(shí)受精,取卵日14:30,將足夠的上游精子添加到含有卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體 (COCs) 的3037 個(gè)培養(yǎng)皿中,每個(gè)卵子的平均精子數(shù)為(1～1.5)×106/ml,每箱3037 皿COCs 數(shù)≤8 個(gè)。短時(shí)組采用短時(shí)受精,加精時(shí)間為取卵日11:30,受精卵孵育4～6 h 后,將卵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)3037 培養(yǎng)皿,此時(shí),卵周圍僅剩少量卵丘細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較兩組胚胎參數(shù)及妊娠結(jié)局,主要包括平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、多原核受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、平均移植胚胎數(shù)、冷凍周期率、平均冷凍胚胎數(shù)、種植率、臨床妊娠率。優(yōu)質(zhì)胚胎：孵育第3 天的胚胎應(yīng)為卵裂球大小均勻或輕度不均勻,細(xì)胞數(shù)為7～9 細(xì)胞,優(yōu)質(zhì)胚胎級(jí)別為1～2 級(jí),胚胎碎片率＜20%。臨床妊娠：移植后1 個(gè)月時(shí)通過超聲觀察存在妊娠囊。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

短時(shí)組的優(yōu)質(zhì)胚胎率高于常規(guī)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；短時(shí)組平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、多原核受精率、卵裂率、平均移植胚胎數(shù)、冷凍周期率、平均冷凍胚胎數(shù)、種植率、臨床妊娠率與常規(guī)組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組胚胎參數(shù)及妊娠結(jié)局比較(,%)

表2 兩組胚胎參數(shù)及妊娠結(jié)局比較(,%)

注：與常規(guī)組比較,aP＜0.05

3 討論

據(jù)報(bào)道,短期受精(精子和卵母細(xì)胞共培養(yǎng)1～4 h)可提高胚胎質(zhì)量和妊娠率［8］。短時(shí)受精可以在6 h 后觀察第二極體的發(fā)射來確定受精狀態(tài),及時(shí)對(duì)未排出第二極體的卵子實(shí)施補(bǔ)救ICSI 是預(yù)防受精失敗的有效方法［9］。因此,許多生殖中心正在逐步引入短時(shí)受精［10］。短時(shí)受精結(jié)合補(bǔ)救ICSI 可以有效減少大多數(shù)胚胎不受精造成的周期失敗,其效果已經(jīng)被臨床認(rèn)可［11］。然而,短期受精是否會(huì)影響卵子正常受精周期的受精潛力、胚胎的發(fā)育潛力以及妊娠的臨床結(jié)局仍存在疑問,本研究調(diào)查了短時(shí)和長(zhǎng)時(shí)受精對(duì)IVF 和臨床妊娠結(jié)局的影響。

本研究中,對(duì)常規(guī)組采用常規(guī)長(zhǎng)時(shí)受精,對(duì)短時(shí)組采用短時(shí)受精,結(jié)果顯示,短時(shí)組的優(yōu)質(zhì)胚胎率48.87%高于常規(guī)組的37.29%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組平均獲卵數(shù)、受精率、正常受精率、多原核受精率、卵裂率、平均移植胚胎數(shù)、冷凍周期率、平均冷凍胚胎數(shù)、種植率、臨床妊娠率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。短時(shí)受精不影響常規(guī)受精率是因?yàn)槁亚鸺?xì)胞中的某些成分不僅可以促進(jìn)精子獲能和頂體反應(yīng),還會(huì)降低多精受精比例,例如,卵丘細(xì)胞團(tuán)含有大量的透明質(zhì)酸,會(huì)降低多精受精的發(fā)生率［12］。在短時(shí)受精過程中早期去除卵細(xì)胞會(huì)使卵母細(xì)胞與周圍的卵巢細(xì)胞及其分泌因子分離,將微環(huán)境與卵細(xì)胞分離,并增加多精受精的可能性［13］。此外,卵子細(xì)胞的去除是一個(gè)機(jī)械過程,機(jī)械刺激可能會(huì)損害卵母細(xì)胞,尤其是透明帶,例如卵母細(xì)胞。雖然短期受精增加了多精受精率,但不影響整體正常受精率。多原核受精是一種異常受精現(xiàn)象,體外受精造成的多核受精的胚胎一般是多倍體,不能用于移植,導(dǎo)致胚胎和卵子資源大量流失［14］。許多因素是多核受精的起源,主要與女性的卵母細(xì)胞成熟度和男性的精子質(zhì)量有關(guān)［15］。研究表明,短期受精可以降低多核受精率［16］。本研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)組多原核受精率略低于常規(guī)組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說明短時(shí)受精并不能有效降低多原核受精率。

綜上所述,不孕患者在IVF 過程中短時(shí)受精的優(yōu)質(zhì)胚胎率由于縮短精卵孵育時(shí)間,在一定程度上能提高胚胎質(zhì)量,短時(shí)受精可以在不影響正常受精率的前提下為臨床提供更多的優(yōu)質(zhì)胚胎,可在臨床推廣使用。