肖斯婷，胡宇馳，郭玉東，許華玉，楊文良，李 波

(1. 北京市藥品檢驗研究院、國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評價重點實驗室、中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206; 2.國家藥典委員會，北京 100061; 3.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

水蛭是收載入《中國藥典》的典型活血化瘀藥物，其功能主治為破血通經(jīng)、逐瘀消癥[1]。已有的研究證明，水蛭活性有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué)、促進纖溶等，抗凝血是其最顯著的藥理作用[2]。研究證實，水蛭有縮短活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)的作用,在整體動物實驗和離體實驗均具有規(guī)律的一致性[3-4]。測定水蛭加入血漿后APTT的延長情況，可能是量化測定水蛭抗凝血活性質(zhì)量控制的研究方向，命名為抗凝血活性測定法。

本文進行兔血漿-APTT法測定水蛭抗凝血活性的實驗方法設(shè)計研究，先進行劑量-效應(yīng)曲線考察，統(tǒng)計分析后選擇測定方法的統(tǒng)計模型，并進行樣品的預(yù)測定，探索出可行的量化測定水蛭抗凝血活性的方法體系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑螞蟥飲片，由北京康而福藥業(yè)有限公司提供3批，批號分別為：20171201、20171202、20171203，采用冰凍粉碎機粉碎成100目碎末。日本醫(yī)蛭藥材，由貴州信邦制藥股份有限公司提供4批，批號分別為：20171001、20171002、20170902、20170901。螞蟥對照藥材，批號：121061-201806，購自中國食品藥品檢定研究院。菲牛蛭對照藥材，批號：121754-201901，購自中國食品藥品檢定研究院。APTT試劑，由Instrumentation Laboratory Co儀器實驗公司生產(chǎn)，批號：N0394780。枸櫞酸鈉購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器全自動血液凝固分析儀，ACLELTTE PRO，Instrumentation Laboratory Company。

1.3 動物與血漿日本大耳白家兔，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，動物許可證號：SCXK(京)2019-0006。家兔頸總動脈取血，3.2%枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1離心15 min制備血漿，將多只(3只以上)兔血漿混勻，備用。

1.4 浸提液制備與APTT值測定精密稱取螞蟥藥材、日本醫(yī)蛭藥材以及螞蟥、菲牛蛭和土鱉蟲對照藥材，加0.9%氯化鈉注射液，4 ℃浸提30 min，5 000 r·min-1離心20 min，取0.1 mg·L-1上清液，再加0.9%氯化鈉注射液稀釋配制成不同濃度的浸提液，采用全自動血凝儀和家兔血漿，測定不同濃度浸提液的APTT值。反應(yīng)體系：20 μL不同濃度水蛭浸提液，兔血漿50 μL，APTT試劑50 μL，混勻，37 ℃±0.5 ℃預(yù)溫180 s，每管再加入CaCl2試劑50 μL，測定凝結(jié)時間。

1.6 測定值方差齊性分析采用1批菲牛蛭對照藥材，配制成0、5、10、20、30、50 g·L-1，在同一臺血凝儀上分別測定6次APTT值，對APTT和對數(shù)轉(zhuǎn)換后的APTT進行方差齊性檢驗，分析在何種情況下測定值之間出現(xiàn)方差齊性。

1.7 測定體系的選擇根據(jù)劑量效應(yīng)值曲線呈現(xiàn)直線的劑量范圍和測定值處理值，選擇測定值方差齊性的處理模式，按照專屬性好、精密度符合要求、實驗量少的原則確定最佳的實驗體系。

1.8 樣品預(yù)測定采用對照藥材作對照品，按照選定的測定體系，平行制備對照藥材和藥材樣品的浸提液，平行測定多劑量APTT值，按照預(yù)先編制的符合要求的統(tǒng)計軟件進行生物活性測定統(tǒng)計，觀察曲線的特征是否符合統(tǒng)計學(xué)要求，初步判定測定體系的適宜性。

2 結(jié)果

2.1 劑量效應(yīng)曲線特征考察4批日本醫(yī)蛭和3批螞蟥藥材，不同濃度浸提液測定APTT數(shù)據(jù)列表如下。

日本醫(yī)蛭制備浸提液后，隨濃度的升高離體血漿的APTT值不斷延長，有明顯的量效關(guān)系。日本醫(yī)蛭的作用較強，有的批次在0.05 kg·L-1或0.08 kg·L-1即超出了全自動血凝儀測定上限299 s；同時，不同批次之間的作用強度有較大差異。

Tab 1 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 2 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 3 Concentration -APTT determination data of 2 batches of leech extract

螞蟥制備浸提液后，隨濃度的升高離體血漿的APTT值也不斷延長，有明顯的量效關(guān)系。但螞蟥的延長作用較日本醫(yī)蛭弱，且APTT延長到一定濃度后延長不明顯，說明螞蟥延長APTT值有一定的上限。 對上述7批樣品的測定數(shù)據(jù)進行作圖，以濃度為X軸(kg·L-1)，APTT值為Y軸(s)，結(jié)果見Fig 1。日本醫(yī)蛭和螞蟥的曲線有明顯不同，日本醫(yī)蛭能夠?qū)PTT值延長到超過儀器測定上限，而螞蟥的浸提液APTT延長到一定程度后會有平臺期。由Fig 1可見，日本醫(yī)蛭和螞蟥藥材的濃度-APTT，均不是直線，回歸相關(guān)性較差。

Fig 1 Concentration-APTT curve of leeches

對上述的7批藥材樣品的測定數(shù)據(jù)，以濃度為X軸(kg·L-1)，以APTT值的對數(shù)值為Y軸，結(jié)果見Fig 2?？梢?批日本醫(yī)蛭明顯成為一條直線，而螞蟥有反應(yīng)平臺值，初步觀察并同通過曲線擬合，可見螞蟥0.025 kg·L-1前呈現(xiàn)直線關(guān)系，見Fig 3。以濃度對數(shù)為X軸(kg·L-1)，以APTT值為Y軸，結(jié)果見Fig 4。可見4批日本醫(yī)蛭和螞蟥的曲線均不是直線，R2值小于0.9，兩者特征有明顯不同。以濃度的對數(shù)為X軸(kg·L-1)，以APTT值的對數(shù)為Y軸，結(jié)果見Fig 5。可見4批日本醫(yī)蛭數(shù)據(jù)接近直線，3批螞蟥的數(shù)據(jù)不是直線，而低劑量下曲線接近直線。

課題組歸納出一些具體的學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)方法，如自主學(xué)習(xí)、問題學(xué)習(xí)、開放學(xué)習(xí)、案例學(xué)習(xí)、課題學(xué)習(xí)和網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)等方法[3]，增強學(xué)生探究和體驗的機會。

Fig 2 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches

Fig 3 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches (concentration 0～0.025 kg·L-1)

Fig 4 Log-APTT curve of concentration of leeches

Fig 5 Log-APTT log curve of concentration of leeches

采用螞蟥、菲牛蛭和土鱉蟲對照藥材進行一系列濃度的APTT值測定，繪制曲線，螞蟥對照藥材的曲線特征與3批螞蟥藥材相似，菲牛蛭對照藥材的曲線特征與4批日本醫(yī)蛭藥材樣品相似，濃度與APTT的對數(shù)作圖見Fig 6。由Fig 6可見，螞蟥對照藥材的濃度與APTT的對數(shù)在低劑量時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且直線通過空白對照。菲牛蛭對照藥材的濃度與APTT的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且直線基本通過空白對照。土鱉蟲對照藥材無延長APTT的作用。從曲線考察結(jié)果來看，日本醫(yī)蛭適合采用斜率比法進行效價測定，也可以采用量反應(yīng)平行線法；而螞蟥在低劑量時，適合采用斜率法和量反應(yīng)平行線法。

Fig 6 Logarithmic curve of concentration-APTT for leeches, Philippine cattle leeches and Trionyx sinensis

Fig 7 APTT logarithmic data points of different dosimetry

2.2 方差齊性分析結(jié)果將菲牛蛭對照藥材6個濃度浸提液分別測定6次APTT值列表，數(shù)據(jù)見Tab 4。對APTT值和對數(shù)轉(zhuǎn)換后的APTT值，用SPSS 17.0軟件進行方差齊性檢驗，結(jié)果可見對數(shù)APTT值各劑量的標準差未出現(xiàn)顯著性差異(P=0.888)，APTT值各劑量之間的方差存在顯著差異(P=0.002)，方差分析結(jié)果見Tab 5。

Tab 4 APTT data of phellodendrine leeches at different doses

Tab 5 Test results of homogeneity of variance of APTT data measured at different doses(Test of homogeneity of variances)

2.3 活性測定體系的確定綜合7批藥材樣品和螞蟥對照藥材、菲牛蛭對照藥材的量效關(guān)系曲線分析來看，在低劑量情況下，測定體系符合以下斜率比模型的特征： ① 在劑量較低的情況下，APTT值測定沒有達到平臺期，日本醫(yī)蛭和螞蟥藥材的濃度-APTT對數(shù)值呈直線，且直線最終相交于零濃度。② 經(jīng)方差齊性分析，APTT值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，APTT測定值呈正態(tài)分布；不同劑量間生物反應(yīng)的標準差不出現(xiàn)顯著性差異，說明主要影響因素是劑量的差異。③ 所有測定樣品的劑量范圍內(nèi)，至少有3個濃度的量-效關(guān)系滿足呈直線要求。因此，從數(shù)據(jù)來分析，可采用3劑量的斜率比法進行水蛭抗凝血活性的測定。

斜率比法進行統(tǒng)計分析時，實驗成立的條件應(yīng)至少滿足以下3點：① 回歸分析應(yīng)顯著，P值應(yīng)小于0.05，表明APTT測定結(jié)果隨劑量出現(xiàn)顯著差異。② 截距差異應(yīng)不顯著，P值應(yīng)大于0.05，表明樣品和對照品的曲線相交點在0濃度。③ 非線性應(yīng)不顯著，P值應(yīng)大于0.05，表明樣品和對照品的線性特征一致。

2.4 樣品預(yù)測定結(jié)果采用螞蟥對照藥材做標準品，分別對3批螞蟥和4批日本醫(yī)蛭制備浸提液，稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液，平行測定各劑量的APTT，將測定的APTT值輸入斜率比法計算模板，測定3批螞蟥和4批日本醫(yī)蛭相對于螞蟥對照藥效的相對效價，見Tab 6和Fig 8、9。

Tab 6 Statistics of slope ratio method for predicting anticoagulant activity of leeches

Fig 8 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

Fig 9 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

從預(yù)測定結(jié)果來看，以螞蟥對照藥材可以作為螞蟥的活性測定對照品來使用，實驗均成立。但不能用來測定日本醫(yī)蛭的抗凝血活性，實驗均不成立。

采用菲牛蛭對照藥材為標準品，同時與4批日本醫(yī)蛭制備浸提液，稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液，采用斜率比法計算模板計算4批日本醫(yī)蛭相對于菲牛蛭對照藥材的相對效價。見Fig 10和Tab 7。

Tab 7 Prediction results of leech anticoagulant activity by slope ratio method

Fig 10 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

3 討論

自《中國藥典》2010年版收載中藥生物活性測定指導(dǎo)原則以來，采用生物活性測定進行中藥質(zhì)量控制越來越成為中藥研究者的共識，國家藥監(jiān)局藥品審評中心2020年發(fā)布了《中藥生物效應(yīng)檢測研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[5],中藥標準中收載體現(xiàn)其臨床治療效應(yīng)的量化評價、整體評價也就成為了研究的熱點方向。國家藥典委員會也認為，通過研究代表藥物的生物活性測定方法，建立科學(xué)、合理的生物活性測定標準，可以提升我國中藥質(zhì)量控制的總體能力，尤其是臨床大量運用、具有我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)特點、基礎(chǔ)研究非常深入的活血化瘀類藥物是重點方向和可行方向[6]。但國家藥典委員會同時也指出，生物檢定方法在如何確認和評價方法的適用性和準確性方面存在風(fēng)險，應(yīng)進行生物檢定方法的設(shè)計、開發(fā)及驗證的關(guān)鍵技術(shù)研究，適當(dāng)時候制定指導(dǎo)原則[6]。水蛭在體內(nèi)和體外具有延長血漿APTT值的作用，體外延長APTT作用具有明顯的隨劑量增加而延長的作用，這是建立量化評價的生物活性質(zhì)控方法的最好基礎(chǔ)。課題組在2013年得到這個規(guī)律后，多年來都在嘗試遵循一種科學(xué)規(guī)范過程建立科學(xué)適宜的標準，本文就是中藥生物活性測定方法設(shè)計方面的一種探索。

3.1 生物活性測定方法建立的第一步是進行劑量-效應(yīng)曲線的全面考察生物檢定方法的統(tǒng)計前提是不同劑量之間的生物效應(yīng)值存在顯著差異、測定的效應(yīng)值的決定性因素主要是劑量不同。劑量-效應(yīng)曲線的全面考察需要了解的信息主要有3點：

一是曲線的極值(或者說范圍)的了解，所有的藥理效應(yīng)都是S型或反S型的曲線,針對曲線需要了解的極值信息有：效應(yīng)的最大值和最小值，高平臺期和低平臺期對應(yīng)的劑量范圍，最高效應(yīng)和最低效應(yīng)的差值，接近最高平臺期和最低平臺期的劑量差距范圍，以及S型曲線是否對稱。二是劑量-效應(yīng)曲線的最佳擬合方程。三是測定效應(yīng)值的方差齊性檢驗，方差不齊的應(yīng)通過數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，包括對數(shù)轉(zhuǎn)換、倒數(shù)轉(zhuǎn)換等，找到計算出方差齊性的轉(zhuǎn)換方法。

本文采用螞蟥和水蛭多批次樣品，進行了多次不同劑量浸提液-APTT值的測定，對劑量-效應(yīng)的曲線特征的3點信息都有了明確的了解。一是極值，對螞蟥來說存在APTT的平臺期，劑量不得太大，APTT值也不能太高，在螞蟥的極值范圍內(nèi)，日本醫(yī)蛭具有同樣的劑量-效應(yīng)特點但沒有極值，說明方法設(shè)計應(yīng)考慮螞蟥的APTT測定平臺期的影響，也最好有能夠區(qū)分螞蟥和日本醫(yī)蛭的統(tǒng)計方法。二是最佳擬合方程，本文嘗試了APTT值、APTT對數(shù)值、劑量值、劑量對數(shù)，組合起來為4種擬合方法，基本明確在較低劑量時APTT對數(shù)值與水蛭濃度(包括水蛭濃度為零)的直線關(guān)系顯著性最好。三是經(jīng)過多次測定的方差齊性分析表明，各劑量之間的APTT對數(shù)值誤差符合正態(tài)分布，APTT值各劑量之間的方差是不相同的，說明APTT對數(shù)值的影響因素才主要是水蛭的劑量。

劑量-效應(yīng)曲線考察后，可以確定的有：Y值應(yīng)該采用APTT對數(shù)值，APTT值測定注意平臺期，X值可以選擇劑量、或者劑量的對數(shù)。但是劑量取對數(shù)后，螞蟥因平臺期劑量范圍比較小，日本醫(yī)蛭在不同批次之間因活性差異平行性并不是很好，課題組一直嘗試采用量反應(yīng)平行線法進行測定，當(dāng)時一直認為采用廣泛使用的量反應(yīng)平行線法是最可能的方法，未進行更多的曲線擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品之間時常出現(xiàn)方法學(xué)不成立，幾年的時間內(nèi)方法學(xué)研究都無法完整完成。當(dāng)采用規(guī)范的方法進行多種曲線模擬的時候，發(fā)現(xiàn)APTT平臺期下最適宜的擬合曲線是劑量-APTT對數(shù)，采用量反應(yīng)平行線不是最佳的方法，符合劑量-效應(yīng)曲線特征的最佳方法可能是斜率比法。因此，本文研究過程也說明了生物檢定方法建立的過程中遵循科學(xué)規(guī)范的重要性。

3.2 生物檢定方法建立的第二步是確定劑量設(shè)計和誤差控制生物檢定法設(shè)計中有一個基本規(guī)律，在達到要求的準確度和精密度的前提下，應(yīng)優(yōu)選劑量多、實驗量小的設(shè)計。斜率比法屬于量反應(yīng)檢定法，常見的有具有空白對照的(1·k·k)法和沒有空白對照的(k·k)法。根據(jù)水蛭的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，本法可以在APTT延長到空白對照的2～3倍的劑量區(qū)間設(shè)置3劑量，因此選擇的實驗設(shè)計為(1·3·3)法，樣品和標準品設(shè)計3個劑量，高劑量一般在10～30 mg之間。依據(jù)斜率比法的統(tǒng)計原理，零劑量和3個劑量的4個數(shù)應(yīng)成為等差數(shù)列。本文設(shè)計的(1·3·3)法，要求的可信限率(FL%)不得大于15%，每個劑量的實驗次數(shù)m值不小于2即可達到，也即試驗中配制6個濃度待測液，測定14個APTT值即可，測定工作效率精度均比較好。假設(shè)采用(2·2)法，因方法學(xué)成立統(tǒng)計和可信限率要求，實際需要的APTT測定次數(shù)可能更多；而采用(4·4)法，高劑量容易遇到平臺期導(dǎo)致方法學(xué)不成立；綜合來看，采用(1·3·3)是最佳方法。

生物檢定法是定量藥理學(xué)實驗，誤差控制的基本原則是要求實驗操作的平行性。例如，需要注意樣品配制、稀釋等實驗各個步驟對照品和供試品的平行性，盡量保證相同濃度的標準品和供試品稀釋液的測定時間接近。測定中建議使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的順序進行測定，當(dāng)各劑量反應(yīng)個數(shù)比較多時，可重復(fù)推薦的順序。

劑量設(shè)計中還有一個考慮點，即方法最可能成立的劑量在哪個范圍。生物檢定方法的標準中，一般會推薦劑量，那就是因為在方法建立的研究過程中，已經(jīng)充分了解到劑量-效應(yīng)曲線的特征，選擇出了測定最靈敏的劑量范圍，不使用推薦的劑量非常容易出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)不成立或誤差大，例如肝素活性的顯色法就推薦了劑量范圍[7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，對照品的S1設(shè)置在5 g·L-1左右最適合，如果S1超過10 g·L-1則大劑量容易落在平臺期，方法學(xué)容易不通過。

3.3 生物檢定方法建立的第三步是確定進行預(yù)實驗或預(yù)測定，進一步發(fā)現(xiàn)方法的一些注意事項或方法特點在確定劑量設(shè)計和誤差控制后，應(yīng)制定標準操作規(guī)程草案，然后按照草案選擇樣品進行實驗，可以更好觀察到方法的特點，進一步細化方法的注意事項。

本文研究過程中，進行曲線考察時注意到劑量-APTT對數(shù)的曲線是經(jīng)過0濃度的，初設(shè)方法是(1·3·3)法包括空白對照，希望通過空白對照的顯著性檢驗來減少實驗誤差。但在實際的樣品測定中，發(fā)現(xiàn)空白對照對測定值是沒有影響，而因為樣品是加入水蛭而對照中加入的是氯化鈉注射液，反而會出現(xiàn)空白的顯著性差異，因此在統(tǒng)計學(xué)要求中不再要求空白對照的顯著性不得出現(xiàn)差異，操作的誤差控制要求兩個空白對照不得出現(xiàn)顯著差異即可。

本文在進行樣品預(yù)測定過程中，還發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭采用螞蟥對照藥材來進行測定會出現(xiàn)截距的顯著差異而方法學(xué)不成立，說明本法能夠區(qū)分日本醫(yī)蛭和螞蟥是不同質(zhì)的，方法的專屬性好，進一步證明了斜率比法測定水蛭抗凝血活性是科學(xué)的。而采用菲牛蛭對照藥材做對照，測定日本醫(yī)蛭的抗凝血活性，4批樣品雖然活性差異較大但斜率比法的方法學(xué)統(tǒng)計均成立，說明日本醫(yī)蛭和螞蟥均可以采用斜率比法進行活性控制，只不過需要采用各自的對照藥材。

3.4 下一步的方法學(xué)研究實驗設(shè)計是生物活性測定成敗的關(guān)鍵所在[8]。本文的研究過程，說明了劑量-效應(yīng)曲線應(yīng)當(dāng)遵循一定的規(guī)范進行充分考察，這也是找到最佳實驗設(shè)計的重要步驟。當(dāng)然生物檢定方法種類非常多，本文敘述的過程在具體的實例中可能會有所不同。

在生物檢定方法基本建立之后，需要繼續(xù)遵循規(guī)范進行實驗室內(nèi)的方法學(xué)考察，包括專屬性、精密度、準確性等，對中藥生物活性測定方法來說，進行實驗室間的聯(lián)合驗證尤為關(guān)鍵，只有多家實驗室均能夠重現(xiàn)的方法，測定結(jié)果的精密度符合要求，才有可能成為在標準中實際運用的方法。