王子麗，許舒雯，邊金煥，趙 輝，龔祝南，

(1. 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210046；2. 安徽省科學(xué)技術(shù)研究院，安徽 合肥 230088；3. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

研究證實(shí)，糖尿病患者血漿中4項(xiàng)凝血纖溶指標(biāo)含量明顯高于非糖尿病患者[1]，體內(nèi)高胰島素血癥、高血糖、胰島素抵抗這些因素可以導(dǎo)致糖尿病患者的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能比正常人更容易受到損傷[2-3]，使得糖尿病患者更容易誘發(fā)血栓形成[4]。血栓形成后可誘發(fā)并加重糖尿病的其他并發(fā)癥，因此，了解并針對(duì)糖尿病血栓并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，采取適當(dāng)?shù)姆乐未胧?，可減緩糖尿病血栓并發(fā)癥的發(fā)展[5]，提高糖尿病患者的生存質(zhì)量。目前，已知的抗血栓藥物不良反應(yīng)較多[6]，中藥在血栓治療歷程中具有重要的地位[7]，活血化瘀是中醫(yī)抗血栓的黃金治則。益母草中活性成分益母草堿(leonurine，SCM)的活血化瘀功效，及其在抗糖尿病和血栓方面的治療效果，已經(jīng)得到充分驗(yàn)證[8-9]；黃精的主要成分黃精多糖(polygonatum polysaccharide，PSP)具有降血糖、調(diào)血脂的作用[10]；脫氧野尻霉素(deoxynojirimycin，DNJ)也已被證實(shí)可有效降低血糖[11]。這3者的聯(lián)合使用在治療Ⅱ型糖尿病和血栓方面的療效及其作用機(jī)制，是我們這項(xiàng)研究的主要目的。

斑馬魚擁有70%的人類同源基因，且含有凝血因子、血小板受體，對(duì)臨床應(yīng)用的抗凝血和抗血栓藥物具有很好的反映，使其成為廣泛研究人類疾病的新型動(dòng)物模型[12]。本文在建立糖尿病模型的基礎(chǔ)上，利用苯肼(phenyl hydrazine，PH)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、普納替尼(ponatinib，PT)3種不同誘導(dǎo)劑建立不同機(jī)制的斑馬魚糖尿病合并血栓模型，研究SCM、PSP、DNJ聯(lián)合用藥抗血栓、降血糖的效果和作用機(jī)制，為下一步藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚(AB系野生型)購(gòu)自杭州環(huán)特生物科技股份有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(浙)2021-0003)。

1.2 藥品與試劑SCM(批號(hào)AGW576)、PSP(批號(hào)20191113)、DNJ(批號(hào)F20245)由安徽省科學(xué)技術(shù)研究院提供。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，批號(hào)20191022)購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍(metformin，Met，批號(hào)c10619732)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；苯肼(批號(hào)G2030006)、花生四烯酸(批號(hào)A111764)、普納替尼(批號(hào)F1511088)、阿司匹林(aspirin，ASP，批號(hào)H2017089)、鄰聯(lián)茴香胺(批號(hào)C2009167)、無(wú)水醋酸鈉(批號(hào)2004091)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%過(guò)氧化氫(批號(hào)ZCD150)購(gòu)自廣州檢測(cè)科技有限公司；肌球蛋白輕鏈激酶亞型(myosin light chain kinase，Mlck1a)、蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha，PKCα)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)、β-actin(批號(hào)2313111474)引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR，批號(hào)7E531L1)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；QuantiChromTMGlucose Assay Kit葡萄糖測(cè)試盒(批號(hào)DIGL-100)購(gòu)自北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器恒溫光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)；IM-9B型手動(dòng)斑馬魚顯微注射泵(日本 Narishige公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK ELx808)；PCR儀(美國(guó)ABI 2720 Step One Plus)；超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Nano drop，ND-1000)；qRT-PCR儀(瑞士Roche公司)；EVOS新型顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國(guó)Life Technologies公司)。

1.4 方法

1.4.1藥物對(duì)斑馬魚早期發(fā)育毒性的影響 挑選受精24 h后發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，每孔6顆放入24孔板，每個(gè)藥物設(shè)置6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，另設(shè)一孔觀察毒性對(duì)于斑馬魚形態(tài)的影響?？瞻讓?duì)照組暴露在胚胎培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組暴露于不同濃度的Met+ASP、SCM、PSP、DNJ中。置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，統(tǒng)計(jì)并記錄暴露后24、48、72、96、120 h時(shí)斑馬魚胚胎死亡、孵化情況，在受精后6 d(days post fertilization，dpf)計(jì)算各藥物對(duì)斑馬魚半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50 %，LC50)。4 dpf通過(guò)EVOS新型顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察斑馬魚給藥后的形態(tài)變化。

1.4.2苯肼、花生四烯酸、普納替尼誘導(dǎo)三種糖尿病斑馬魚血栓模型的建立及藥物干預(yù) 選擇2 dpf的斑馬魚胚胎顯微注射構(gòu)建Ⅱ型糖尿病模型[13 - 14]。用0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素配成200 mg·L-1溶液，把斑馬魚胚胎放置在瓊脂糖凝膠板的凹槽內(nèi)，每尾斑馬魚幼魚注射的體積約是2 nL，注射完成的胚胎立即放回培養(yǎng)基，后放入培養(yǎng)箱，每隔8 h觀察，移除脫下的卵黃膜，培養(yǎng)至建立血栓模型。

3 dpf的斑馬魚血小板含量豐富，因此選擇3 dpf的斑馬魚用于PH、AA模型構(gòu)建，5 dpf的斑馬魚內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)完整，選擇5 dpf的斑馬魚用于PT模型構(gòu)建。注射STZ后的健康斑馬魚胚胎，分別在3 dpf和5 dpf分到24孔板中，設(shè)置對(duì)照組(Control)、模型組(1 μmol·L-1PH處理制備PH model，80 μmol·L-1AA處理制備AA model，5 mg·L-1PT處理制備PT model)、陽(yáng)性藥組(Met+ASP)、聯(lián)合藥物高、中、低濃度干預(yù)組，3個(gè)模型實(shí)驗(yàn)各設(shè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組60～70尾。對(duì)照組用培養(yǎng)基培養(yǎng)，PH和AA的給藥組用對(duì)應(yīng)濃度的藥液預(yù)處理6 h[15]，后將模型組替換為造模劑，給藥組替換為含造模劑與對(duì)應(yīng)濃度藥液的培養(yǎng)液，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(PH 24 h，AA 1.5 h，PT 18 h)，取5尾用于尾靜脈和心臟紅細(xì)胞染色觀察，取30尾用于斑馬魚總RNA提取，25尾用于斑馬魚組織糖含量測(cè)定。

1.4.3鄰聯(lián)茴香胺染色 移除24孔板中培養(yǎng)液，吸取同體積的鄰聯(lián)茴香胺染色液3 mL，錫箔紙避光染色，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗孵育10～15 min，取出微孔板，快速吸干染色液，用二甲基亞砜快速清洗3遍，將斑馬魚轉(zhuǎn)到新的24孔板中，加入等體積二甲基亞砜。吸出斑馬魚側(cè)位放置于載玻片上，置于顯微鏡下對(duì)心臟及尾靜脈觀察并拍照，用Image-Pro Plus統(tǒng)計(jì)斑馬魚心臟染色強(qiáng)度(staining intensity，SI)，進(jìn)行定量分析。

抑制血栓率/%=[SI(藥物干預(yù)組)-SI(模型組)]/[SI(正常對(duì)照組)-SI(模型組)]×100 %。

1.4.4qRT-PCR檢測(cè)血栓相關(guān)基因mRNA表達(dá) 對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組和聯(lián)合藥物高中低濃度干預(yù)組分別選取25尾斑馬魚幼魚，按照試劑盒說(shuō)明書提取斑馬魚組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 qRT-PCR primer sequences

1.4.5幼魚的組織糖含量測(cè)定 將斑馬魚吸取到離心管中，吸干培養(yǎng)液，加入200 μL磷酸鹽緩沖液充分研磨，12 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，按QuantiChromTMGlucose Assay Kit葡萄糖試劑盒方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性藥物和各給藥組對(duì)斑馬魚死亡率的影響如Fig1所示，Met+ASP組隨著給藥濃度增加，死亡率增高(Fig 1A)；SCM與PSP毒性相當(dāng)，當(dāng)SCM濃度高于400 mg·L-1時(shí)，6 dpf斑馬魚死亡率接近100%，LC50值為317.4 mg·L-1(Fig 1B)；當(dāng)PSP濃度達(dá)到400 mg·L-1時(shí)，6 dpf斑馬魚死亡率高于77.78%，LC50值為300.6 mg·L-1(Fig 1C)；DNJ的毒性相比較小，只有高濃度組達(dá)到100%，且1 g·L-1DNJ對(duì)斑馬魚的毒性非常小，在3 dpf時(shí)斑馬魚死亡率僅為5.56%，之后實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)保持不變(Fig 1D)。

Fig 1 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on zebrafish mortalityA：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ

2.2 陽(yáng)性藥物和各給藥組對(duì)斑馬魚孵化率的影響孵化不僅是斑馬魚胚胎發(fā)育的重要階段，也是評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚類作用的一個(gè)主要毒理學(xué)重點(diǎn)。孵化是生理、生化和滲透機(jī)制共同作用的結(jié)果，斑馬魚胚胎一般從受精后48 h(hours post fertilization，hpf)開(kāi)始孵化，大多數(shù)胚胎在72 hpf孵化，在96 hpf孵育幾乎完成。從圖中可以看出各種藥物在48 hpf孵化率在50%左右，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，孵化率增加。與空白組相比，無(wú)論暴露在哪種藥物中，高劑量給藥組的斑馬魚胚胎的孵化被延遲且孵化率達(dá)不到100 %，而較低劑量給藥組能夠促進(jìn)胚胎孵化(Fig 2)。

Fig 2 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on hatching rate of embryos A：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ.

2.3 陽(yáng)性藥物和各給藥組對(duì)斑馬魚發(fā)育過(guò)程中形態(tài)變化的影響藥物對(duì)斑馬魚的毒性主要表現(xiàn)在卵黃囊水腫、脊柱和尾巴彎曲、心包水腫。Met+ASP隨著給藥濃度增高，卵黃囊腫變大(Fig 3A)；當(dāng)SCM高于300 mg·L-1時(shí)，隨著濃度的增大斑馬魚卵黃囊水腫越來(lái)越明顯，且出現(xiàn)心包水腫、脊柱彎曲、色素沉著的現(xiàn)象(Fig 3B)；PSP低濃度組卵黃囊未見(jiàn)明顯變化，濃度高于320 mg·L-1時(shí)，明顯出現(xiàn)脊椎彎曲、卵黃囊腫等現(xiàn)象(Fig 3C)；低濃度DNJ對(duì)斑馬魚的毒性較小，僅有卵黃囊變黑現(xiàn)象，斑馬魚卵黃囊腫大、心包水腫在高濃度組時(shí)表現(xiàn)得明顯(Fig 3D)。

Fig 3 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on toxicity of juvenile zebrafishA：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ.

綜合考慮死亡率、孵化率以及形態(tài)特征變化，確定陽(yáng)性藥組(Met 200 mg·L-1+ASP 10 mg·L-1)以及聯(lián)合藥物高濃度組(SCM 150 mg·L-1，PSP 80 mg·L-1，DNJ 1 g·L-1)、中濃度組(SCM 75 mg·L-1，PSP 40 mg·L-11，DNJ 500 mg·L-1)、低濃度組(SCM 37.5 mg·L-1，PSP 20 mg·L-1，DNJ 250 mg·L-1)的給藥濃度。

2.4 聯(lián)合用藥對(duì)苯肼誘發(fā)糖尿病斑馬魚血栓模型的影響苯肼是強(qiáng)氧化劑，通過(guò)促進(jìn)血小板黏附，造成血栓的形成。如Fig 4所示，與對(duì)照組比，PH模型組尾靜脈血栓明顯增加，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度較少(P<0.01)，說(shuō)明建模成功。與PH模型組比，陽(yáng)性藥(Met+ASP)干預(yù)后尾靜脈血栓減少明顯，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達(dá)68.38%；低濃度組尾靜脈血栓較多，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度較模型組增加(P<0.01)，抑制血栓率為19.46%；中濃度組尾靜脈形成量較模型組減少，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度增加(P<0.01)，抑制血栓率為32.23%；高濃度組尾靜脈形成量較模型組明顯減少，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達(dá)51.23%。各劑量組抑制血栓效率，表現(xiàn)出劑量相關(guān)性。

Fig 4 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in phenylhydrazine model

2.5 聯(lián)合用藥對(duì)花生四烯酸誘發(fā)糖尿病斑馬魚血栓模型的影響花生四烯酸通過(guò)激活血小板聚集，調(diào)節(jié)血管收縮，造成血栓。如Fig 5所示，與對(duì)照組比，AA模型組尾靜脈血栓明顯增加，而心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯減少(P<0.01)，說(shuō)明建模成功；與AA模型組比，陽(yáng)性藥(Met+ASP)干預(yù)后明顯可見(jiàn)尾靜脈血栓減少，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達(dá)62.01%；低濃度組尾靜脈血栓較多，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度與模型組相比(P<0.01)，抑制血栓率為25.03%；中濃度組尾靜脈形成量較模型組相比減少不明顯，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(P<0.01)，抑制血栓率為33.58%；高濃度組血栓尾靜脈形成量較模型組明顯減少，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達(dá)46.12%。各劑量組的抑制血栓效率，表現(xiàn)出劑量相關(guān)性。

Fig 5 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in the arachidonic acid model

2.6 聯(lián)合用藥對(duì)普納替尼誘發(fā)糖尿病斑馬魚血栓模型的影響普納替尼通過(guò)調(diào)節(jié)某些通路表達(dá)誘導(dǎo)血栓形成。如Fig 6所示，與對(duì)照組比，PT模型組尾靜脈血栓增加非常明顯，而心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯減少(P<0.01)，說(shuō)明建模成功；與PT模型組比，陽(yáng)性藥(Met+ASP)干預(yù)后尾靜脈血栓減少明顯，僅有較少的血栓且被斑馬魚自身黑色素遮擋，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達(dá)69.36%；低濃度組尾靜脈血栓較多，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(P=0.398)，抑制血栓率僅有5.38 %；中濃度組尾靜脈形成量較模型組雖然有減少，但不明顯，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(P<0.01)，抑制血栓率為29.68%；高濃度組血栓尾靜脈形成量較模型組明顯減少，呈現(xiàn)不連續(xù)血流，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)，抑制血栓效率達(dá)48.50%。各劑量組的抑制血栓效率，表現(xiàn)出劑量相關(guān)性。

Fig 6 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in ponatinib model

2.7 聯(lián)合用藥對(duì)斑馬魚體內(nèi)血栓相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的影響Mlck1a基因能夠改變血小板形態(tài)和血栓的形成[16]，血管性血友病因子vWF可與膠原及血小板膜GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，在血小板聚集、黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]，PKCα已經(jīng)被證實(shí)是血小板功能的重要正調(diào)節(jié)劑和體內(nèi)體外血栓形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[18]。如Fig 7所示，與對(duì)照組相比，模型組中Mlck1a、PKCα、vWF mRNA表達(dá)水平顯著升高；與模型組相比，聯(lián)合藥組基因表達(dá)明顯下降，且隨著給藥濃度遞增呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，因此聯(lián)合藥各個(gè)濃度都能下調(diào)PH、AA、PT誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病合并血栓模型中Mlck1a、PKCα、vWF基因的表達(dá)量，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

Fig 7 Effect of compound drugs on expression of Mlck1a，PKCα and vWF genes in zebrafish PH model，AA model and PT model

2.8 聯(lián)合藥對(duì)斑馬魚組織糖含量的影響基于本實(shí)驗(yàn)室前期工作，斑馬魚注射STZ后達(dá)到糖尿病狀態(tài)，且在我們實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，該模型較穩(wěn)定。如Fig 8所示，聯(lián)合藥3種濃度均可降低3種模型的組織糖含量，每個(gè)濃度之間降低組織糖含量的效果差距不大。

Fig 8 Effects of compound drugs on tissue glucose content in zebrafish PH model，AA model and PT model

3 討論

本文首先通過(guò)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性研究，確定聯(lián)合藥中各組分的安全給藥劑量，使用PH、AA、PT誘導(dǎo)方法建立3種斑馬魚Ⅱ型糖尿病合并血栓模型，可直觀的觀察血栓形成情況。

對(duì)3種模型進(jìn)行藥物干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合藥可有效對(duì)抗斑馬魚的血栓形成，說(shuō)明其可能通過(guò)抑制血小板聚集、影響花生四烯酸代謝途徑、保護(hù)血管內(nèi)皮等方式，影響血栓的形成。此外，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)血栓相關(guān)基因Mlck1a、PKC、vWF mRNA的表達(dá)，顯示不同濃度的聯(lián)合藥都能不同程度的降低基因的表達(dá)，從而影響血小板的形成，進(jìn)一步降低血栓產(chǎn)生的可能性。

由此可見(jiàn)，本研究通過(guò)建立和使用斑馬魚Ⅱ型糖尿病合并血栓模型，證實(shí)由SCM、PSP、DNJ組成的聯(lián)合藥物具有抗血栓、降血糖作用，且其抗血栓機(jī)制存在多靶點(diǎn)效應(yīng)，為下一步藥物開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。