王 珊，劉 瑤，劉柯欣，張書琪，林松毅,2,3，孫 娜,2,3,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）存在于除植物以外的所有真核細(xì)胞中[1]，被證明是一種交叉反應(yīng)過敏原[2]，在無脊椎動物家族中被認(rèn)為是泛變應(yīng)原[3]，在蝦等多個物種中被確定為主要過敏原[1]。它是一種高度保守蛋白，平均長度約為284 個氨基酸殘基，由兩個平行的α-螺旋組成，分子質(zhì)量約34～38 kDa[1]。TM是引起食物性過敏反應(yīng)的第三大常見原因[4]。據(jù)報道，80%以上的蝦類過敏反應(yīng)均由TM引起[5]，且小劑量TM就足以引發(fā)嚴(yán)重的全身性臨床過敏癥狀[6]。然而，引起過敏癥狀發(fā)生的并非整個蛋白質(zhì)分子，而是其包含的一些抗原表位[7]?，F(xiàn)階段已有兩種蝦類的TM過敏原表位被識別并證實為特異性IgE結(jié)合區(qū)域[8]，公布于過敏蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中[9]。南極磷蝦是一種生物資源量巨大且綠色、天然的優(yōu)質(zhì)蛋白來源[10]。但目前我國對于南極磷蝦蛋白的相關(guān)研究剛剛起步，對其開發(fā)利用尚不充分[11]。Motoyama等[12]通過血清學(xué)相關(guān)實驗證實了南極磷蝦TM是其主要致敏原，不過目前進(jìn)一步對其特異性IgE結(jié)合表位的識別及結(jié)合能力的相關(guān)研究還近乎空白。因此，有關(guān)南極磷蝦TM過敏原表位的深度挖掘?qū)τ谄渲旅粜韵嚓P(guān)研究尤為重要。

表位也被稱為過敏決定簇，是過敏原表面的特殊化學(xué)基團，可與抗體或抗原受體發(fā)生特異性結(jié)合[13]。表位通常由8～26 個氨基酸組成[13]，分為線性表位和構(gòu)象表位兩種。目前對于TM的致敏表位研究主要集中在線性表位上[14]。近年來，生物信息學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步，憑借其方便快捷、準(zhǔn)確性高、成本低等諸多優(yōu)點已逐步成為評估預(yù)測過敏原表位的有效手段[15]。Zheng Lina等[7]利用生物信息學(xué)技術(shù)成功預(yù)測出斑節(jié)對蝦TM的8 條線性過敏原表位。Fu Linglin等[16]也通過生物信息學(xué)工具預(yù)測識別了中國對蝦TM的12 條潛在過敏原表位。

本研究以南極磷蝦（Euphausia superba）為主要研究對象，通過除肌漿蛋白、丙酮除脂、蛋白粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多個步驟對其進(jìn)行提取純化；利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)對目的蛋白進(jìn)行相關(guān)鑒定；對南極磷蝦TM進(jìn)行熱穩(wěn)定性實驗、pH值穩(wěn)定性實驗和體外模擬胃腸消化實驗；根據(jù)歐洲分子生物學(xué)實驗室-歐洲生物信息研究所（European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI）分析比對不同甲殼動物TM的氨基酸序列同源性；同時結(jié)合5種常用的生物信息學(xué)分析工具對南極磷蝦TM模擬表位肽進(jìn)行預(yù)測，并利用SWISS-MODEL服務(wù)器對其空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模；最終通過PyMOL軟件將預(yù)測出的候選表位在其空間結(jié)構(gòu)上進(jìn)行一一映射。本研究旨在通過借助先進(jìn)的生物信息學(xué)技術(shù)對南極磷蝦TM模擬表位肽進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測識別，并對其空間結(jié)構(gòu)同源建模，為深入了解南極磷蝦TM過敏原，進(jìn)而對其開展后續(xù)的致敏性消減及相關(guān)低致敏性產(chǎn)品的開發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦 大連遼漁遠(yuǎn)洋食品有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、α-糜蛋白酶（1∶1 200 U，來源于牛胰腺） 北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶（1∶4 180 U，來源于豬胃黏膜） 美國Sigma公司；胰蛋白酶（1∶2 500 U，來源于豬胰腺） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑和藥品均購自天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

EASY-nLC 1000 UPLC系統(tǒng)、Q Exactive Plus MS儀美國賽默飛世爾科技公司；CR22N高速冷凍離心機、F-2700熒光分光光度計 日本Hitachi公司；PowerPac Basic垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像系統(tǒng) 以色列DNR公司；Infinite M200多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；J-1500圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦TM提取純化

參照Liang Yinlong等[17]方法并略有修改。所有提取純化步驟若無特殊說明均在4 ℃下進(jìn)行。取南極磷蝦肉按1∶10（g/mL）加入預(yù)冷20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），于組織搗碎機中搗碎。組織搗碎液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取沉淀按1∶10（g/mL）重新加入磷酸緩沖液，重復(fù)操作3 次。將最后得到的沉淀物按1∶2（g/mL）溶于50%預(yù)冷丙酮中，用恒速電動攪拌器攪拌4 h，組織液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，沉淀重新按1∶2（g/mL）溶于丙酮溶液中，重復(fù)操作2 次。將離心得到的沉淀取出，于室溫下自然風(fēng)干24 h制成丙酮粉。取丙酮粉按1∶10（g/mL）加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含1 mol/L KCl、10 mmol/Lβ-巰基乙醇），用恒速電動攪拌器攪拌抽提一夜，抽提液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，保留上清液。向上清液中加入1 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 4.5，靜置2 h后于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，保留沉淀。將沉淀溶于適量20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.6使沉淀完全復(fù)溶。向溶液中緩慢加入41%～60% (NH4)2SO4，邊加邊攪拌直至其完全溶解，靜置4 h后于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，保留沉淀。將沉淀重新復(fù)溶于適量20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中，于100 ℃沸水浴10 min，待其冷卻至室溫后于10 000 r/min離心10 min，上清液于真空冷凍干燥機中凍干，置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

參照BCA蛋白濃度測定試劑盒的使用說明書。依次向96 孔酶標(biāo)板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入20 μL質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再向96 孔酶標(biāo)板的樣品孔中依次加入20 μL被稀釋至不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 mg/mL），之后向各孔中加入200 μL BCA工作液。將酶標(biāo)板于37 ℃避光靜置15～30 min，利用酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品在562 nm波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取純化的南極磷蝦TM樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 SDS-PAGE實驗

制備12%分離膠和4%濃縮膠。將提取純化過程中各取樣點及最終得到的南極磷蝦TM樣品均稀釋至1 mg/mL，取適量樣品與蛋白上樣緩沖液（5×）按4∶1（V/V）混合均勻，于100 ℃沸水浴5 min。Marker上樣5 μL，其余各樣品均上樣10 μL。濃縮膠中80 V電泳30 min，分離膠中100 V電泳180 min，結(jié)束后取出凝膠，用R-250染色2 h，加脫色液洗脫至各電泳條帶清晰為止。最后利用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。

1.3.4 目的蛋白UPLC-MS/MS鑒定

1.3.4.1 膠內(nèi)酶解

將目的蛋白條帶切取下來，用50%乙腈溶液（含50 mmol/L碳酸氫銨）脫色，加100%乙腈孵育5 min脫水。加入10 mmol/L二硫蘇糖醇溶液于37 ℃孵育60 min，加100%乙腈脫水。之后加55 mmol/L碘代乙酰胺溶液于溫室下避光孵育45 min后用50 mmol/L碳酸氫銨溶液清洗，再用100%乙腈脫水。最后加入含10 ng/μL胰蛋白酶的50 mmol/L碳酸氫銨溶液于冰上孵育1 h，棄去其余溶液，膠塊于37 ℃下酶解過夜。依次用乙腈-甲酸（10∶1，V/V）溶液和100%乙腈提取酶解后的肽段，冷凍旋干備用。

1.3.4.2 UPLC-MS/MS分析

UPLC條件：ReproSil-Pur C18色譜柱（孔球形硅膠1.9 μm，孔徑120 ?樹脂填充）；流動相A：含0.1%甲酸和2%乙腈溶液；流動相B：含0.1%甲酸和90%乙腈溶液。梯度洗脫：0～22 min，94%～65% A、6%～35% B；22～26 min，65%～20% A、35%～80% B；26～30 min，20% A、80% B。流速550 nL/min。

MS條件：納噴電離源；離子源電壓2.1 kV；掃描范圍m/z350～1 800；分辨率70 000；MS/MS條件：分辨率17 500；自動增益控制5×104；信號閾值5×103ions/s；最大注入時間200 ms；動態(tài)排除時間20.0 s。

1.3.4.3 數(shù)據(jù)庫檢索

用Proteome Discoverer 2.4軟件對采集到的MS和MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫為Euphausia superba（UniProt，168 條肽段序列）。

1.3.5 南極磷蝦TM性質(zhì)測定

1.3.5.1 熱穩(wěn)定性測定

參照何欣蓉等[18]的方法并略有修改。稱取適量提取純化的南極磷蝦TM凍干樣品溶于去離子水中，稀釋至1 mg/mL。吸取等量TM溶液于多個2 mL離心管中，分別將其置于20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴加熱30 min。待各離心管冷卻至室溫，于4 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.5.2 pH值穩(wěn)定性測定

參照何欣蓉等[18]的方法并略有修改。稱取適量提取純化的南極磷蝦TM凍干樣品溶于去離子水中，稀釋至1 mg/mL。吸取等量TM溶液于多個2 mL離心管中，分別調(diào)節(jié)pH值至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，孵育1.5 h，而后將pH值調(diào)回7.0。吸取經(jīng)酸堿處理后的各樣品溶液進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.5.3 體外模擬胃腸消化穩(wěn)定性測定

參照Minekus等[19]的方法配制人工模擬胃液、腸液。參照Román-Carrasco等[20]的方法并適當(dāng)修改進(jìn)行體外模擬胃腸消化。模擬胃液消化反應(yīng)體系共10 mL，胃蛋白酶活力與純化的南極磷蝦TM比例為182 U/mg，體系中TM終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。整個消化過程均在37 ℃水浴條件下勻速振蕩進(jìn)行。分別在消化第0、0.5、2、5、10、30、60、90、120分鐘依次取樣0.5 mL，同時立即加入0.1 mol/L NaOH終止液調(diào)節(jié)至pH 7.0終止消化。取模擬胃液消化終點溶液5 mL，加入配制好的人工模擬腸液至整個反應(yīng)體系體積為10 mL，胰蛋白酶活力、糜蛋白酶活力與TM比例分別為34.5、0.44 U/mg，體系中TM終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。整個消化過程均在37 ℃水浴條件下勻速振蕩進(jìn)行。分別在消化第0、0.5、2、5、10、30、60、90、120分鐘依次取樣0.5 mL，隨即沸水浴5 min終止消化。所有樣品置于－20 ℃保存用于后續(xù)分析。

1.3.5.4 SDS-PAGE分析

對不同溫度、pH值、消化時間處理下的樣品穩(wěn)定性進(jìn)行SDS-PAGE分析，樣品質(zhì)量濃度均稀釋至0.5 mg/mL，上樣量10 μL，方法同1.3.3節(jié)。

1.3.5.5 熒光光譜分析

參考Li Ke等[21]的方法，稍作修改。通過熒光分光光度計測定不同溫度、pH值、消化時間處理下樣品的內(nèi)源性熒光光譜。用緩沖液將各樣品溶液稀釋至0.05 mg/mL。設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射光譜范圍為250～500 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10.0 nm，掃描速度為1 500 nm/min。

1.3.5.6 圓二色光譜分析

參考Lin Haixin等[22]的方法，稍作修改。應(yīng)用圓二色光譜儀檢測不同溫度、pH值、消化時間處理下樣品的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。用緩沖液將各樣品溶液稀釋至0.005 mg/mL。設(shè)置掃描速度100 nm/min，帶寬2 nm，響應(yīng)時間1 s，在190～260 nm波長范圍內(nèi)測定樣品的平均殘留橢圓率及相對含量。

1.3.6 南極磷蝦TM序列同源性分析

通過EMBL-EBI氨基酸序列數(shù)據(jù)庫對南極磷蝦TM與其他生物的TM序列同源性進(jìn)行分析。將南極磷蝦TM完整的氨基酸序列作為查詢條件，利用EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫中Clustal Omega對比工具及UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列檢索[23-24]，最終得到TM氨基酸序列同源性相關(guān)信息。

1.3.7 南極磷蝦TM模擬表位肽預(yù)測識別

1.3.7.1 南極磷蝦TM氨基酸序列獲取

通過美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）獲取南極磷蝦TM氨基酸序列信息。

1.3.7.2 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件DNAStar Protean[25]、ANTHEPROT[26]對南極磷蝦TM過敏原表位進(jìn)行預(yù)測。通過對南極磷蝦TM一級結(jié)構(gòu)的親水性、可塑性、抗原性、表面可及性和溶劑可及性等參數(shù)進(jìn)行分析，預(yù)測識別出南極磷蝦TM的線性模擬表位肽序列。

利用生物信息學(xué)在線工具BepiPred 1.0 server[27]、ABCpred server[25]和Immunomedicine Group[28]分別對南極磷蝦TM過敏原表位進(jìn)行預(yù)測：BepiPred 1.0 server通過結(jié)合隱馬爾可夫模型和親水性參數(shù)評分給出預(yù)測的線性表位序列[29]；ABCpred server基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析預(yù)測其線性表位[25]；Immunomedicine Group根據(jù)抗原傾向預(yù)測識別出南極磷蝦TM的模擬抗原決定簇。

對上述5種生物信息學(xué)工具分析預(yù)測出的南極磷蝦TM的線性模擬表位肽序列進(jìn)行整合，綜合分析不同工具預(yù)測出的結(jié)果。

1.3.8 南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)預(yù)測及模擬表位肽映射

利用SWISS-MODEL服務(wù)器[30]構(gòu)建南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)模型。登錄SWISS-MODEL在線服務(wù)器，上傳南極磷蝦TM氨基酸序列，選擇序列同源性最高的1c1g.2.A為模板自動建模，進(jìn)而獲得南極磷蝦TM的空間結(jié)構(gòu)模型。根據(jù)Structure Assessment模塊中的拉氏構(gòu)象圖分析預(yù)測結(jié)果的穩(wěn)定性。

利用PyMOL軟件[31]對預(yù)測出的南極磷蝦TM線性模擬表位肽在其空間結(jié)構(gòu)中進(jìn)行映射。將SWISS-MODEL服務(wù)器構(gòu)建的南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)模型以pdb格式導(dǎo)出，在PyMOL軟件中打開該文件，以不同的標(biāo)注顏色將各線性模擬表位肽一一映射到其空間結(jié)構(gòu)對應(yīng)的位置上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3 次，采用SPSS Statistics 19軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，通過TBtools軟件繪制同源性分析結(jié)果，并用Origin 2019軟件處理并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦TM的提取純化分析

如圖1所示，南極磷蝦肉經(jīng)磷酸緩沖液去除肌漿蛋白、丙酮溶液除脂、抽提液粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多步提取純化操作，不斷去除雜條帶。根據(jù)泳道6目的蛋白條帶與Marker條帶的比對發(fā)現(xiàn)，最終僅在32 kDa附近得到單一條帶。利用Image J軟件對其進(jìn)行灰度掃描分析，得到提取純化的蛋白純度達(dá)93.24%。研究表明，TM分子質(zhì)量約34～38 kDa[1]，等電點約4.5[32]，是一種對熱穩(wěn)定的蛋白[33]。因此，經(jīng)一系列提取純化后最終在32 kDa附近得到的蛋白條帶很可能是南極磷蝦TM。

該提取純化方法中最關(guān)鍵的幾個步驟分別是熱處理除雜、等電點沉淀和硫酸銨鹽析。首先，由于TM是一種熱穩(wěn)定蛋白[33]，因此高溫加熱并不會使其發(fā)生降解，而其他不耐高溫的蛋白則在此過程中被破壞，所以與泳道3相比泳道4的蛋白條帶明顯減少，部分條帶也有減輕（圖1）。其次，不同蛋白質(zhì)的等電點各不相同，TM在其等電點處的溶解度最小[34]，因而在pH 4.5附近大部分的TM聚集析出。最后，大多數(shù)研究表明，硫酸銨飽和度在40%～90%時可將TM沉淀析出[35]，故在此基礎(chǔ)上，本研究在41%～60%的硫酸銨飽和度下分離得到了大量鹽析蛋白沉淀。經(jīng)過以上幾個重要的提取純化步驟，最終得到了較為純凈的南極磷蝦TM。該方法方便、快捷地得到了高純度的南極磷蝦TM，省去了液相、柱層析等繁瑣的提取純化步驟，同時也避免了蛋白的進(jìn)一步損失，適合實驗室采用。

圖1 南極磷蝦TM提取純化SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of crude and purified TM from Antarctic krill

2.2 目的蛋白UPLC-MS/MS分析

如圖2所示，根據(jù)MS掃描結(jié)果初步確定目的蛋白的肽段數(shù)量及出峰位置，進(jìn)而對所得肽段進(jìn)行MS/MS掃描確定其氨基酸序列，共鑒定到89 條肽段，通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)該89 條肽段均屬于UniProt數(shù)據(jù)庫中收錄的A7VKE0蛋白（E. superba，TM），將鑒定到肽段的氨基酸數(shù)目與該蛋白總氨基酸數(shù)目相比得到其肽段覆蓋率達(dá)97%，從而確定提取純化得到的目的蛋白為南極磷蝦TM，登錄號為A7VKE0，蛋白分子質(zhì)量為32.6 kDa。

圖2 南極磷蝦TM的MS譜圖Fig. 2 Primary mass spectrum of TM from Antarctic krill

2.3 南極磷蝦TM性質(zhì)分析

2.3.1 南極磷蝦TM熱穩(wěn)定性分析

由圖3a可知，溫度由20 ℃逐漸升至100 ℃的過程中，TM條帶保持穩(wěn)定，均未發(fā)生降解，也無其他新的條帶生成。熒光光譜技術(shù)用于檢測蛋白內(nèi)源熒光，通過分析光譜峰位、強度等變化進(jìn)而推斷蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[36]。由圖3b可知，隨溫度的升高，南極磷蝦TM在295 nm波長處的熒光強度逐漸增強。溫度由20 ℃升至60 ℃的過程中，熒光強度變化幅度不大；值得注意的是當(dāng)溫度升至70 ℃時，熒光強度有較大程度提升；加熱至80 ℃時，熒光強度明顯增強，且直至上升至100 ℃時，熒光強度逐漸達(dá)到峰值，此間變化不再明顯。這說明隨著溫度的升高，南極磷蝦TM高級結(jié)構(gòu)逐漸伸展，溫度上升至70 ℃時，其內(nèi)部疏水區(qū)域暴露可能增多，加熱至80 ℃時，TM多肽鏈進(jìn)一步伸展，使得疏水基團暴露程度大幅提高，熒光強度明顯增強。圓二色光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成和變化[37]。由圖3c可知，南極磷蝦TM在190 nm波長附近有一正譜帶，在208 nm和222 nm波長附近有兩個負(fù)譜帶，且在溫度為20 ℃時其橢圓度絕對值最大；隨著加熱溫度的升高其橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋相對含量逐漸降低；然而，加熱溫度超過80 ℃的TM冷卻至室溫后其橢圓度絕對值又有一定幅度的增強。由圖3d可知，南極磷蝦TM主要由α-螺旋和少量無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)組成；加熱溫度由20 ℃逐漸升至60 ℃時，α-螺旋相對含量逐漸降低，無規(guī)卷曲含量總體呈升高趨勢，但變化幅度較緩；當(dāng)溫度升至70 ℃時，α-螺旋相對含量明顯下降至最低，此時β-折疊相對含量明顯增加；加熱至80 ℃時，其結(jié)構(gòu)組成與70 ℃時變化不大，無規(guī)卷曲相對含量最多，說明此溫度下TM二級結(jié)構(gòu)較為松散；值得注意的是加熱溫度自80 ℃后，α-螺旋相對含量略有回升，說明經(jīng)高溫加熱冷卻后，TM的α-螺旋結(jié)構(gòu)有一定恢復(fù)。

圖3 熱穩(wěn)定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結(jié)構(gòu)相對含量（d）Fig. 3 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing thermal stability of TM in Antarctic krill

2.3.2 南極磷蝦TM的pH值穩(wěn)定性分析

由圖4a可知，pH值由1.0逐漸升至13.0的過程中，TM條帶始終穩(wěn)定存在，在其下方均沒有生成其他小分子降解條帶。由圖4b可知，pH 5.0時，TM的熒光強度最強；pH值升至7.0時，熒光強度略有下降；隨著pH值向更酸/堿的方向變化，熒光強度逐漸降低，且堿性條件下熒光強度較酸性條件下更低。這些說明南極磷蝦TM在pH值接近其等電點（pH 4.5）時結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，經(jīng)酸/堿處理后可能導(dǎo)致發(fā)色基團暴露的微環(huán)境發(fā)生變化，TM結(jié)構(gòu)可能發(fā)生部分聚集或折疊，使部分氨基酸殘基被包埋，且pH值偏離等電點程度越大其結(jié)構(gòu)變化越嚴(yán)重，因此導(dǎo)致熒光強度的改變。由圖4c可知，pH 5.0時，TM在208 nm和222 nm波長處的橢圓度絕對值最大；經(jīng)酸/堿處理后，橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋逐漸減少，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。由圖4d可知，pH 5.0時，南極磷蝦TM的α-螺旋相對含量最高，且結(jié)構(gòu)僅由α-螺旋和少量無規(guī)卷曲組成；當(dāng)pH值向酸/堿方向變化時，α-螺旋相對含量逐漸降低，β-折疊和無規(guī)卷曲逐漸增多；pH 13.0時，還出現(xiàn)了少量β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。這些說明經(jīng)酸/堿處理后，TM構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而可能引起分子間靜電作用力降低或削弱氫鍵結(jié)合；極端堿性條件下，TM變性程度較嚴(yán)重，但從整體上看南極磷蝦TM依然保持以α-螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)。

圖4 pH值穩(wěn)定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結(jié)構(gòu)相對含量（d）Fig. 4 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing pH stability of TM in Antarctic krill

2.3.3 南極磷蝦TM的體外模擬胃腸消化穩(wěn)定性分析

圖5 模擬胃液消化穩(wěn)定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結(jié)構(gòu)相對含量（d）Fig. 5 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing simulated gastric digestion stability of TM in Antarctic krill

由圖5a可知，南極磷蝦TM在模擬胃液消化2 min開始出現(xiàn)降解，消化5 min時，出現(xiàn)較明顯的降解條帶；隨著消化反應(yīng)的進(jìn)行TM條帶逐漸變淺下移，隨之產(chǎn)生一系列小分子降解條帶，多集中于17～20 kDa之間；消化至120 min時，TM條帶仍未完全降解。由圖5b可知，隨著模擬胃液消化反應(yīng)的進(jìn)行，TM在295 nm波長處的熒光強度在消化0.5 min時出現(xiàn)上升而后逐漸降低，在355 nm處產(chǎn)生一新峰，且熒光發(fā)射波長出現(xiàn)紅移。說明在胃消化反應(yīng)初期，TM構(gòu)象可能發(fā)生伸展導(dǎo)致部分疏水區(qū)域暴露，隨著消化時間的延長，其結(jié)構(gòu)又重新且不斷折疊變化，在此過程中可能有新的芳香族氨基酸側(cè)鏈暴露出來。由圖5c可知，TM在190 nm波長附近的峰的橢圓度逐漸降低，且在208 nm和222 nm波長處的峰的橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋不斷減少。由圖5d可知，隨著模擬胃液消化，TM的α-螺旋相對含量整體呈下降趨勢，β-折疊相對含量整體呈增加趨勢，無規(guī)卷曲含量總體變化不大。這說明TM經(jīng)胃液消化后蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分折疊，但二級結(jié)構(gòu)總體組成變化不明顯。

由圖6a可知，南極磷蝦TM在隨即進(jìn)行的模擬胃-腸消化反應(yīng)中被進(jìn)一步降解，生成一系列分子質(zhì)量更小的降解條帶，主要集中在11～20 kDa之間；消化反應(yīng)進(jìn)行到60 min時，TM條帶開始變得模糊；消化至120 min時，TM幾乎被消化完全，條帶基本消失。由圖6b可知，在模擬胃-腸消化反應(yīng)初期，TM在295 nm波長處的熒光強度迅速大幅降低，隨后在295 nm和355 nm波長附近的熒光強度也不斷下降，且在355 nm波長處出現(xiàn)輕微紅移。表明TM在胰/糜蛋白酶作用下發(fā)生高度水解產(chǎn)生一系列小分子肽段，其結(jié)構(gòu)迅速發(fā)生改變，而后這些水解肽段可能在分子相互作用下又重新形成聚集體掩埋了部分熒光發(fā)色基團，從而導(dǎo)致熒光猝滅；同時，構(gòu)象改變又可能使部分新的芳香族氨基酸殘基暴露引起紅移。TM模擬胃-腸消化的圓二色光譜圖顯示出明顯改變，如圖6c所示：自消化0.5 min起，在208 nm和222 nm波長處的雙負(fù)峰帶消失，轉(zhuǎn)為在200 nm波長附近的單負(fù)峰帶，且譜線總體有藍(lán)移的趨勢。這說明經(jīng)模擬胃-腸消化后，南極磷蝦TM的α-螺旋結(jié)構(gòu)完全消失、β型結(jié)構(gòu)增加，且體系的親水性降低、疏水性增高。由圖6d可知，南極磷蝦TM剛進(jìn)入模擬胃-腸消化體系時，α-螺旋結(jié)構(gòu)就被完全破壞并消失，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多；β-折疊在整個消化過程中經(jīng)歷了減少-增加-減少等的動態(tài)變化，最終完全消失。這說明經(jīng)過模擬胃-腸消化，南極磷蝦TM的二級結(jié)構(gòu)有序性降低，消化過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化，最終僅由大量無規(guī)卷曲和部分β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成。

圖6 模擬胃-腸消化穩(wěn)定性測定中南極磷蝦TM的SDS-PAGE圖（a）、熒光光譜圖（b）、圓二色光譜圖（c）、二級結(jié)構(gòu)相對含量（d）Fig. 6 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d) showing the simulated gastrointestinal digestion stability of TM in Antarctic krill

圖7 TM氨基酸序列同源性分析Fig. 7 Homology analysis of amino acid sequence of TM

綜上，南極磷蝦TM在一定加熱溫度范圍內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性，但在超過80 ℃的極端高溫下，其疏水區(qū)域暴露，結(jié)構(gòu)改變，α-螺旋結(jié)構(gòu)易被破壞，然而冷卻至室溫后其天然構(gòu)象又部分恢復(fù)重新形成；其次，南極磷蝦TM對于pH值的變化較能維持穩(wěn)定，且對酸性條件具有較強耐受性，而極端酸/堿條件可能使其部分變性，結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集或折疊；此外，南極磷蝦TM對胃液消化具有較強的穩(wěn)定性，能被胃蛋白酶初步降解產(chǎn)生一系列小分子肽段，其二級結(jié)構(gòu)基本保持完整，而對進(jìn)一步的腸液消化穩(wěn)定性較差，最終被胰蛋白酶和糜蛋白酶完全降解，生成分子質(zhì)量更小的肽段，結(jié)構(gòu)變得松散無序。這些結(jié)果與何欣蓉等[18]對章魚TM理化性質(zhì)研究結(jié)論相似。這很可能與南極磷蝦TM的結(jié)構(gòu)及氨基酸組成有關(guān)；TM主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成[38]，α-螺旋結(jié)構(gòu)具有一定的剛性，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮穩(wěn)定性作用[39]，因此TM獨特的α-螺旋結(jié)構(gòu)極有可能是使其對熱和酸堿保持極強耐受性的原因；此外，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶作用的氨基酸不同[40]，所以消化結(jié)果的差異很可能與南極磷蝦TM的氨基酸序列組成有關(guān)。

2.4 南極磷蝦TM氨基酸序列同源性分析

對于系統(tǒng)給出的45種不同生物TM氨基酸序列，親緣關(guān)系越近的生物TM序列一致性越高。如圖7所示，南極磷蝦TM與太平洋磷蝦TM的序列同源性高達(dá)98.2%，與斑節(jié)對蝦、凡納對蝦等其他蝦的TM序列同源性多數(shù)在88%以上，而與鋸緣青蟹、腐食酪螨、水蚤等序列同源性稍低，分布在82%～88%之間。很多研究發(fā)現(xiàn)甲殼類動物TM具有高度保守的氨基酸序列，同源性在88%～100%，這種高度的序列同源性很可能正是甲殼類物種之間臨床交叉反應(yīng)發(fā)生頻率高的原因[23]。此外，甲殼類動物TM與蟑螂、塵螨也有很高的序列同源性，分別為80%～97%和78%～98%[23]。這也與本研究分析結(jié)果幾乎一致。

2.5 生物信息學(xué)預(yù)測南極磷蝦TM模擬表位肽

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得南極磷蝦TM（GenBank：BAF76430.1）氨基酸序列，該蛋白共由284 個氨基酸組成。

二級結(jié)構(gòu)、表面可及性、柔韌性、高親水性、易暴露區(qū)域等均是預(yù)測抗原表位的重要特征，它們?yōu)楸砦昏b定提供了強有力的證據(jù)[7]。DNAStar Protean和ANTHEPROT軟件主要以高親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)4 個特征作為預(yù)測依據(jù)給出候選過敏原表位。BepiPred 1.0 server、ABCpred server和Immunomedicine Group通過氨基酸的理化性質(zhì)，如二級結(jié)構(gòu)、親水性、可及性、柔韌性、暴露表面、抗原傾向等，分析預(yù)測出可能性高的過敏原表位。表1列出了各生物信息學(xué)工具預(yù)測出的過敏原表位區(qū)域。然而，每種軟件單獨使用時都會有一定的局限性[41]，因此，綜合分析5種生物信息學(xué)工具的預(yù)測結(jié)果，同一表位被識別的軟件越多，則其準(zhǔn)確性可能越高，將不少于3種工具共同預(yù)測出的過敏原表位確定為南極磷蝦TM候選模擬表位肽，如表2所示。共篩選得到8 條南極磷蝦TM線性模擬表位肽序列，分別為EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。

表1 各生物信息學(xué)工具預(yù)測的南極磷蝦TM模擬表位肽Table 1 Mimotope peptides of TM in Antarctic krill predicted by immunoinformatics tools

表2 南極磷蝦TM模擬表位肽最終預(yù)測結(jié)果Table 2 Definitive prediction results of mimotope peptides of TM in Antarctic krill

目前，一些甲殼類TM表位已被鑒定，如褐對蝦（Penaeus aztecus）[8]、凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）[42]、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[7]、中國對蝦（Penaeus chinensis）[16]等，具體表位信息如表3所示。對比發(fā)現(xiàn)，不同甲殼類TM間具有相似的表位序列，這很可能是它們彼此間具有高度過敏交叉反應(yīng)性的原因之一。本研究預(yù)測得到的南極磷蝦TM模擬表位肽與這些已經(jīng)驗證的甲殼類TM抗原表位相比顯示出了較高的重疊率，對于其中部分表位序列具有高覆蓋率，這說明本研究的預(yù)測結(jié)果可能具有較高的準(zhǔn)確性；但對于模擬表位肽中某些氨基酸的組成及序列長度等方面與這些已被鑒定出的抗原表位仍具有一定差異。

此外，通過生物信息學(xué)工具預(yù)測出的表位僅僅是理論層面，還需要后續(xù)傳統(tǒng)生物學(xué)方法結(jié)合免疫學(xué)實驗等對其進(jìn)行驗證才能得到更加準(zhǔn)確的過敏原表位。盡管如此，生物信息學(xué)技術(shù)還是憑借其快速、高效、精準(zhǔn)等諸多優(yōu)點為后續(xù)的蛋白致敏性相關(guān)研究提供了切實科學(xué)依據(jù)。

表3 不同甲殼類TM表位和南極磷蝦TM模擬表位肽的比較Table 3 Comparison of mimotope of TM in different crustaceans and those in Antarctic krill

2.6 南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)建模及模擬表位肽映射分析

如圖8所示，通過SWISS-MODEL服務(wù)器對南極磷蝦TM進(jìn)行同源建模，采用序列近似度達(dá)55.99%的1c1g.2.A為模板，最終預(yù)測得到由兩條肽鏈平行纏繞而成的α-螺旋構(gòu)型的南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)（圖8a）。通過服務(wù)器自帶的Structure Assessment模塊對建模得到的TM空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行評價，結(jié)果顯示高達(dá)98.05%骨架的φ角和ψ角分布于可靠區(qū)，僅有0.53%分布于異常區(qū)（圖8b）。因此，預(yù)測的南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)模型是穩(wěn)定可靠且具有高質(zhì)量。

圖8 南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 8 Spatial structure prediction of TM in Antarctic krill

南極磷蝦TM模擬表位肽映射結(jié)果如圖9所示。利用PyMOL軟件將生物信息學(xué)工具最終預(yù)測出的南極磷蝦TM的8 條模擬表位肽在其空間結(jié)構(gòu)對應(yīng)位置一一進(jìn)行映射，可以看出候選模擬表位肽均勻分布在整個蛋白質(zhì)中，且多位于α-螺旋內(nèi)。

圖9 南極磷蝦TM模擬表位肽映射Fig. 9 Mapping of mimotope peptides of TM in Antarctic krill

3 結(jié) 論

通過對南極磷蝦進(jìn)行除肌漿蛋白、丙酮除脂、抽提液粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多個步驟，最終提取純化出較為純凈的目的蛋白，SDSPAGE顯示其條帶位于32 kDa附近，灰度掃描分析其純度達(dá)93.24%。經(jīng)UPLC-MS/MS鑒定該目的蛋白確為南極磷蝦TM，蛋白分子質(zhì)量為32.6 kDa，肽段覆蓋率高達(dá)97%，UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫登錄號為A7VKE0。通過對其進(jìn)行進(jìn)一步的性質(zhì)研究得到南極磷蝦TM是一種對酸堿具有較強耐受力和對熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，此外TM對胃液消化表現(xiàn)出較強穩(wěn)定性，而對進(jìn)一步的腸液消化穩(wěn)定性較差，最終被降解為一系列小分子肽段。氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明南極磷蝦TM具有高度保守性，與26種甲殼類生物同源性在88%以上，與太平洋磷蝦TM序列同源性更是高達(dá)98.2%。利用DNAStar Protean、ANTHEPROT、BepiPred 1.0 server、ABCPred server和Immunomedicine Group 5種生物信息學(xué)工具分別對南極磷蝦TM模擬表位肽進(jìn)行分析預(yù)測，最終共篩選出8 條致敏性極高的候選過敏原模擬表位肽，分別是EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。同時利用SWISS-MODEL服務(wù)器對南極磷蝦TM進(jìn)行同源建模，預(yù)測得到其空間結(jié)構(gòu)為α-雙螺旋結(jié)構(gòu)。通過PyMOL軟件對預(yù)測到的8 條TM模擬表位肽進(jìn)行一一映射，結(jié)果顯示它們均勻分布在整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。本研究提取純化得到了較為純凈的南極磷蝦TM；同時利用多種生物信息學(xué)工具對其模擬表位肽的預(yù)測，不僅進(jìn)一步增加了研究者對南極磷蝦TM過敏原的認(rèn)識，也極大程度上提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；通過對其空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測及模擬表位肽的映射為過敏原表位的定位縮小了范圍，使得定位更加精準(zhǔn)。本研究為未來基于南極磷蝦TM表位的相關(guān)研究提供了科學(xué)參考，不過對其準(zhǔn)確的過敏原表位及其致敏性評價還需進(jìn)一步實驗驗證。