王 慶，田 雨，齊喜紅，董文靜，茍小慧，朱彥華，趙建軍

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)，其味甘、性平，歸肝、腎經(jīng),具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的功效，可用于治療虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽痿遺精、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等病癥。主要化學(xué)成分有枸杞多糖、生物堿、氨基酸、黃酮類、維生素、微量元素等。枸杞子作為常用中藥，收載于《中國藥典2020年版》[1-2]。冷凍干燥技術(shù)在中藥材或中藥飲片的加工中研究不多。本研究建立烘干及凍干不同干燥枸杞飲片指紋圖譜，同時(shí)考察枸杞多糖、甜菜堿、玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯等理化指標(biāo)含量，為創(chuàng)新中藥飲片炮制工藝提供實(shí)驗(yàn)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：(1)儀器：高效液相色譜儀(1260型，安捷倫科技有限公司)，METTLER XS205 電子天平(十萬分之一，德國)，島津2550紫外分光光度計(jì)，Elmasonic P120H 超聲波清洗機(jī)(德國Elma公司)，飛鴿牌高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。(2)試劑：冰醋酸(Tedia,色譜級(jí))，甲醇、乙腈、石油醚、丙酮(賽默飛世爾科技有限公司，色譜級(jí))，高純水,二氯甲烷(DIKMA TECHNOLOGIES INC,色譜級(jí))，正己烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜級(jí))。枸杞子烘干品是將采收的枸杞子鮮果經(jīng)清洗、熱風(fēng)烘干、除去雜質(zhì)而得；凍干品是將枸杞子鮮果經(jīng)噴淋洗、風(fēng)干后采用真空冷凍干燥技術(shù)脫水，并經(jīng)揀選等工序加工而成。以上枸杞子樣品均為寧夏早康生物科技有限公司提供，由寧夏藥品檢驗(yàn)研究院中藥室王慶主任鑒定為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)。

1.2 材料：無水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)110833-201908，中國食品藥品檢定研究院)；甜菜堿對(duì)照品(批號(hào)110894-201604，中國食品藥品檢定研究院)；β-胡蘿卜素(批號(hào)100445-201802，含量29.8%，中國食品藥品檢定研究院)；玉米黃素(批號(hào)E0025303,含量93.5%，曼哈格生物科技有限公司)；玉米黃素雙棕櫚酸酯(批號(hào)A24GB14668，上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 指紋圖譜的建立[3]

1.3.1.1 HPLC分析條件：色譜柱Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相由0.3%冰醋酸(A)和乙腈(B)組成；梯度洗脫;檢測(cè)波長310 nm;柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL，見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.1.2 供試品溶液的制備:精密稱取烘干枸杞、凍干枸杞各約3.0 g,置于150 mL錐形瓶中，加水45 mL，60℃超聲提取30 min，提取液在3 000 r/min條件下離心10 min，將離心液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.1.3 指紋圖譜考察方法:①取烘干枸杞1號(hào)樣品的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，以22號(hào)峰為參照峰,見圖3(封三)，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.38%，相對(duì)峰面積的RSD為1.83%～2.92%，表明儀器精密度良好。②取烘干枸杞1號(hào)樣品的供試品溶液在0、2、4、6、8、24 h檢測(cè)，記錄色譜圖，以22號(hào)峰為參照峰，見圖3(封三)，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.15%～2.39%，相對(duì)峰面積的RSD為1.20%～2.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。③取烘干枸杞1號(hào)樣品的供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以22號(hào)峰為參照峰，見圖3(封三)，計(jì)算主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.12%，相對(duì)峰面積的RSD為1.47%～2.94%，表明方法重復(fù)性良好。

1.3.2 指紋圖譜分析

1.3.2.1 共有模式的確定:分別稱取10批烘干枸杞粉末與10批凍干枸杞粉末，制備供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，將得到的10批烘干枸杞HPLC色譜圖的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)。以烘干枸杞1號(hào)樣品的HPLC色譜圖為參照?qǐng)D譜，生成10批烘干枸杞樣品的共有模式R，見圖1(封三)，然后將10批凍干枸杞樣品的HPLC色譜圖與10批烘干枸杞的共有模式R圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到上述軟件中，以10批烘干枸杞樣品的共有模式R為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法進(jìn)行多點(diǎn)校正，時(shí)間窗寬度為0.3 s,進(jìn)行自動(dòng)匹配，建立凍干枸杞對(duì)照指紋圖譜,見圖2(封三)，共確定24個(gè)共有峰，見圖3(封三)。

1.3.2.2 色譜圖中共有峰面積:對(duì)10批烘干枸杞樣品的共有模式R與10批凍干枸杞樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析和比較，經(jīng)計(jì)算供試品色譜圖中共有峰面積占總峰面積均在70%以上，符合指紋圖譜要求。

1.3.2.3 相似度分析:將10批烘干枸杞，10批凍干枸杞HPLC色譜圖的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，計(jì)算10批樣品之間的相似度，10批烘干枸杞之間的相似度分別為0.995、0.996、0.995、0.996、0.997、0.996、0.997、0.995、0.996、0.994；10批凍干枸杞之間的相似度分別為0.990、0.997、0.998、0.997、0.998、0.998、0.997、0.996、0.998、0.996，結(jié)果均達(dá)到0.99以上，符合指紋圖譜要求。再以10批烘干枸杞的共有模式R為參照?qǐng)D譜，計(jì)算與10批凍干枸杞的相似度，分別為0.997、0.999、0.995、0.993、0.994、0.999、0.996、0.997、0.996、0.997，結(jié)果均達(dá)到0.99以上。

1.3.3 甜菜堿含量測(cè)定

1.3.3.1 HPLC分析條件：色譜柱為Merck 氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-水(85∶15)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為 195 nm。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。

1.3.3.2 供試品溶液的制備：取烘干枸杞、凍干枸杞粉碎，約取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流 1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置堿性氧化鋁固相萃取柱(2 g)上，用乙醇30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀芙?，轉(zhuǎn)移至 2mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻過濾，取續(xù)濾液。

一個(gè)物體在內(nèi)河航道漂移，受到水流和風(fēng)力的作用，假設(shè)在一定時(shí)間Δt內(nèi)漂移速度相對(duì)穩(wěn)定，那么物體的位置從tn時(shí)刻到tn+1時(shí)刻的更新為

1.3.3.3 對(duì)照品溶液的制備：取甜菜堿對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.17 mg的溶液。

1.3.3.4 樣品測(cè)定：取烘干枸杞、凍干枸杞各10批樣品粉末，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。

1.3.4 枸杞多糖含量測(cè)定

1.3.4.1 供試品溶液的制備：取烘干枸杞、凍干枸杞粗粉約0.5 g，精密稱定，加乙醚100 mL，加熱回流1 h，靜置，放冷，小心棄去乙醚液，殘?jiān)盟∩蠐]盡乙醚。加入80%乙醇100 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，濾渣與濾器用80%熱乙醇30 mL分次洗滌，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流2 h。

1.3.4.2 對(duì)照品溶液的制備：精密取稱無水葡萄糖對(duì)照品25.11 mg，置250 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度后搖勻。

1.3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，分別加水至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min。置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在490 nm的波長處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.4 樣品測(cè)定:精密量取供試品溶液1.0 mL，置具塞試管中，精密加水1.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL時(shí)測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的重量。

1.3.5.1 HPLC分析條件:①色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；②流動(dòng)相為乙腈-甲醇-正己烷-二氯甲烷(40∶15∶20∶20)；③流速：1.0 mL/min;④柱溫：25℃；⑤檢測(cè)波長：450 nm;⑥進(jìn)樣量：供試品10 μL,對(duì)照品5 μL。

1.3.5.2 供試品溶液的制備：稱取烘干枸杞、凍干枸杞粉末1 g，精密稱定，加入0.01%二丁基羥基甲苯(BHT)，15 mL石油醚-丙酮(2∶1)混合溶劑常溫提取3次至殘?jiān)鼰o色，每次30 min，合并提取液，轉(zhuǎn)入分液漏斗，蒸餾水洗去水溶性成分，石油醚層用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，石油醚定容至25mL，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。提取過程避光。

1.3.5.3 對(duì)照品溶液的制備:取玉米黃素、β-胡蘿卜素適量，分別精密稱定6.55、7.46 mg,加入二氯甲烷溶解后，流動(dòng)相分別定容于10、100 mL量瓶中；取玉米黃素雙棕櫚酸酯適量，精密稱定0.96 mg,加入玉米黃素、β-胡蘿卜素各1 mL后，流動(dòng)相定容于10 mL量瓶中，即得。

1.3.5.4 樣品測(cè)定：取烘干枸杞、凍干枸杞各10批樣品粉末，按制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。

1.3.6 其他指標(biāo)的測(cè)定：對(duì)烘干枸杞、凍干枸杞各10批樣品中水分、總灰分、浸出物、脂肪、蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

建立采用烘干及凍干不同干燥方式的枸杞子飲片指紋圖譜，其方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。通過分析，不同干燥品共有峰面積大于70%，相似度均達(dá)到0.99以上。烘干和凍干品中甜菜堿、枸杞多糖等其他指標(biāo)含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 10批次烘干及凍干品各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究開展了枸杞子不同干燥方式中藥飲片的質(zhì)量對(duì)比研究，建立了HPLC指紋圖譜，結(jié)合共有模式和共有峰的指認(rèn)，通過相似度軟件進(jìn)行分析，不同干燥品共有峰面積大于70%，相似度均達(dá)到0.99以上，表明凍干枸杞與烘干枸杞質(zhì)量品質(zhì)無明顯差異。同時(shí)通過對(duì)不同干燥方式枸杞子所含的指標(biāo)成分甜菜堿、枸杞多糖和類胡蘿卜素類成分玉米黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃素雙棕櫚酸酯進(jìn)行含量對(duì)比測(cè)定，結(jié)合水分、總灰分、浸出物、脂肪等指標(biāo)進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示凍干枸杞各項(xiàng)指無明顯差異。枸杞子飲片凍干品內(nèi)的物質(zhì)基礎(chǔ)與傳統(tǒng)烘干品基本一致，可替代烘干品發(fā)揮藥用價(jià)值。