邢瀟月，胡亞輝 ，張家浩，阿迪萊·卡哈曼，李蓮瑞★

（1. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室 843300）

糞腸球菌屬于鏈球菌科、腸球菌屬，是人類和動(dòng)物腸道中的正常菌群。它廣泛存在于自然界中，能夠在糞便中檢出，可以和其他胃腸道益生菌和諧共處[1]，并能夠產(chǎn)生L型乳酸和細(xì)菌素，抑制腸道微生物生長，具有維護(hù)動(dòng)物和人腸道健康等作用。

但有時(shí)糞腸球菌又是機(jī)會(huì)致病菌，當(dāng)宿主身體出現(xiàn)抵抗力下降，腸道內(nèi)微生物失衡，就能引起動(dòng)物疾病。糞腸球菌常引發(fā)人和動(dòng)物的泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、菌血癥等疾病[2]，據(jù)調(diào)查，近年來糞腸球菌引起動(dòng)物和人類疾病的例子逐漸增多，在羊養(yǎng)殖業(yè)中危害也較大，對(duì)羔羊的致死率達(dá)到20%[3]。糞腸球菌由于細(xì)胞壁堅(jiān)厚，具有天然的耐藥性，給藥物治療帶來一定困難。故對(duì)新疆南疆部分地區(qū)羊養(yǎng)殖場(chǎng)糞腸球菌的耐藥基因及毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，為新疆南疆部分規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)防控糞腸球菌提供一定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)參考?xì)W都·吾吐那生、齊亞銀、卜三平等[4]的糞腸球菌快速鑒定方法，篩選糞腸球菌，并用普通PCR方法檢測(cè)糞腸球菌是否攜帶耐藥基因及糞腸球菌。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料

在新疆巴音郭楞蒙古自治州、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)的部分規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)采集病羊、死羊的肺臟、肝臟、淋巴結(jié)、膽囊等組織，將采集組織放入-20℃保存。

1.1.2 生化鑒定試劑

精氨酸雙水解酶、產(chǎn)酸松三糖、產(chǎn)酸蔗糖、產(chǎn)酸棉籽糖、產(chǎn)酸甘露醇。

1.1.3 培養(yǎng)基

KF鏈球菌培養(yǎng)基，腸球菌培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑

基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技北京有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)

將采集的病料切成1cm3大小的方塊，放入2mL離心管，并加入1顆鋼珠，放入研磨機(jī)中研磨3min；吸取10μL研磨好的漿液均勻滴在KF鏈球菌培養(yǎng)基上。37℃在電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)±48h，挑出暗紅色至粉色菌落轉(zhuǎn)入腸球菌肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)±24h進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

2.2 分離株的生化特性鑒定

將上一步獲得的可疑菌純培養(yǎng)物接種在精氨酸雙水解酶、產(chǎn)酸松三糖、產(chǎn)酸蔗糖、產(chǎn)酸棉籽糖、產(chǎn)酸甘露醇中[6]，37℃培養(yǎng)24h，根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象能分辨鏈球菌和腸球菌。

2.3 tuf特異性基因擴(kuò)增鑒定

嚴(yán)格按照北京天根生化科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，將提取的DNA于-20℃保存。

根據(jù)腸球菌的tuf[7]基因設(shè)計(jì)特異性引物（引物序列由上海生物工程有限公司合成）。PF：TACTGACAAACCATTCATGATG，PR：AACTTCGTCACCAACGCGAAC，預(yù)計(jì)擴(kuò)增判斷大小為112 bp。特異性片段的擴(kuò)增的條件：運(yùn)用提取的DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 反應(yīng)體系如下：DNA 模板1μL，PF（10μmol/L）0.5μL，PR（10μmol/L）0.5μL，PremixT a12.5μL，超純水 10.5μL，總體系為25μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃，3min；變性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸，72℃，30s；循環(huán)數(shù)為30[8]，再延伸，72℃，10min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶。

2.4 耐藥基因引物的合成及檢測(cè)

以2.3.1 提取的 DNA 為模板，參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)引物，用PCR方法對(duì)糞腸球菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，引物序列由上海生工合成。耐藥基因PCR反應(yīng)條件[11]：tetM：95℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s；72℃,10min,30個(gè)循環(huán)。ermB：94℃，5min；94℃，30s；48℃，30s；72℃，45s；72℃，10min，30個(gè)循環(huán)。TEM：95℃，5min；94℃，30s；51℃，30s；72℃，45s；72℃,10min,30個(gè)循環(huán)。

表1 耐藥基因引物序列

2.5 毒力基因引物的合成及檢測(cè)

以2.3.1 提取的 DNA 為模板，參考文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)引物，用PCR方法對(duì)糞腸球菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，引物序列由上海生工合成。

毒力基因 引物序列ylA F:ACTCGGGGA（5'-3'） 預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大?。╞p）C R:GCTGCT F:ACAGAAGATTGATAGGC AAGCTGCGCTT 688 hyl GCTGCAGGAAATG R:CACTGACGTCCAAGTTTCCAA 276 alas F:GCACGCTATTACGAACTATGA R:TAAGAAAGAACATCACCACGA 375

毒力基因PCR反應(yīng)條件：CylA：94℃，5min；94℃,30s；54℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32個(gè)循環(huán)。Hyl：94℃，5min；94℃，30s；54℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32個(gè)循環(huán)。alas：94℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s；72℃，10min；32個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

糞腸球菌為革蘭陽性球菌，呈球形或橢圓形，成對(duì)或鏈狀排列，結(jié)果見圖1。

圖1 革蘭染色鏡檢圖（10×100）

3.2 生化鑒定結(jié)果

選取5株疑似菌進(jìn)行生化鑒定，除產(chǎn)酸棉籽糖為陰性，產(chǎn)酸松三糖為弱陽性，其他均為陽性，結(jié)果見表2。

表2 生化鑒定結(jié)果

3.3 鑒定結(jié)果

3.3.1 tuf基因鑒定結(jié)果

結(jié)果見圖2，可見目的基因大小為112bp，與預(yù)期大小相符。

圖2 tuf基因PCR特異性檢測(cè)

3.4 糞腸球菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)糞腸球菌進(jìn)行3種耐藥基因擴(kuò)增，其中大環(huán)內(nèi)酯類ermB耐藥基因被檢出。如圖3。

圖3 ermB基因PCR產(chǎn)物電泳圖

根據(jù)結(jié)果顯示，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB基因有51株，檢出率為47.2%。

3.5 糞腸球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)糞腸球菌進(jìn)行3種耐藥基因擴(kuò)增，其中alas耐藥基因被檢出。如圖4。

圖4 alas毒力基因PCR產(chǎn)物電泳圖

根據(jù)結(jié)果顯示，攜帶alas毒力基因的糞腸球菌有31株，檢出率為28.7%。

4 分析與討論

近年來，糞腸球菌作為機(jī)會(huì)致病菌對(duì)畜牧業(yè)的危害逐漸增大，原因是多方面的，首先，細(xì)胞壁堅(jiān)厚等自身因素，使其具有天然的耐藥性；其次，抗生素的廣泛使用，也增強(qiáng)了糞腸球菌的耐藥性[12]。根據(jù)調(diào)查，新疆南疆地區(qū)對(duì)羊源性糞腸球菌不夠重視，導(dǎo)致發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重危害羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，且新疆地區(qū)晝夜溫差大，飼養(yǎng)環(huán)境難控制，容易導(dǎo)致羊群抵抗力下降，給糞腸球菌可乘之機(jī)，侵入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，從而引起感染。本實(shí)驗(yàn)探究新疆南疆地區(qū)糞腸球菌的毒力基因以及耐藥基因，為南疆地區(qū)治療糞腸球菌感染疾病提供一定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采集新疆南疆地區(qū)部分規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)份病料進(jìn)行分離鑒定，生化鑒定、并進(jìn)行細(xì)菌的特異性tuf基因鑒定，共分離出108株糞腸球菌。對(duì)糞腸球菌進(jìn)行4種耐藥基因以及4種毒力基因的檢測(cè)，其中四環(huán)素類tetM耐藥基因以及大環(huán)內(nèi)酯類ermB耐藥基因被檢出，毒力基因alas被檢出，結(jié)果表明，新疆南疆部分規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)正在受糞腸球菌的侵害，并且這些糞腸球菌攜帶耐藥基因與毒力基因。

5 結(jié)論

糞腸球菌在南疆部分規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)中存在，并存在耐藥基因和毒力基因。