柏 遠，陳 曉，李 竣，史建勛，黃先菊

(1. 中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074；2. 湖北藥昇中藥科技有限公司，湖北 棗陽 441200；3. 浙江醫(yī)藥高等?？茖W校，浙江 寧波 315100)

藏藥唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf為藏藥珍稀藥材，藏藥名為榜嘎，主要分布在中國青海、甘肅、西藏等高海拔地區(qū)，是藏藥成方制劑中常用的藥材，在藏醫(yī)藥中已使用了數(shù)千年的歷史，深受各族人民的喜愛。本品性涼，味苦，具有清熱解毒，生肌收口，燥濕之功效。其用于多種藏藥成方制劑中，主治清熱解毒，主要用于肝熱、膽熱、肺熱、肝炎、肺炎、胃腸炎、流行性感冒、傳染病引起的發(fā)燒、食物中毒、蛇蝎咬傷以及黃水病[1]。現(xiàn)代研究表明，榜嘎具有抗炎、抗病毒等藥理活性[2]。

榜嘎化學成分主要以生物堿類和黃酮苷化合物為主。從榜嘎中分離得到的生物堿成分主要分為二萜類和苯丙胺類生物堿。目前，二萜類生物堿被認為是榜嘎發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分[3]。據(jù)報道，阿替新(Atisine)和異葉烏頭堿(Heteratisine)在榜嘎中的含量分別為0.084%和0.066%[4]；大麥芽堿含量為0.0238%[5]。唐古特烏頭在藏藥中應用廣泛而且極為重要，在藏醫(yī)臨床應用方面，唐古特烏頭同樣發(fā)揮了舉足輕重的作用，尤其是在冠狀病毒防治上。在疫情爆發(fā)之初，西藏、青海等傳承藏醫(yī)藥的省份就紛紛在防治方案中提到十二味翼首散、二十五味肺病膠囊、流感丸、二十五味主藥散等藏醫(yī)傳統(tǒng)藥物唐古特烏頭的成方制劑，其中十二味翼首散早在“非典”時期就被廣泛應用，對于藏醫(yī)“年然”(意為疫病)引發(fā)的“炎癥風暴”有著很好的防治作用，豐富了藏醫(yī)藥在治療冠狀病毒肺炎的應用[6]。雖然唐古特烏頭在“炎癥風暴”治療領(lǐng)域做出了重要的貢獻，但是目前仍缺乏其發(fā)揮治療作用時系統(tǒng)的作用機制，所以，系統(tǒng)深入探索唐古特烏頭抗炎作用機制顯得尤為重要。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門新興學科，涉及構(gòu)建疾病表型、基因和藥物的多層網(wǎng)絡(luò)[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學有助于預測藥物靶點、作用方式和相關(guān)通路?？紤]到民族藥成分和功能的復雜性，網(wǎng)絡(luò)藥理學被認為是識別關(guān)鍵靶點和信號通路的有效方法[8]。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病相聯(lián)系，結(jié)合民族藥物成分靶點網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，從多個成分、靶點甚至多個通路預測民族藥物作用于相關(guān)疾病的成分靶點和潛在作用機制；運用分子對接技術(shù)挖掘唐古特烏頭活性成分抗炎的特異性及可能性；并且通過體外細胞實驗驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接預測結(jié)果。旨在系統(tǒng)闡述藏藥唐古特烏頭抗炎作用所涉及機制，為唐古特烏頭的臨床研究及潛在抗炎藥物的發(fā)掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 唐古特烏頭的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

1.1.1唐古特烏頭活性成分的靶點預測 通過文獻檢索、實驗室前期研究等方法收集唐古特烏頭的主要單體化學成分。使用PubChem數(shù)據(jù)庫[9](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissTarget Prediction平臺(http：//www.swisstargetprediction.ch/)尋找唐古特烏頭活性成分的相關(guān)靶點。

1.1.2唐古特烏頭抗炎的作用靶點預測及核心靶點篩選 使用GeneCards(https：//www.genecards.org/)、Omin(https：//www.omim.org/)以及PHARMGKB(https：//www.pharmgkb.org/)疾病靶點數(shù)據(jù)庫，以“anti-inflammatory”、“inflammation”為關(guān)鍵詞進行檢索，并刪除重復的基因。將唐古特烏頭活性成分靶點和抗炎相關(guān)靶點導入Cytoscape Version 3.8.2軟件，兩者進行對比取交集，得出共同靶點，即為唐古特烏頭抗炎的相關(guān)靶點。將共同靶點Degree參數(shù)值進行排序，以高于中位數(shù)的2倍為條件，即得出共同靶點中的核心靶點。

1.1.3唐古特烏頭抗炎作用的靶標蛋白之間的相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將收集到的共同靶點導入到STRING數(shù)據(jù)庫[10](https：//www.string-db.org/)，設(shè)置物種及最高置信度為合適參數(shù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape Version 3. 8. 2軟件將唐古特烏頭的成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖進行呈現(xiàn)。

1.1.4富集分析 將活性成分與疾病的交集基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)中進行基因本體論(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析[11]，通過GO富集獲得靶點基因在體內(nèi)可能涉及的細胞組分(cellular component，CC)、參與的分子功能(molecular function，MF)及其涉及到的生物學過程(biological process，BP)，從而綜合分析得到這些基因的生物學功能；通過KEGG通路富集靶點所涉及的信號通路，以P<0.05為篩選標準，分析唐古特烏頭抗炎的主要信號通路及生物過程。利用微生信平臺，對GO富集與KEGG富集結(jié)果進行可視化呈現(xiàn)。

1.1.5成分靶點分子對接 以“1.3”項下篩選出的部分核心靶點為受體，通過PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www1.rcsb.org/)查找受體的3D結(jié)構(gòu)文件[12]；以“1.1”項下收集到的唐古特烏頭化學成分中二萜類生物堿活性成分為配體，利用PubChem數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站導出配體的3D結(jié)構(gòu)文件[9，13]；通過AutoDock Vina(1.1.2 版本)軟件進行分子對接，并用PyMOL軟件將對接結(jié)果進行可視化。

1.2 體外細胞實驗

1.2.1主要試劑與儀器 脂多糖(lipopoly saccharide，LPS)，美國Sigma公司；噻唑藍 ([3- (4，5-Dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT)，Biosharp公司；胎牛血清(FBS)，杭州天杭生物科技股份有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Gibco公司；NO檢測試劑盒，碧云天生物有限公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑盒，天根公司；ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR和TB GreenTMPremix Ex TaqTM，武漢愛博泰克生物科技有限公司；熒光定量PCR儀(BD公司，美國)，多功能酶標儀(TECAN)。其它試劑均為分析純。

1.2.2唐古特烏頭醇提物的制備 取干燥的唐古特烏頭(標本號：LQE-2019-066)地上部分15 kg，粉碎，過30號篩，用5倍量的體積分數(shù)為0.97的乙醇常溫浸泡24 h，反復6次，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，得唐古特烏頭醇提物(ATS)。

1.2.3唐古特烏頭醇提物(ATS)化學成分的鑒別 使用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)對唐古特烏頭醇提物中部分化學成分進行鑒別，精密稱取ATS 0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后即得0.1 kg·L-1的溶液；精密稱取2 mg苯甲酰異葉烏頭堿(6-Benzoylheteratisine)對照品和關(guān)附甲素(Guan-Fu Base A)對照品，分別置于10 mL容量瓶中，同時精密稱取20 mg異葉烏頭堿(Heteratisine)對照品置于2 mL容量瓶中，將上述對照品加甲醇溶解并定容，搖勻。臨用前，將已定容的樣品溶液和標準對照品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀。

1.2.4細胞培養(yǎng)與給藥濃度確定 RAW264.7小鼠巨噬細胞，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(CTCC)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。將RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至細胞對數(shù)生長期。分別以終濃度為3.125-200 mg·L-1ATS孵育細胞24 h，MTT法檢測細胞活力，確定給藥濃度范圍。

1.2.5唐古特烏頭抗炎藥效評價 將RAW264.7細胞按每孔100 μL接種在96孔板中，分別加入0.01～5 mg·L-1的ATS孵育2 h，再加入LPS(1 mg·L-1)孵育24 h，另外設(shè)置空白對照組和模型組(LPS 1 mg·L-1)，每組6個復孔。細胞給藥結(jié)束后，每孔收集細胞上清液50 μL置于新的96孔板中，用Griess法試劑盒測定給藥組及模型組NO釋放量，并計算抑制率。

抑制率/%=(模型組OD-給藥組OD)/(模型組OD-空白組OD)×100%

1.2.6炎癥通路相關(guān)基因水平的檢測 采用實時熒光定量RT-PCR方法，以GAPDH作為參照基因，檢測iNOS及相關(guān)通路基因的mRNA相對于內(nèi)參的表達水平。使用TRIzol試劑收集細胞樣本，提取總RNA。試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增體系如下：Stage 1 DNA聚合酶95 ℃預熱變性，40 s；Stage 2 循環(huán)體系95 ℃，15 s，58 ℃ 1 min中循環(huán)40次。相關(guān)基因擴增的引物序列如下：GAPDH：5′-ACCCAGA-AGACTGTGGATGG-3′(fw)，5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′(rw)；JAK2：5′-TTGTGGTATTACGCCTGTGTATC-3′(fw)，5′-ATGCCTGGTTGACTCGTCTAT-3′(rw)；AKT1：5′-CTTTATTGGCTACAAGGAACGG-3′(fw)，5′-CAGTCTGAATGGCGGTGGT-3′(rw)；iNOS：5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′(fw)；5′-AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′(rw)。

2 結(jié)果

2.1 唐古特烏頭主要活性成分及靶點篩選基于文獻檢索唐古特烏頭的化學成分并根據(jù)本實驗室前期研究獲得唐古特烏頭的主要活性成分17個。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫、SwissTarget Prediction 平臺檢索預測唐古特烏頭活性成分的相關(guān)靶點，一共獲得450個預測靶點。唐古特烏頭主要活性成分信息見Tab 1。

Tab 1 Basic information of 17 compounds of Aconitum tanguticum

2.2 唐古特烏頭抗炎的核心靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建基于GeneCards、Omin 以及PHARMGKB 數(shù)據(jù)庫共篩選出疾病相關(guān)基因靶點349 6個，將上述450個活性成分靶點與349 6個疾病靶點取交集得到284個共同靶點，將收集到的共同靶點導入到STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取靶標蛋白之間相互作用(PPI)數(shù)據(jù)，以degree參數(shù)值為篩選條件，篩選得到AKT1、JAK2、MAPK1、MAPK3、TNF、STAT3、SRC、EGFR 等37個核心靶點，使用Cytoscape Version 3. 8. 2 軟件進行可視化，其中節(jié)點的大小及顏色的深淺變化代表Degree 值的大小，見Fig 1。這些基因有可能是唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的潛在作用靶點。利用Cytoscape Version 3. 8. 2 軟件呈現(xiàn)出唐古特烏頭抗炎的“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見Fig 2。

Fig 1 The PPI network map of target protein

Fig 2 Network of “ingredient-target-disease”

2.3 GO 分析和KEGG 通路富集分析將活性成分與疾病的共同靶基因?qū)氲紻AVID數(shù)據(jù)庫中進行富集分析，以P<0.05為條件，對共同靶基因進行GO的CC、MF和BP分析，得到CC條目68個，MF條目129個，BP條目474個。選取所含靶點數(shù)目在前10個的CC和MF條目，前20個的BP條目，利用微生信平臺進行結(jié)果呈現(xiàn)，見Fig 3。結(jié)果顯示，在細胞組分中，細胞質(zhì)膜、細胞質(zhì)基質(zhì)、胞質(zhì)、細胞核占較大比例；分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等功能；生物過程主要涉及參與信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)磷酸化、對藥物的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應、凋亡過程的負調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控等生物學過程。同樣的，以P<0.05為條件，對共同靶基因進行KEGG通路富集分析，得到相關(guān)通路108條，選取所含靶點數(shù)目在前15條的通路，利用微生信平臺進行結(jié)果呈現(xiàn)，見Fig 4。結(jié)果顯示唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用可能與PI3K-Akt、Ras、MAPK、HIF-1等信號通路及一些癌癥信號通路有關(guān)。

Fig 3 GO function enrichment analysis

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子對接結(jié)果利用AutoDock Vina(1.1.2版本)軟件預測配體與受體結(jié)合的Vina得分，一般認為，Vina得分越低，表明受體和配體親和力越高，對接活性越大，發(fā)生作用的可能性越大。將配體和受體的3D結(jié)構(gòu)在AutoDock Vina中進行分子對接，結(jié)果見Tab 2。唐古特烏頭活性成分與所對接的核心靶點均具有較高的親和力，通過KEGG通路富集分析預測的PI3K-Akt 信號通路中的關(guān)鍵靶點AKT1，JAK2也與唐古特烏頭關(guān)鍵藥效成分具有較大的對接活性。故選取AKT1，JAK2與部分活性成分的對接圖進行展示，如Fig 5。

Tab 2 Vina score of core compounds with key target

Fig 5 Molecular docking of AKT1 and JAK2 with compounds

2.5 化學成分鑒別HPLC分析表明唐古特烏頭醇提物(ATS)中含有6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Heteratisine這3種單體成分，見Tab 3。

Tab 3 HPLC chromatograms of standards and ATS

2.6 體外細胞實驗

2.6.1唐古特烏頭對RAW264.7細胞增殖的影響 采用MTT法考察不同濃度唐古特烏頭醇提物(ATS)處理后RAW264.7細胞增殖活性的影響，見Fig 6。與正常對照組比較，ATS在給藥濃度為0～50 mg·L-1時對細胞增殖活性無明顯抑制作用。后續(xù)選用0.01～5 mg·L-1濃度范圍進行藥效學實驗。

Fig 6 Effect of Aconitum tanguticum on cell viability of NC：normal control，**P<0.01 vs normal control

2.6.2唐古特烏頭對RAW264.7細胞NO釋放量及相關(guān)基因mRNA水平的影響 如Fig 7(A)所示，LPS作用于RAW264.7細胞，細胞上清液中NO的釋放量明顯升高，與正常對照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，說明已經(jīng)成功建立LPS誘導RAW264.7細胞的炎癥模型，與LPS組相比，ATS各濃度細胞上清液中的NO含量明顯降低(P<0.01、P<0.05)。如Fig 7(B)所示，在未加LPS刺激的正常組細胞中，iNOS mRNA 表達量較少。與正常組比較，LPS可以使iNOS mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.01)，ATS(0.01、0.5 mg·L-1)可以不同程度的下調(diào)iNOS mRNA表達(與LPS組比較，P<0.01)。表明ATS具有較好的抗炎作用，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學預測唐古特烏頭可以通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)通路發(fā)揮抗炎作用的預測相一致。通過RT-PCR法檢測PI3K-Akt 信號通路中的關(guān)鍵靶點AKT1、JAK2基因的相對表達量，結(jié)果表明，與正常組相比，LPS組中的AKT1、JAK2表達均明顯上升(P<0.01)，在經(jīng)過ATS治療后，AKT1、JAK2表達均表現(xiàn)為不同程度的下降(P<0.01、P<0.05)，見Fig 7(C，D)。說明唐古特烏頭可以通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路進而發(fā)揮抗炎作用，與網(wǎng)絡(luò)藥理學預測結(jié)果基本一致。

Fig 7 Effect of Aconitum tanguticum on LPS-induced AKT1，JAK2 mRNA levels in RAW264.7 cells NC：normal control，##P<0.01 vs normal control；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS

3 討論

唐古特烏頭是民族地區(qū)的常用藥材，具有清熱解毒、祛風止痛的功效。國內(nèi)外學者對唐古特烏頭化學成分進行了大量的研究，現(xiàn)代研究表明，其提取物在抗病毒及抗腫瘤等方面顯示有較好的活性。Fan等[14]從甘青烏頭中分離出多種二萜生物堿，并對其中兩種化合物對H1N1誘導細胞病變的抑制作用進行評估，結(jié)果表明這兩種化合物均表現(xiàn)出對病變的抑制作用；張春江等[15]等通過體外細胞培養(yǎng)和小鼠腦炎模型試驗綜合評價了唐古特烏頭醇提物對單純皰疹病毒II型(HSV-2)的抑制作用，實驗結(jié)果表明其可能是通過直接滅活病毒起到抗病毒的作用的；Li等[16]還從甘青烏頭地上部分首次分離得到Tangutidines A～C等3個生物堿，細胞毒性實驗顯示這3個生物堿均具有較低細胞毒性，這也與唐古特烏頭在藏醫(yī)藥認為“白烏頭性涼無毒”的描述相一致；在唐古特烏頭中分離出的naviculine A被證明對人腸腺癌(LoVo)細胞具有抗增殖作用[17]，顯示有抗腫瘤的潛力；此外，除唐古特烏頭堿性化合物外，有研究者還評估了非生物堿成分的生物活性，并發(fā)現(xiàn)唐古特烏頭醇提物中酸性及中性部位具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛活性[18]；據(jù)報道[19-20]，唐古特烏頭總生物堿也具有很好的體內(nèi)抗炎活性，但是其系統(tǒng)的抗炎機制卻鮮見報道。本研究通過應用網(wǎng)絡(luò)藥理學，分析唐古特烏頭抗炎作用靶點，構(gòu)建唐古特烏頭抗炎作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)，預測了其發(fā)揮抗炎作用的潛在核心靶點，富集分析抗炎作用相關(guān)的生物學過程和信號通路，并運用分子對接技術(shù)和體外細胞實驗驗證唐古特烏頭抗炎作用機制，為唐古特烏頭的藏醫(yī)臨床研究及產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

炎癥反應是許多病理條件的中心特征，是機體在不斷進化過程中形成的一種防御反應，也是促發(fā)多種疾病發(fā)展的主要病理過程。炎癥反應前期階段的目的是應對組織損傷和入侵的微生物[21-22]，活化的巨噬細胞通過產(chǎn)生細胞因子和其他促炎因子，從而介導大部分炎癥細胞和病理學過程，此時的炎癥反應有利于消除外界刺激，并且促進組織恢復其功能；但是隨著炎癥過程的持續(xù)，如反應時間過長或者反應過度時，會觸發(fā)有害的免疫過程，其特征為不正常的產(chǎn)生促炎介質(zhì)，進而促進多種疾病的發(fā)展，例如常見的心血管疾病、敗血癥和感染性休克等[23]。本實驗通過網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，得到了37個唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的潛在核心靶點，如TNF、AKT1、MAPK1、MAPK3、JAK2、TNF、STAT3等，這些靶點多與機體的免疫、炎癥相關(guān)。NO是急性和慢性炎癥的重要介質(zhì)，LPS刺激RAW264.7細胞后，使得iNOS水平明顯升高，接著誘導NO的過剩產(chǎn)生，進而刺激更多的炎癥信號，加劇炎癥反應[24]。通過對284個共同靶點進行GO、KEGG富集分析，最終得到多條與免疫炎癥反應和癌癥有關(guān)的信號通路，主要有PI3K-Akt、Ras、Rap1、MAPK、HIF-1等。分子對接結(jié)果顯示，唐古特烏頭關(guān)鍵活性成分如6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Atisine等與PI3K-Akt 信號通路中的關(guān)鍵靶點AKT1、JAK2具有較高的對接活性，表明這幾種成分單體可能是發(fā)揮抗炎作用的主要化學成分。體外細胞炎癥模型進一步研究發(fā)現(xiàn)，唐古特烏頭能夠抑制LPS所致RAW264.7細胞上清液中NO的釋放，并且減少iNOS的表達，表現(xiàn)出顯著的抗炎藥效。實時熒光定量RT-PCR檢測表明，唐古特烏頭抗炎藥效與調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路密切相關(guān)。LPS刺激的RAW264.7細胞通過激活AKT1，刺激NF-κB釋放，并進一步促進炎癥因子的表達[25]。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡(luò)藥理學，篩選出唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的潛在核心靶點和可能的信號通路，并通過分子對接驗證了活性成分與靶點之間有較好的親和力，且通過對接結(jié)果推測6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Atisine可能為唐古特烏頭發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵單體。通過體外細胞實驗初步驗證了唐古特烏頭醇提物對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型的治療作用及機制，證實其具有顯著的體外抗炎活性。研究結(jié)果有助于更好地推進民族藥唐古特烏頭的開發(fā)應用。