肖斯婷，胡宇馳，郭玉東，許華玉，楊文良，李 波

(1. 北京市藥品檢驗(yàn)研究院、國家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206; 2.國家藥典委員會(huì)，北京 100061; 3.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

水蛭是收載入《中國藥典》的典型活血化瘀藥物，其功能主治為破血通經(jīng)、逐瘀消癥[1]。已有的研究證明，水蛭活性有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué)、促進(jìn)纖溶等，抗凝血是其最顯著的藥理作用[2]。研究證實(shí)，水蛭有縮短活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)的作用,在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)均具有規(guī)律的一致性[3-4]。測(cè)定水蛭加入血漿后APTT的延長情況，可能是量化測(cè)定水蛭抗凝血活性質(zhì)量控制的研究方向，命名為抗凝血活性測(cè)定法。

本文進(jìn)行兔血漿-APTT法測(cè)定水蛭抗凝血活性的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)研究，先進(jìn)行劑量-效應(yīng)曲線考察，統(tǒng)計(jì)分析后選擇測(cè)定方法的統(tǒng)計(jì)模型，并進(jìn)行樣品的預(yù)測(cè)定，探索出可行的量化測(cè)定水蛭抗凝血活性的方法體系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑螞蟥飲片，由北京康而福藥業(yè)有限公司提供3批，批號(hào)分別為：20171201、20171202、20171203，采用冰凍粉碎機(jī)粉碎成100目碎末。日本醫(yī)蛭藥材，由貴州信邦制藥股份有限公司提供4批，批號(hào)分別為：20171001、20171002、20170902、20170901。螞蟥對(duì)照藥材，批號(hào)：121061-201806，購自中國食品藥品檢定研究院。菲牛蛭對(duì)照藥材，批號(hào)：121754-201901，購自中國食品藥品檢定研究院。APTT試劑，由Instrumentation Laboratory Co儀器實(shí)驗(yàn)公司生產(chǎn)，批號(hào)：N0394780。枸櫞酸鈉購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器全自動(dòng)血液凝固分析儀，ACLELTTE PRO，Instrumentation Laboratory Company。

1.3 動(dòng)物與血漿日本大耳白家兔，購自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0006。家兔頸總動(dòng)脈取血，3.2%枸櫞酸鈉1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1離心15 min制備血漿，將多只(3只以上)兔血漿混勻，備用。

1.4 浸提液制備與APTT值測(cè)定精密稱取螞蟥藥材、日本醫(yī)蛭藥材以及螞蟥、菲牛蛭和土鱉蟲對(duì)照藥材，加0.9%氯化鈉注射液，4 ℃浸提30 min，5 000 r·min-1離心20 min，取0.1 mg·L-1上清液，再加0.9%氯化鈉注射液稀釋配制成不同濃度的浸提液，采用全自動(dòng)血凝儀和家兔血漿，測(cè)定不同濃度浸提液的APTT值。反應(yīng)體系：20 μL不同濃度水蛭浸提液，兔血漿50 μL，APTT試劑50 μL，混勻，37 ℃±0.5 ℃預(yù)溫180 s，每管再加入CaCl2試劑50 μL，測(cè)定凝結(jié)時(shí)間。

1.6 測(cè)定值方差齊性分析采用1批菲牛蛭對(duì)照藥材，配制成0、5、10、20、30、50 g·L-1，在同一臺(tái)血凝儀上分別測(cè)定6次APTT值，對(duì)APTT和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的APTT進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，分析在何種情況下測(cè)定值之間出現(xiàn)方差齊性。

1.7 測(cè)定體系的選擇根據(jù)劑量效應(yīng)值曲線呈現(xiàn)直線的劑量范圍和測(cè)定值處理值，選擇測(cè)定值方差齊性的處理模式，按照專屬性好、精密度符合要求、實(shí)驗(yàn)量少的原則確定最佳的實(shí)驗(yàn)體系。

1.8 樣品預(yù)測(cè)定采用對(duì)照藥材作對(duì)照品，按照選定的測(cè)定體系，平行制備對(duì)照藥材和藥材樣品的浸提液，平行測(cè)定多劑量APTT值，按照預(yù)先編制的符合要求的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行生物活性測(cè)定統(tǒng)計(jì)，觀察曲線的特征是否符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，初步判定測(cè)定體系的適宜性。

2 結(jié)果

2.1 劑量效應(yīng)曲線特征考察4批日本醫(yī)蛭和3批螞蟥藥材，不同濃度浸提液測(cè)定APTT數(shù)據(jù)列表如下。

日本醫(yī)蛭制備浸提液后，隨濃度的升高離體血漿的APTT值不斷延長，有明顯的量效關(guān)系。日本醫(yī)蛭的作用較強(qiáng)，有的批次在0.05 kg·L-1或0.08 kg·L-1即超出了全自動(dòng)血凝儀測(cè)定上限299 s；同時(shí)，不同批次之間的作用強(qiáng)度有較大差異。

Tab 1 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 2 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 3 Concentration -APTT determination data of 2 batches of leech extract

螞蟥制備浸提液后，隨濃度的升高離體血漿的APTT值也不斷延長，有明顯的量效關(guān)系。但螞蟥的延長作用較日本醫(yī)蛭弱，且APTT延長到一定濃度后延長不明顯，說明螞蟥延長APTT值有一定的上限。 對(duì)上述7批樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，以濃度為X軸(kg·L-1)，APTT值為Y軸(s)，結(jié)果見Fig 1。日本醫(yī)蛭和螞蟥的曲線有明顯不同，日本醫(yī)蛭能夠?qū)PTT值延長到超過儀器測(cè)定上限，而螞蟥的浸提液APTT延長到一定程度后會(huì)有平臺(tái)期。由Fig 1可見，日本醫(yī)蛭和螞蟥藥材的濃度-APTT，均不是直線，回歸相關(guān)性較差。

Fig 1 Concentration-APTT curve of leeches

對(duì)上述的7批藥材樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)，以濃度為X軸(kg·L-1)，以APTT值的對(duì)數(shù)值為Y軸，結(jié)果見Fig 2。可見4批日本醫(yī)蛭明顯成為一條直線，而螞蟥有反應(yīng)平臺(tái)值，初步觀察并同通過曲線擬合，可見螞蟥0.025 kg·L-1前呈現(xiàn)直線關(guān)系，見Fig 3。以濃度對(duì)數(shù)為X軸(kg·L-1)，以APTT值為Y軸，結(jié)果見Fig 4?？梢?批日本醫(yī)蛭和螞蟥的曲線均不是直線，R2值小于0.9，兩者特征有明顯不同。以濃度的對(duì)數(shù)為X軸(kg·L-1)，以APTT值的對(duì)數(shù)為Y軸，結(jié)果見Fig 5?？梢?批日本醫(yī)蛭數(shù)據(jù)接近直線，3批螞蟥的數(shù)據(jù)不是直線，而低劑量下曲線接近直線。

課題組歸納出一些具體的學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)方法，如自主學(xué)習(xí)、問題學(xué)習(xí)、開放學(xué)習(xí)、案例學(xué)習(xí)、課題學(xué)習(xí)和網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)等方法[3]，增強(qiáng)學(xué)生探究和體驗(yàn)的機(jī)會(huì)。

Fig 2 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches

Fig 3 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches (concentration 0～0.025 kg·L-1)

Fig 4 Log-APTT curve of concentration of leeches

Fig 5 Log-APTT log curve of concentration of leeches

采用螞蟥、菲牛蛭和土鱉蟲對(duì)照藥材進(jìn)行一系列濃度的APTT值測(cè)定，繪制曲線，螞蟥對(duì)照藥材的曲線特征與3批螞蟥藥材相似，菲牛蛭對(duì)照藥材的曲線特征與4批日本醫(yī)蛭藥材樣品相似，濃度與APTT的對(duì)數(shù)作圖見Fig 6。由Fig 6可見，螞蟥對(duì)照藥材的濃度與APTT的對(duì)數(shù)在低劑量時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且直線通過空白對(duì)照。菲牛蛭對(duì)照藥材的濃度與APTT的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且直線基本通過空白對(duì)照。土鱉蟲對(duì)照藥材無延長APTT的作用。從曲線考察結(jié)果來看，日本醫(yī)蛭適合采用斜率比法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，也可以采用量反應(yīng)平行線法；而螞蟥在低劑量時(shí)，適合采用斜率法和量反應(yīng)平行線法。

Fig 6 Logarithmic curve of concentration-APTT for leeches, Philippine cattle leeches and Trionyx sinensis

Fig 7 APTT logarithmic data points of different dosimetry

2.2 方差齊性分析結(jié)果將菲牛蛭對(duì)照藥材6個(gè)濃度浸提液分別測(cè)定6次APTT值列表，數(shù)據(jù)見Tab 4。對(duì)APTT值和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的APTT值，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果可見對(duì)數(shù)APTT值各劑量的標(biāo)準(zhǔn)差未出現(xiàn)顯著性差異(P=0.888)，APTT值各劑量之間的方差存在顯著差異(P=0.002)，方差分析結(jié)果見Tab 5。

Tab 4 APTT data of phellodendrine leeches at different doses

Tab 5 Test results of homogeneity of variance of APTT data measured at different doses(Test of homogeneity of variances)

2.3 活性測(cè)定體系的確定綜合7批藥材樣品和螞蟥對(duì)照藥材、菲牛蛭對(duì)照藥材的量效關(guān)系曲線分析來看，在低劑量情況下，測(cè)定體系符合以下斜率比模型的特征： ① 在劑量較低的情況下，APTT值測(cè)定沒有達(dá)到平臺(tái)期，日本醫(yī)蛭和螞蟥藥材的濃度-APTT對(duì)數(shù)值呈直線，且直線最終相交于零濃度。② 經(jīng)方差齊性分析，APTT值經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，APTT測(cè)定值呈正態(tài)分布；不同劑量間生物反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差不出現(xiàn)顯著性差異，說明主要影響因素是劑量的差異。③ 所有測(cè)定樣品的劑量范圍內(nèi)，至少有3個(gè)濃度的量-效關(guān)系滿足呈直線要求。因此，從數(shù)據(jù)來分析，可采用3劑量的斜率比法進(jìn)行水蛭抗凝血活性的測(cè)定。

斜率比法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立的條件應(yīng)至少滿足以下3點(diǎn)：① 回歸分析應(yīng)顯著，P值應(yīng)小于0.05，表明APTT測(cè)定結(jié)果隨劑量出現(xiàn)顯著差異。② 截距差異應(yīng)不顯著，P值應(yīng)大于0.05，表明樣品和對(duì)照品的曲線相交點(diǎn)在0濃度。③ 非線性應(yīng)不顯著，P值應(yīng)大于0.05，表明樣品和對(duì)照品的線性特征一致。

2.4 樣品預(yù)測(cè)定結(jié)果采用螞蟥對(duì)照藥材做標(biāo)準(zhǔn)品，分別對(duì)3批螞蟥和4批日本醫(yī)蛭制備浸提液，稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液，平行測(cè)定各劑量的APTT，將測(cè)定的APTT值輸入斜率比法計(jì)算模板，測(cè)定3批螞蟥和4批日本醫(yī)蛭相對(duì)于螞蟥對(duì)照藥效的相對(duì)效價(jià)，見Tab 6和Fig 8、9。

Tab 6 Statistics of slope ratio method for predicting anticoagulant activity of leeches

Fig 8 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

Fig 9 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

從預(yù)測(cè)定結(jié)果來看，以螞蟥對(duì)照藥材可以作為螞蟥的活性測(cè)定對(duì)照品來使用，實(shí)驗(yàn)均成立。但不能用來測(cè)定日本醫(yī)蛭的抗凝血活性，實(shí)驗(yàn)均不成立。

采用菲牛蛭對(duì)照藥材為標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)與4批日本醫(yī)蛭制備浸提液，稀釋成5、10、15 g·L-1濃度溶液，采用斜率比法計(jì)算模板計(jì)算4批日本醫(yī)蛭相對(duì)于菲牛蛭對(duì)照藥材的相對(duì)效價(jià)。見Fig 10和Tab 7。

Tab 7 Prediction results of leech anticoagulant activity by slope ratio method

Fig 10 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

3 討論

自《中國藥典》2010年版收載中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則以來，采用生物活性測(cè)定進(jìn)行中藥質(zhì)量控制越來越成為中藥研究者的共識(shí)，國家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心2020年發(fā)布了《中藥生物效應(yīng)檢測(cè)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[5],中藥標(biāo)準(zhǔn)中收載體現(xiàn)其臨床治療效應(yīng)的量化評(píng)價(jià)、整體評(píng)價(jià)也就成為了研究的熱點(diǎn)方向。國家藥典委員會(huì)也認(rèn)為，通過研究代表藥物的生物活性測(cè)定方法，建立科學(xué)、合理的生物活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，可以提升我國中藥質(zhì)量控制的總體能力，尤其是臨床大量運(yùn)用、具有我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)特點(diǎn)、基礎(chǔ)研究非常深入的活血化瘀類藥物是重點(diǎn)方向和可行方向[6]。但國家藥典委員會(huì)同時(shí)也指出，生物檢定方法在如何確認(rèn)和評(píng)價(jià)方法的適用性和準(zhǔn)確性方面存在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)進(jìn)行生物檢定方法的設(shè)計(jì)、開發(fā)及驗(yàn)證的關(guān)鍵技術(shù)研究，適當(dāng)時(shí)候制定指導(dǎo)原則[6]。水蛭在體內(nèi)和體外具有延長血漿APTT值的作用，體外延長APTT作用具有明顯的隨劑量增加而延長的作用，這是建立量化評(píng)價(jià)的生物活性質(zhì)控方法的最好基礎(chǔ)。課題組在2013年得到這個(gè)規(guī)律后，多年來都在嘗試遵循一種科學(xué)規(guī)范過程建立科學(xué)適宜的標(biāo)準(zhǔn)，本文就是中藥生物活性測(cè)定方法設(shè)計(jì)方面的一種探索。

3.1 生物活性測(cè)定方法建立的第一步是進(jìn)行劑量-效應(yīng)曲線的全面考察生物檢定方法的統(tǒng)計(jì)前提是不同劑量之間的生物效應(yīng)值存在顯著差異、測(cè)定的效應(yīng)值的決定性因素主要是劑量不同。劑量-效應(yīng)曲線的全面考察需要了解的信息主要有3點(diǎn)：

一是曲線的極值(或者說范圍)的了解，所有的藥理效應(yīng)都是S型或反S型的曲線,針對(duì)曲線需要了解的極值信息有：效應(yīng)的最大值和最小值，高平臺(tái)期和低平臺(tái)期對(duì)應(yīng)的劑量范圍，最高效應(yīng)和最低效應(yīng)的差值，接近最高平臺(tái)期和最低平臺(tái)期的劑量差距范圍，以及S型曲線是否對(duì)稱。二是劑量-效應(yīng)曲線的最佳擬合方程。三是測(cè)定效應(yīng)值的方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊的應(yīng)通過數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，包括對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換、倒數(shù)轉(zhuǎn)換等，找到計(jì)算出方差齊性的轉(zhuǎn)換方法。

本文采用螞蟥和水蛭多批次樣品，進(jìn)行了多次不同劑量浸提液-APTT值的測(cè)定，對(duì)劑量-效應(yīng)的曲線特征的3點(diǎn)信息都有了明確的了解。一是極值，對(duì)螞蟥來說存在APTT的平臺(tái)期，劑量不得太大，APTT值也不能太高，在螞蟥的極值范圍內(nèi)，日本醫(yī)蛭具有同樣的劑量-效應(yīng)特點(diǎn)但沒有極值，說明方法設(shè)計(jì)應(yīng)考慮螞蟥的APTT測(cè)定平臺(tái)期的影響，也最好有能夠區(qū)分螞蟥和日本醫(yī)蛭的統(tǒng)計(jì)方法。二是最佳擬合方程，本文嘗試了APTT值、APTT對(duì)數(shù)值、劑量值、劑量對(duì)數(shù)，組合起來為4種擬合方法，基本明確在較低劑量時(shí)APTT對(duì)數(shù)值與水蛭濃度(包括水蛭濃度為零)的直線關(guān)系顯著性最好。三是經(jīng)過多次測(cè)定的方差齊性分析表明，各劑量之間的APTT對(duì)數(shù)值誤差符合正態(tài)分布，APTT值各劑量之間的方差是不相同的，說明APTT對(duì)數(shù)值的影響因素才主要是水蛭的劑量。

劑量-效應(yīng)曲線考察后，可以確定的有：Y值應(yīng)該采用APTT對(duì)數(shù)值，APTT值測(cè)定注意平臺(tái)期，X值可以選擇劑量、或者劑量的對(duì)數(shù)。但是劑量取對(duì)數(shù)后，螞蟥因平臺(tái)期劑量范圍比較小，日本醫(yī)蛭在不同批次之間因活性差異平行性并不是很好，課題組一直嘗試采用量反應(yīng)平行線法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)時(shí)一直認(rèn)為采用廣泛使用的量反應(yīng)平行線法是最可能的方法，未進(jìn)行更多的曲線擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品之間時(shí)常出現(xiàn)方法學(xué)不成立，幾年的時(shí)間內(nèi)方法學(xué)研究都無法完整完成。當(dāng)采用規(guī)范的方法進(jìn)行多種曲線模擬的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)APTT平臺(tái)期下最適宜的擬合曲線是劑量-APTT對(duì)數(shù)，采用量反應(yīng)平行線不是最佳的方法，符合劑量-效應(yīng)曲線特征的最佳方法可能是斜率比法。因此，本文研究過程也說明了生物檢定方法建立的過程中遵循科學(xué)規(guī)范的重要性。

3.2 生物檢定方法建立的第二步是確定劑量設(shè)計(jì)和誤差控制生物檢定法設(shè)計(jì)中有一個(gè)基本規(guī)律，在達(dá)到要求的準(zhǔn)確度和精密度的前提下，應(yīng)優(yōu)選劑量多、實(shí)驗(yàn)量小的設(shè)計(jì)。斜率比法屬于量反應(yīng)檢定法，常見的有具有空白對(duì)照的(1·k·k)法和沒有空白對(duì)照的(k·k)法。根據(jù)水蛭的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，本法可以在APTT延長到空白對(duì)照的2～3倍的劑量區(qū)間設(shè)置3劑量，因此選擇的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為(1·3·3)法，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)計(jì)3個(gè)劑量，高劑量一般在10～30 mg之間。依據(jù)斜率比法的統(tǒng)計(jì)原理，零劑量和3個(gè)劑量的4個(gè)數(shù)應(yīng)成為等差數(shù)列。本文設(shè)計(jì)的(1·3·3)法，要求的可信限率(FL%)不得大于15%，每個(gè)劑量的實(shí)驗(yàn)次數(shù)m值不小于2即可達(dá)到，也即試驗(yàn)中配制6個(gè)濃度待測(cè)液，測(cè)定14個(gè)APTT值即可，測(cè)定工作效率精度均比較好。假設(shè)采用(2·2)法，因方法學(xué)成立統(tǒng)計(jì)和可信限率要求，實(shí)際需要的APTT測(cè)定次數(shù)可能更多；而采用(4·4)法，高劑量容易遇到平臺(tái)期導(dǎo)致方法學(xué)不成立；綜合來看，采用(1·3·3)是最佳方法。

生物檢定法是定量藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，誤差控制的基本原則是要求實(shí)驗(yàn)操作的平行性。例如，需要注意樣品配制、稀釋等實(shí)驗(yàn)各個(gè)步驟對(duì)照品和供試品的平行性，盡量保證相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品稀釋液的測(cè)定時(shí)間接近。測(cè)定中建議使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的順序進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)各劑量反應(yīng)個(gè)數(shù)比較多時(shí)，可重復(fù)推薦的順序。

劑量設(shè)計(jì)中還有一個(gè)考慮點(diǎn)，即方法最可能成立的劑量在哪個(gè)范圍。生物檢定方法的標(biāo)準(zhǔn)中，一般會(huì)推薦劑量，那就是因?yàn)樵诜椒ń⒌难芯窟^程中，已經(jīng)充分了解到劑量-效應(yīng)曲線的特征，選擇出了測(cè)定最靈敏的劑量范圍，不使用推薦的劑量非常容易出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)不成立或誤差大，例如肝素活性的顯色法就推薦了劑量范圍[7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照品的S1設(shè)置在5 g·L-1左右最適合，如果S1超過10 g·L-1則大劑量容易落在平臺(tái)期，方法學(xué)容易不通過。

3.3 生物檢定方法建立的第三步是確定進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)或預(yù)測(cè)定，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)方法的一些注意事項(xiàng)或方法特點(diǎn)在確定劑量設(shè)計(jì)和誤差控制后，應(yīng)制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程草案，然后按照草案選擇樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以更好觀察到方法的特點(diǎn)，進(jìn)一步細(xì)化方法的注意事項(xiàng)。

本文研究過程中，進(jìn)行曲線考察時(shí)注意到劑量-APTT對(duì)數(shù)的曲線是經(jīng)過0濃度的，初設(shè)方法是(1·3·3)法包括空白對(duì)照，希望通過空白對(duì)照的顯著性檢驗(yàn)來減少實(shí)驗(yàn)誤差。但在實(shí)際的樣品測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照對(duì)測(cè)定值是沒有影響，而因?yàn)闃悠肥羌尤胨味鴮?duì)照中加入的是氯化鈉注射液，反而會(huì)出現(xiàn)空白的顯著性差異，因此在統(tǒng)計(jì)學(xué)要求中不再要求空白對(duì)照的顯著性不得出現(xiàn)差異，操作的誤差控制要求兩個(gè)空白對(duì)照不得出現(xiàn)顯著差異即可。

本文在進(jìn)行樣品預(yù)測(cè)定過程中，還發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭采用螞蟥對(duì)照藥材來進(jìn)行測(cè)定會(huì)出現(xiàn)截距的顯著差異而方法學(xué)不成立，說明本法能夠區(qū)分日本醫(yī)蛭和螞蟥是不同質(zhì)的，方法的專屬性好，進(jìn)一步證明了斜率比法測(cè)定水蛭抗凝血活性是科學(xué)的。而采用菲牛蛭對(duì)照藥材做對(duì)照，測(cè)定日本醫(yī)蛭的抗凝血活性，4批樣品雖然活性差異較大但斜率比法的方法學(xué)統(tǒng)計(jì)均成立，說明日本醫(yī)蛭和螞蟥均可以采用斜率比法進(jìn)行活性控制，只不過需要采用各自的對(duì)照藥材。

3.4 下一步的方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是生物活性測(cè)定成敗的關(guān)鍵所在[8]。本文的研究過程，說明了劑量-效應(yīng)曲線應(yīng)當(dāng)遵循一定的規(guī)范進(jìn)行充分考察，這也是找到最佳實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要步驟。當(dāng)然生物檢定方法種類非常多，本文敘述的過程在具體的實(shí)例中可能會(huì)有所不同。

在生物檢定方法基本建立之后，需要繼續(xù)遵循規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的方法學(xué)考察，包括專屬性、精密度、準(zhǔn)確性等，對(duì)中藥生物活性測(cè)定方法來說，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間的聯(lián)合驗(yàn)證尤為關(guān)鍵，只有多家實(shí)驗(yàn)室均能夠重現(xiàn)的方法，測(cè)定結(jié)果的精密度符合要求，才有可能成為在標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)際運(yùn)用的方法。