楊亞麗,田 榮，袁 茵，王艷佳，楊曉玲

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院；2.國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室；3.寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是呼吸系統(tǒng)一種嚴重的疾病，其死亡率高，發(fā)病率約為30%～40%[1]。越來越多的證據(jù)表明，過度炎癥反應在ALI的發(fā)病中起關鍵作用[2-3]。作為革蘭陰性細菌細胞壁主要成分的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，體內(nèi)外實驗均表明，LPS誘導ALI是一種被廣泛接受的細菌性膿毒癥動物模型[4]。FoxO1作為Fox轉(zhuǎn)錄家族的主要成員之一，可以調(diào)節(jié)多種基因的表達，參與細胞分化、氧化應激、炎癥反應、脂代謝等病理過程，并參與ALI疾病發(fā)生[5-6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信號通路是細胞內(nèi)調(diào)控炎癥產(chǎn)生的主要信號轉(zhuǎn)導通路，與LPS誘發(fā)的ALI有密切關系[7]，p38 MAPK通過磷酸化被激活后，調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，促進IL-1、TNF-α等細胞因子的分泌，誘導一系列炎癥反應[7]。因此，本研究通過LPS復制ALI體內(nèi)外模型，探討FoxO1 DNA甲基化及FoxO1/p38 MAPK信號通路在ALI中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 20只SPF級CBS+/+♂小鼠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心標準屏障環(huán)境內(nèi)，通風良好，期間自由活動和飲食，飼養(yǎng)8周后，體質(zhì)量約25 g，實驗動物合格證號：SCXK(京)2016-0006，根據(jù)實驗安排和需要，對小鼠進行處理。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州，安泰)；CO2培養(yǎng)箱(德國，Heraeus)；5415D型微量臺式離心機(德國，Eppendorf)；BS110S型精密天平(德國，Sartorius)；熒光定量PCR儀(美國，Bio-Rad)；垂直電泳儀、凝膠成像儀和Mod-el680全自動酶標儀(美國，Bio-Rad)，酶標儀(美國Bio-TEK)，普通PCR儀和qRT-PCR儀(德國，耶拿)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 選取20只8周齡25 g左右的SPF級CBS+/+小鼠，隨機分為LPS組和Control組，每組10只，飼喂普通飲食，參考文獻說明[8]，術前將LPS溶解于無菌生理鹽水中，小鼠禁食12 h后，LPS組根據(jù)5 mg·kg-1的劑量給予LPS腹腔注射，Control組給予等量的生理鹽水腹腔注射。造模成功6 h后麻醉處理動物獲取肺組織。本研究嚴格按照《實驗動物管理條例》進行實驗。

1.2.2細胞培養(yǎng) PVEC 使用含10%胎牛血清及1%的青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液，根據(jù)細胞生長狀態(tài)，傳至2～3代可用于后續(xù)實驗。

1.2.3細胞分組及轉(zhuǎn)染 實驗組：PVEC轉(zhuǎn)染 si-FoxO1 組；陰性對照組(negative control，si-NC)：轉(zhuǎn)染對基因無影響的空載RNA；空白對照組(control)：加入等體積的完全培養(yǎng)基組。將處于指數(shù)生長期的細胞消化后細胞計數(shù)，等量接種于6孔板，待細胞生長到肉眼觀60%～70%密度時進行轉(zhuǎn)染。依據(jù)Lipofectamine2000 Reagent和si-FoxO1的說明書對各組細胞進行細胞轉(zhuǎn)染實驗，培養(yǎng)6 h后，換正常的培養(yǎng)基，48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.4HE染色 處死小鼠后,取左肺上葉組織置于4%的多聚甲醛固定24 h，進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，按標準操作進行HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學變化。

1.2.5免疫組化染色 使用上述的方法制備的石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，于0.01 mol·L-1檸檬酸鹽溶液高溫加熱進行抗原修復2 min后，每張切片滴入0.3%過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。經(jīng)置室溫冷卻后，滴入10%山羊血清37 ℃封閉30 min，以減少非特異性染色。滴加抗FoxO1(1 ∶200)單克隆抗體在濕盒中4 ℃孵育過夜，次日滴加生物素標記的二抗，室溫孵育1 h，加入DAB顯色，再使用蘇木精染色液對切片進行復染，常規(guī)脫水中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6肺組織炎癥因子的檢測 各組小鼠處死后迅速取肺組織，稱取約50 mg加入450 μL PBS，勻漿器充分研磨組織直至完全裂解，12 000×g離心10 min，取上清，按照ELISA說明書，檢測肺組織中IL-6和TNF-α的含量。

青海省平均海拔3500～4500m，是我國生態(tài)安全、水資源利用和高寒生物多樣性保護的關鍵地區(qū)。青海省現(xiàn)有可造成土壤污染的企業(yè)有礦業(yè)、鉻化工企業(yè)、鋁鎂化工企業(yè)、石油企業(yè)等多家企業(yè)，都對土壤環(huán)境造成威脅。

1.2.7Western blot檢測FoxO1、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和p38 MAPK的蛋白表達 稱取Control組及LPS組肺組織各0.6 g，用預冷的PBS沖洗組織2次，加入細胞裂解液，使用勻漿機將其破碎，在4 ℃搖床裂解組織2 h，離心機4 ℃，12 000×g離心5 min，提取上清液，即得總蛋白，采用BCA法測定各組蛋白含量，按每孔30 μg蛋白經(jīng)煮沸8 min后，開始10% SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗(1 ∶1 000)孵育，4 ℃搖床過夜，次日PBST洗膜，10 min，洗3 次，然后使用含HRP-二抗室溫孵育2 h，PBST洗膜3次后將PVDF膜放入凝膠成像儀內(nèi)，膜上滴ECL發(fā)光液，A液 ∶B液=1 ∶1，曝光，以β-actin為內(nèi)參，Image Lab圖像分析軟件分析各組蛋白的相對表達。

1.2.8qRT-PCR檢測FoxO1和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA水平 稱取各組組織約0.6 g，使用勻漿機將其破碎，加1 mL TRIzol RNA提取試劑，提取總RNA，測定樣品純度(A260/A280=1.80～2.0)與濃度后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA按照Bestar SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、cDNA 2 μL、ROX 0.4 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL，配成20 μL的PCR擴增體系。在NCBI查詢各基因的CDS，用Premier 6.0軟件設計引物。引物序列見Tab 1。擴增條件如下：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參，目的基因的相對表達用2-ΔΔCT法分析。

Tab 1 Primers involved in real time PCR

1.2.9nMS-PCR檢測FoxO1啟動子區(qū)DNA甲基化水平 按DNA提取試劑盒說明書提取各組細胞全基因組DNA，亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA進行甲基化修飾。nMS-PCR法檢測FoxO1啟動子區(qū)DNA甲基化程度的改變。針對FoxO1啟動子區(qū)，在線(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設計一對外引物及兩對內(nèi)引物(外引物：上游：5′-TTTGTAGGTGTGTATAGG TAGGGTG-3′，下游：5′-AATACTCCAAACAAAACCCAAAC-3′；甲基化內(nèi)引物：上游：5′-TAGAAAAGCGGTTTTTATAGAAGAC-3′，下游：5′- TACCTATACACACCTACAAAACGAA-3′；非甲基化內(nèi)引物：上游：5′-TGGTAGAAAAGTGGTTTTTATAGAAGAT-3′，下游：5′-CCCTACCTATACACACCTACAAAACA-3′)。反應體系：MIX 12.5 μL、H2O 7 μL、上下游引物各1 μL、已修飾的DNA模板3.5 μL，共25 μL。外引物擴增的反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5 ℃至50 ℃，72 ℃ 2 min。以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，進行內(nèi)外引物的擴增，反應條件同外引物。隨后，取10 μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及甲基化條帶的光密度，按如下公式進行計算：甲基化/%=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%。

2 結果

2.1 肺組織的形態(tài)學變化正常肺臟組織壁薄，無結締組織增生、增厚；各級支氣管結構完整清晰，染色較為均勻，未見明顯變性壞死(Fig 1A)；LPS 組小鼠肺泡結構被破壞，肺泡壁溶解斷裂，局部肺泡腔狹窄甚至消失，肺泡壁、肺泡腔或間質(zhì)炎細胞大量浸潤(Fig 1B)。

Fig 1 Lung pathological changes of mice in each group (200×)

2.2 各組小鼠IL-6和TNF-α的表達與Control 相比，LPS組小鼠肺組織IL-6和TNF-α濃度及mRNA水平均明顯升高，其中ELISA結果顯示，IL-6和TNF-α濃度分別升高了38.9%和52.5%(Fig 2A，P<0.05)，qRT-PCR結果顯示，IL-6和TNF-α的mRNA水平分別升高了144.5%和246.9%(Fig 2B，P<0.01)，且差異有統(tǒng)計學意義。

Fig 2 Expression of inflammatory cytokines IL-6

2.3 肺組織中FoxO1的表達變化肺組織免疫組化分析顯示：與Control組比較，LPS組FoxO1的表達高于正常肺組織的表達(Fig 3A)；qRT-PCR和Western blot分別檢測肺組織中FoxO1 mRNA及蛋白的表達水平，結果顯示：與Control組比較，LPS組FoxO1的mRNA和蛋白表達分別增加了134.9%和61.8%(Fig 3B和C)，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Fig 3 Expression of FoxO1 in lung tissues of

2.4 FoxO1 DNA 甲基化水平改變利用生物信息學軟件分析預測FoxO1啟動子區(qū)結構，在啟動子上游-1226～-1352和-1414～-1796 bp的位置存在兩個CpG島(Fig 4A)。利用nMSP 檢測FoxO1啟動子區(qū)的改變，結果顯示，與對照組相比，LPS組FoxO1啟動子區(qū)甲基化水平降低了17.2%(Fig 4B，P<0.05)。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是維持DNA甲基化修飾的酶，主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，qRT-PCR及Western blot分別檢測了DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達，結果顯示，LPS組小鼠肺組織DNMT3A和DNMT1的mRNA水平分別降低了149.1%和59.8%(P<0.05,P<0.01)，DNMT3B變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,Fig 4C)；DNMT3A和DNMT3B的蛋白水平分別降低了142.1%和37.7%(P<0.05,P<0.01)，DNMT1的變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05,Fig 4D)，綜合以上數(shù)據(jù)，說明FoxO1啟動子區(qū)發(fā)生甲基化主要受到DNMT3A的調(diào)控，從而參與LPS導致的肺損傷過程。

Fig 4 Expression of DNA methyltransferase in lung tissues

2.5 FoxO1甲基化水平與炎癥的相關性分析Pearson相關性分析結果顯示，F(xiàn)oxO1甲基化水平與小鼠肺組織IL-6及TNF-α濃度呈負相關(r2=-0.521 8，r2=-0.788 2)(Fig 5A，B，P<0.05，P<0.01)，該相關性分析表明，小鼠肺組織炎癥因子的產(chǎn)生與FoxO1啟動子區(qū)DNA甲基化水平相關。

Fig 5 Analysis of correlation between FoxO1

2.6 p38 MAPK的磷酸化水平與Control對照比較，LPS組肺組織p38 MAPK蛋白表達無差異(P>0.05)，而p38 MAPK磷酸化水平明顯增加，升高了134.1%(P<0.01)，見Fig 6。

Fig 6 The phosphorylation level of p38

2.7 干擾FoxO1后p38 MAPK的表達變化為了進一步探討FoxO1在肺損傷中的機制，構建FoxO1干擾片段并轉(zhuǎn)染至 PVEC 48 h，qRT-PCR結果顯示，在引起FoxO1表達下調(diào)的3個干擾片段中，F(xiàn)oxO1-siRNA-1803( si-FoxO1)敲低效果最佳，可用于后續(xù)試驗(Fig 7A)。Western blot驗證其干擾效率，結果顯示，F(xiàn)oxO1干擾片段篩選成功(Fig 7B)；為證明FoxO1在LPS誘導的肺損傷中調(diào)控作用，在LPS干預PVEC情況下轉(zhuǎn)染si-FoxO1，Western blot檢測p38 MAPK的磷酸化變化。結果顯示，與LPS+si-NC組相比，LPS+si-FoxO1組p38 MAPK蛋白磷酸化水平明顯降低(Fig 7C)，以上結果說明，F(xiàn)oxO1可以調(diào)控p38 MAPK的磷酸化水平。

Fig 7 Changes of p38 phosphorylation level after interference with

3 討論

脂多糖是革蘭陰性菌細胞壁的主要活性成分，可誘導炎癥反應的過度激活，現(xiàn)已被廣泛應用于誘導ALI模型[9-10]。我們的實驗給予小鼠腹腔注射LPS誘導構建了急性肺損傷小鼠模型，肺損傷小鼠模型中病理學表現(xiàn)為肺泡結構損傷，肺間質(zhì)充血水腫、大量炎性細胞浸潤，肺組織勻漿液TNF-α和IL-6含量也明顯高于對照組，說明我們成功構建了急性肺損傷小鼠模型。

FoxO1作為人體最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在多種細胞類型中廣泛表達，可通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細胞氧化應激反應、炎癥及增殖等多種病理生理過程[11]。FoxO1自身的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)FoxO1的功能奠定了它在代謝、免疫等方面研究中的重要地位[12]。Artham等[13]發(fā)現(xiàn)，Akt1/FoxO1/stromelysin1通路參與了LPS誘導的ALI的發(fā)病機制中，而抑制FoxO1的表達后，可逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導的急性肺損傷。本研究結果顯示：在LPS誘導的肺損傷模型中，F(xiàn)oxO1表達明顯增加，表明FoxO1參與了肺損傷的過程，但其具體機制有待進一步研究。

DNA甲基化作為真核生物最常見的表觀遺傳修飾方式之一，目前，F(xiàn)oxO1 DNA甲基化作為一種調(diào)控機制日益成為人們研究的熱點，課題組前期發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1啟動子區(qū)的低甲基化造成FoxO1的表達增加，在Hcy誘導的肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激未折疊蛋白反應中發(fā)揮重要作用[14]，但是，關于FoxO1基因DNA異常甲基化與肺損傷的相關性研究尚屬于全新的領域，其具體作用尚不明確。我們通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1啟動子區(qū)存在兩個CpG島，提示FoxO1的表達可能受甲基化調(diào)控。進一步用MSP檢測FoxO1啟動子區(qū)甲基化，結果顯示，LPS組肺組織FoxO1啟動子區(qū)甲基化水平明顯降低，與其表達水平相反。由于DNA甲基化受甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控，進一步檢測甲基轉(zhuǎn)移酶的表達，發(fā)現(xiàn)LPS組DNMT3A表達明顯降低，而DNMT1和DNMT3B無明顯變化，提示DNMT3A表達降低使FoxO1啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化，進而調(diào)控FoxO1的表達。

p38MAPK作為MAPKs家族重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，在機體內(nèi)被促炎細胞因子、內(nèi)毒素等因素誘發(fā)后，介導機體的炎癥、應激和損傷等信號傳遞過程，并且活化p38 MAPK信號通路，以磷酸化形式為主要特征[15]。Viji等[16]報道，高同型半胱氨酸血癥通過擾亂FoxO1和MAPK信號級聯(lián)反應來改變成骨細胞中的氧化還原調(diào)節(jié)機制。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)[17]，在肝細胞中，F(xiàn)oxO1通過增加p38活性，進而激活PKB和MAPK通路。提示FoxO1/p38 MAPK信號通路在多種生理和病理過程中起重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織p38 MAPK全蛋白無明顯變化，但其磷酸化水平明顯增加，為了進一步明確FoxO1 DNA甲基化水平與p38 MAPK磷酸化之間的關系，我們繼續(xù)體外培養(yǎng)小鼠肺血管內(nèi)皮細胞，并轉(zhuǎn)染si-FoxO1干擾片段檢測p38 MAPK的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)其磷酸化水平明顯降低，提示脂多糖促使p38 MAPK信號通路活化，并參與調(diào)控小鼠肺損傷。

綜上所述，LPS可誘導小鼠肺組織發(fā)生炎癥反應，并通過激活相關的信號通路導致肺損傷，其作用機制可能與FoxO1啟動子區(qū)DNA甲基化水平降低，進而上調(diào)FoxO1的表達并激活p38 MAPK信號通路有關。