李 笑 謝苗苗 顏欣超 胡忠澤,2* 王奪標

(1.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽233100；2.動物營養(yǎng)調控與健康安徽省重點實驗室，鳳陽233100；3.安徽標王農(nóng)牧股份有限公司，淮北235000)

蘋果酸(malic acid)又名2-羥基丁二酸，以D-蘋果酸、L-蘋果酸和二者混合物3種形式存在于大自然中。天然蘋果酸是廣泛分布于植物、動物和微生物細胞中的L-蘋果酸[1]。L-蘋果酸參與機體三羧酸循環(huán)中的糖代謝過程。具有柔軟、酸度高、易制備和貯藏等特點，并且其氣味接近蘋果的酸味[2]，在畜牧、食品、化工和醫(yī)藥行業(yè)中已有廣泛的應用[3]。

隨著養(yǎng)殖企業(yè)中違規(guī)濫用或長期不合理使用飼用抗生素，出現(xiàn)了細菌抗藥性增強、動物抗藥性降低、藥物殘留和食品安全指數(shù)降低等問題。2020年7月1日，國家出臺“禁抗”政策，禁止飼料企業(yè)使用、生產(chǎn)含有抗生素類藥物的飼料添加劑[4]。蘋果酸及其他酸化劑具有無污染、零殘留等優(yōu)點，作為新型的綠色飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)的應用越來越廣泛。

研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酸對動物的生理及營養(yǎng)作用主要有刺激動物味蕾、增強食欲、提高動物生長性能和飼料消化率[5]、抗應激[6]、抗氧化[7]、調節(jié)胃腸pH、改善腸道微生物菌群[8]和調節(jié)瘤胃發(fā)酵參數(shù)[9]等。Biggs等[10]和Moharrery[11]此前針對飼糧中添加蘋果酸對肉雞生長性能的影響進行了研究。Zhang等[12]針對蘋果酸對豬肉品質的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)蘋果酸具有改善肉品質的作用。但蘋果酸對青腳麻雞肉品質、肌肉生化指標以及抗氧化功能的影響鮮少報道。因此，本試驗旨在研究飼糧中添加蘋果酸對青腳麻雞生長性能、屠宰性能、肉品質、肌肉生化指標及抗氧化功能的影響，為蘋果酸在家禽生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青腳麻雞母雞，購自淮南市某禽業(yè)有限公司；L-蘋果酸(有效含量99%)，購自鄭州某食品添加劑有限公司。

1.2 試驗設計

選擇健康的1日齡青腳麻雞母雞300羽，隨機分為5個組，每組5個重復，每個重復12只雞。A組為對照組，飼喂基礎飼糧；B、C、D、E組為試驗組，分別在基礎飼糧中添加0.2%、0.4%、0.8%和1.6%的蘋果酸。各組青腳麻雞初始體重無顯著差異(P>0.05)。試驗期60 d。

1.3 飼糧組成

試驗采用玉米-豆粕型飼糧，分為1～30日齡和31～60日齡2個階段，參照NRC(1994)營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目 Items1～30日齡 1 to 30 days of age31～60日齡 31 to 60 days of age豬油 Pork oil2.502.80進口魚粉 Imported fish meal1.20磷酸氫鈣 CaHPO41.521.08石粉 Limestone1.101.15蛋氨酸 Met0.110.14蘇氨酸 Thr0.02賴氨酸鹽酸鹽 Lys·HCl0.12多維 Multi-vitamin1)0.020.02多礦 Multi-mineral1)0.100.10氯化膽堿 Choline chloride (50%)0.260.20食鹽 NaCl0.230.20合計 Total100.00100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg) 11.2612.60粗蛋白質 CP21.0117.55粗纖維 CF3.082.89賴氨酸 Lys1.150.97蛋氨酸 Met0.440.41蘇氨酸 Thr0.810.68鈣 Ca0.930.78總磷 TP0.650.55有效磷 AP0.420.32食鹽 NaCl0.230.20

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在安徽科技學院家禽飼養(yǎng)室進行，先對飼養(yǎng)室進行24 h熏蒸消毒后通風7 d，電暖設備升溫。試驗雞采用5層籠養(yǎng)，自由采食、飲水，24 h光照，新城疫疫苗和傳染性法氏囊疫苗免疫。

1.5 樣品采集與指標測定

1.5.1 樣品采集

試驗60 d后，試驗雞禁食不禁水12 h后，每組每個重復隨機選1只體重接近該重復平均體重的青腳麻雞，放血屠宰。將同一部位胸肌分2份置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。

1.5.2 生長性能

試驗期間每天記錄試驗雞的耗料量，分別在1和60日齡稱重，記錄每只雞初始體重(IBW)、終末體重(FBW)，并計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。計算公式為：

ADG(g/d)=(FBW-IBW)/試驗天數(shù)；ADFI(g/d)=總采食糧/試驗天數(shù)；F/G=ADFI/ADG。

1.5.3 屠宰性能

試驗60 d后，稱活體重后屠宰，稱量屠體重、半凈膛重、全凈膛重、胸肌重和腿肌重，并計算其所占活體重的比例。計算公式為：

屠宰率(%)=100×屠體重/活體重；半凈膛率(%)=100×半凈膛重/活體重；全凈膛率(%)=100×全凈膛重/活體重；胸肌率(%)=100×兩側胸肌重/全凈膛率；腿肌率(%)=100×兩側腿肌重/全凈膛率。

1.5.4 肉品質

試驗60 d后，按照陳露等[13]的方法測定胸肌樣品pH45 min、滴水損失、蒸煮損失和系水力；用KONICA MINOLTA CR-400型全自動色差計按照張燕利等[14]描述的方法測定胸肌亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值；用TENOVO FOOD C-LM3B型數(shù)顯式嫩度測定儀按照韓紅麗等[15]描述的方法測定胸肌肉嫩度。

1.5.5 肌肉質構特性

沿著肌纖維方向將煮熟后的肌肉切成相同大小的小方塊，用Brookfield CT3質構儀進行穿透測定肌肉的硬度、彈性、黏性、膠著性、咀嚼性和內聚性。

1.5.6 肌肉生化指標及抗氧化功能

稱取一定重量的胸肌，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍生理鹽水，QIAGEN Qiagn Tissue Lyser Ⅱ組織破碎儀破碎，3 500 r/min離心10 min，取上清液備測。采用Thermo Fisher Multiskan GO全波長酶標儀與南京建成生物工程研究所試劑盒測定胸肌中乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、肌酸激酶(CK)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和乳酸(LD)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(T-AOC)，具體操作按說明書進行。胸肌中糖原(Gn)含量按照GB/T 9695.31—2008方法進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，用ANOVA程序進行單因素方差分析，用Duncan氏法進行多重比較檢驗；并采用回歸分析模型中曲線估計程序，對蘋果酸添加水平與各考察指標進行線性和二次曲線分析；P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。所有試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 蘋果酸對青腳麻雞生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，C、D、E組的FBW和ADG極顯著降低(P<0.01)，E組的ADFI極顯著降低(P<0.01)，C、D組的ADFI顯著降低(P<0.05)。B組的FBW和ADG極顯著高于C、D、E組(P<0.01)。B、C、D組的ADFI極顯著高于E組(P<0.01)，且ADFI與蘋果酸添加量呈線性和二次曲線相關(P<0.05)。B、E組的F/G顯著低于C、D組(P<0.05)。

2.2 蘋果酸對青腳麻雞屠宰性能的影響

由表3可知，各組之間屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率及腿肌率均無顯著差異(P>0.05)。半凈膛率與蘋果酸添加量呈二次曲線相關(P<0.05)。

2.3 蘋果酸對青腳麻雞胸肌肉品質的影響

由表4可知，各組之間胸肌肉色、pH45 min、滴水損失、蒸煮損失、系水力及嫩度均無顯著差異(P>0.05)。胸肌pH45 min和系水力與蘋果酸添加量呈二次曲線相關(P<0.05)。

2.4 蘋果酸對青腳麻雞胸肌質構特性的影響

由表5可知，各組胸肌硬度、彈性、膠著性、咀嚼性、內聚性和黏性均無顯著差異(P>0.05)。胸肌黏性與蘋果酸添加量呈線性相關(P<0.05)。

表2 蘋果酸對青腳麻雞生長性能的影響

表3 蘋果酸對青腳麻雞屠宰性能的影響

表4 蘋果酸對青腳麻雞胸肌肉品質的影響

續(xù)表4項目Items組別 GroupsA(對照Control)BCDEP值 P-value組別 Groups線性Linear二次QuadraticpH45 min5.54±0.065.59±0.105.61±0.085.66±0.095.56±0.110.1160.9090.040滴水損失 Drip loss/%2.10±0.731.75±0.461.18±0.551.75±0.672.06±0.660.1010.7110.476蒸煮損失 Cooking loss/%32.45±1.9332.94±1.8031.31±1.5030.45±1.7331.07±1.830.1460.2110.235系水力 Water binding capacity/%43.45±2.1842.65±2.0941.91±2.1740.93±1.1542.15±2.930.4150.3930.009嫩度 Tenderness/kgf1.46±0.171.88±0.501.83±0.621.38±0.401.51±0.340.1620.5560.865

表5 蘋果酸對青腳麻雞胸肌質構特性的影響

2.5 蘋果酸對青腳麻雞胸肌生化指標的影響

由表6可知，與對照組相比，C組胸肌糖原含量極顯著升高(P<0.01)。C組胸肌糖原含量極顯著高于D組(P<0.01)，C組胸肌糖原含量顯著高于E組(P<0.05)，B組胸肌糖原含量顯著高于D組(P<0.05)。各組之間胸肌LD、LDL-C、HDL-C含量及LDH、ACP、CK活性均無顯著差異(P>0.05)。胸肌LD含量與蘋果酸添加量呈線性相關(P<0.05)。

2.6 蘋果酸對青腳麻雞胸肌抗氧化指標的影響

由表7可知，與對照組相比，B、C、D組胸肌CAT活性顯著升高(P<0.05)，E組胸肌MDA含量顯著降低(P<0.05)。E組胸肌MDA含量顯著低于C組(P<0.05)。胸肌MDA含量與蘋果酸添加量呈線性相關(P<0.05)。各組之間胸肌T-AOC及GSH-Px、T-SOD活性均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 蘋果酸對青腳麻雞生長性能的影響

蘋果酸在生物體能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用，是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物。由于蘋果酸作為酸化劑在家禽中應用較少，本試驗根據(jù)其他酸化劑在家禽中的添加量確定蘋果酸添加量。試驗結果表明，與對照組相比，飼糧中添加0.4%、0.8%、1.6%蘋果酸極顯著降低了青腳麻雞的FBW和ADG；添加0.4%和0.8%蘋果酸顯著降低了青腳麻雞的ADFI，添加1.6%蘋果酸極顯著降低了青腳麻雞的ADFI。隨著蘋果酸添加量的增大，青腳麻雞的ADFI呈下降趨勢。但飼糧中添加蘋果酸對青腳麻雞的F/G無顯著影響。Biggs等[10]報道，飼糧中添加4%的蘋果酸會使肉雞在飼養(yǎng)前期的ADG和ADFI下降。Moharrery[11]研究表明，飼糧中添加0.05%和0.10%的L-蘋果酸對肉雞的采食量基本沒有影響，但添加0.15%的蘋果酸會導致肉雞的采食量顯著降低。本試驗結果與前人研究結果相似。這表明蘋果酸添加量過高可能會導致飼糧的酸味過重，適口性下降，影響肉雞采食量。

表6 蘋果酸對青腳麻雞胸肌生化指標的影響

表7 蘋果酸對青腳麻雞胸肌抗氧化功能的影響

3.2 蘋果酸對青腳麻雞屠宰性能的影響

屠宰性能主要包括屠宰率、全凈膛率、腹脂率、腿肌率等，是衡量動物生長性能與經(jīng)濟效益的綜合性指標，可直觀地反映出動物整個機體組成和食用部分的比例[13]。本試驗中，青腳麻雞屠宰率在85%以上，全凈膛率在60%以上，均達到良好產(chǎn)肉性能的標準[16]。飼糧中不同添加量的蘋果酸對青腳麻雞屠宰性能沒有顯著影響，但其半凈膛率在添加量為0.8%時達到最大值。李平等[17]在基礎飼糧中添加1.08 g/kg蘋果酸與添加2.00 g/kg蘋果酸二氫鈉鈣的研究發(fā)現(xiàn)，二者對肉牛屠宰性能的影響均不顯著。本試驗與李平等[17]研究結果一致，說明飼糧中添加蘋果酸與屠宰性能無直接聯(lián)系，蘋果酸沒有顯著改善肉雞的屠宰性能。

3.3 蘋果酸對青腳麻雞肉品質及質構特性的影響

肉色、pH、滴水損失、蒸煮損失、系水力及嫩度等可以直接反映肉品質的好壞[18]。雞肉放置時間越長，肌肉中LD越多，pH下降，水與蛋白質的結合力逐漸降低，肌原纖維蛋白變性，肌肉系水力減小，滴水損失增加。因此肌肉pH越高，保水力越好，儲存時間越長[19]。本試驗中，飼糧中添加蘋果酸值雖未對青腳麻雞胸肌p造成顯著影響，但添加0.8%蘋果酸時胸肌pH45 min最大，在一定程度上增加了胸肌的保水力、延長貨架期。系水力常用滴水損失或蒸煮損失等來反映肌肉組織的持水能力。隨著肌肉的滴水損失增加，肌肉會因大量液體外流而變得干硬無味，致使肉品質降低[20]。蒸煮損失則通過影響肌肉持水率、風味、嫩度等影響肉品質。本試驗表明，在飼糧中添加0.8%蘋果酸時，青腳麻雞胸肌系水力并沒有因為pH45 min的升高而升高，反而其系水力有所降低。由于肌肉的系水力受活性氧(ROS)、鹽離子濃度、pH、細胞結構變化、肌間脂肪含量及溫度等多方面的影響[21]，單一的pH對其影響微乎其微。人的咀嚼能直觀的評定肉品質的好壞，質構特性就是通過硬度、內聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性等指標來模擬人類咀嚼活動，并做出客觀評價[22]。本試驗表明，飼糧中添加蘋果酸對胸肌質構特性指標均無顯著影響，但其黏性隨著蘋果酸添加量的增加而增大。門小明等[23]在生長育肥豬飼糧中添加0.5 g/kg一水肌酸和0.5 g/kg蘋果酸，發(fā)現(xiàn)其對pH、肉色亮度、肉色紅度、肉色黃度、滴水損失、系水力、蒸煮損失及嫩度等沒有顯著影響。Zhang等[12]在研究蘋果酸對豬肉pH、肉色、滴水損失、剪切力、黏性、彈性、內聚性、膠著性、咀嚼性和硬度時發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加10 mg/kg蘋果酸會使豬肉滴水損失顯著降低，pH顯著升高，但對肌肉質構特性各項指標無顯著影響。此前有少數(shù)研究表明在肉雞飼糧中蘋果酸添加量不宜過高，否則會影響肉雞生長性能，但高蘋果酸添加量對其肉品質的影響沒有明確的結果。本試驗結果與門小明等[23]報道部分一致，表明蘋果酸對肉的口感沒有改善作用。

3.4 蘋果酸對青腳麻雞肌肉生化指標的影響

動物機體細胞時刻在進行有氧呼吸，一旦屠宰，其細胞有氧呼吸將逐漸停止，后轉變?yōu)闊o氧呼吸，能量代謝也轉變?yōu)橐蕴窃徒鉃橹饕緩?。?jīng)過一系列的酶促反應使糖原酵解成LD[24]。LD累積的越來越多，肌肉的pH下降，保水能力變差，嫩度降低。若屠宰后肌糖原含量不足，LD生成量不夠，pH偏高，肌細胞中水分增加，肌纖維會排列緊密，卻不能發(fā)生收縮而變的干硬，依舊會使嫩度下降[4]。因此，調控糖酵解途徑，提高LDH活性，增加肌糖原含量，降低LD含量，有利于肌肉保水，改善肉品質。本試驗研究表明，與對照組相比，飼糧中添加0.4%蘋果酸極顯著增加胸肌中糖原含量，且隨著蘋果酸添加量的增加，胸肌LD含量降低，肌肉系水力增強，改善了肉品質。這可能是由于青腳麻雞飼糧中添加蘋果酸更有利于葡萄糖轉化為肌糖原，其機理還需要深入探究。

3.5 蘋果酸對青腳麻雞肌肉抗氧化功能的影響

動物屠宰后，肌肉中氧化反應此時并沒有立即停止，但肌肉中抗氧化物質的活性或含量在逐漸下降，大量ROS產(chǎn)生，脂質過氧化程度增大，肌肉系水力降低，伴隨著肉色變差。因此，肌肉的抗氧化能力會直接影響肉品質[25]。T-AOC反映機體總體抗氧化能力，包括酶類和非酶類主導的抗氧化系統(tǒng)；GSH-Px保護細胞膜結構，確保細胞功能；超氧化物歧化酶(SOD)和CAT具有減少羥基自由基形成以及清除過氧化物和超氧自由基的功能；MDA是脂質過氧化的產(chǎn)物，MDA的產(chǎn)生增加了嵌入生物細胞膜的多種酶的空間結構，干擾了脂質雙分子層的排列，損傷細胞膜結構[26]。本試驗表明，與對照組相比，飼糧中添加0.2%、0.4%、0.8%蘋果酸顯著提高了青腳麻雞胸肌中CAT活性，對于阻止肌肉脂質過氧化、減少羥基自由基形成、保持肌肉系水力有一定效果。隨著蘋果酸添加量的增加，胸肌MDA含量逐漸降低，當添加1.6%蘋果酸時，青腳麻雞胸肌MDA含量顯著降低，有利于減緩肌肉氧化，減少水分流失，提高肉品質。張鵬光等[27]在斷奶仔豬基礎飼糧中添加L-蘋果酸，發(fā)現(xiàn)添加1%L-蘋果酸顯著升高了空腸黏膜中SOD、CAT和GSH-Px活性，顯著提高了T-AOC，顯著降低了MDA含量。程義等[28]利用L-蘋果酸和檸檬酸聯(lián)合添加到異育銀鯽飼料中，在保持0.2%檸檬酸添加量不變的情況下，添加L-蘋果酸能夠使肝、胰臟中SOD和CAT活性升高，并且添加0.1%L-蘋果酸提高SOD和CAT活性的效果最好。曾曉琮等[29]研究L-蘋果酸對大鼠抗氧化酶基因表達時發(fā)現(xiàn)，灌胃L-蘋果酸溶液使大鼠心肌細胞和肝臟細胞的CAT、GSH-Px的mRNA表達量顯著升高，實現(xiàn)提高線粒體的抗氧化作用。敬婷等[30]在飼料中分別添加1、2、4、8和16 g/kgL-蘋果酸飼喂湘云鯽，發(fā)現(xiàn)添加4.0 g/kgL-蘋果酸時肝臟SOD活性最大，MDA含量最小。本試驗與前人報道一致，表明蘋果酸通過提高青腳麻雞肌肉的抗氧化能力，阻止肌肉進一步氧化，維持細胞完整，改善肌肉品質。

4 結 論

飼糧中添加0.2%蘋果酸能提高青腳麻雞胸肌CAT活性，添加0.4%蘋果酸能提高胸肌糖原含量和CAT活性，添加0.8%蘋果酸能提高胸肌CAT活性，添加1.6%蘋果酸能降低胸肌MDA含量。綜合各項指標，推薦青腳麻雞飼糧中蘋果酸添加量為0.4%。