張鐵英,高 晶,方 堃,黃 顏

胃癌(GC)是最常見的消化道腫瘤之一，在我國癌癥發(fā)病率中位居第二位，死亡率排第三位，嚴重危害了人群健康[1]。胃癌起病隱匿,進展迅速,早期診斷困難，確診時多處于中晚期，使多數(shù)病例失去了最佳手術時機[2]。除了經(jīng)典的手術和全身化療外，免疫療法也被證明具有根除癌癥的潛力[3],因此，確定新的免疫相關治療靶點，闡明胃癌-免疫相互作用的免疫表型，是目前胃癌免疫治療的重要研究方向。鐵氧還原蛋白是最早被鑒定的Fe-S蛋白之一，鐵氧還原蛋白1(FDX1)被認為是一種多功能的電子傳遞蛋白，參與多種生理過程，如向細胞色素P450酶提供類固醇激素的生物合成和維生素D代謝[4]。FDX1基因的敲除會導致蛋白脂?；饔玫耐耆珕适Ш图毎粑饔玫娘@著減少[5]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)進行一系列生物信息學分析,以挖掘FDX1在胃癌的臨床預測價值以及與免疫浸潤的相關性，并利用胃癌患者標本進行了表達驗證，以期為胃癌的臨床診治提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料：FDX1表達譜和TCGA基因型組織表達 (GTEx) 臨床泛癌數(shù)據(jù)從加州大學圣克魯斯分校 (UCSC) Xena 數(shù)據(jù)庫下載。為了評估FDX1的表達，腫瘤組織從TCGA獲得，正常組織從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫獲得。

1.2 FDX1表達水平與患者臨床病理特征及預后相關性分析：根據(jù)下載整理的患者臨床病理信息，匹配FDX1表達水平，研究FDX1與年齡、性別、組織學分級、TNM 分期等的相關性。FDX1表達水平中位數(shù)為截斷值，將患者分為高表達組和低表達組，比較2組間的生存差異，并用“survival”包繪制生存曲線。采用單因素和多因素Cox回歸分析判斷 FDX1在胃癌中的預后價值。

1.3 相關性和富集分析：使用TCGA STAD數(shù)據(jù)在胃癌中進行FDX1-mRNA和其他mRNA的Pearson相關性分析。選擇與FDX1-mRNA最正相關的300個基因進行富集分析以確定FDX1的功能。使用clusterProfiler中的gseKEGG和gsePathway函數(shù)進行基因集富集分析，參數(shù)如下：nPerm=1 000，minGSSize= 10，maxGSSize= 1 000，pvalue-Cutoff=0.05。

1.4 FDX1和浸潤性免疫細胞的關系：使用cibersort工具計算免疫細胞的相對分數(shù)，將數(shù)據(jù)上傳到cibersort Web網(wǎng)絡工具，設置默認特征矩陣為1 000個排列，以計算每個樣品中22種浸潤性免疫細胞(包括B細胞、T細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞)的比例，并分析FDX1的表達及與其的關系。

1.5 蛋白印記法檢測胃癌中FDX1的蛋白表達：將獲得樣本勻漿后，使用強效RIPA裂解液(北京索萊寶公司)、提取總蛋白BCA試劑盒(上海碧云天公司)檢測蛋白質濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉至PVDF膜(Millipore)上。使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液在室溫下封閉1 h。將內(nèi)參和目的條帶分離后，分別置于ELK3(SantaCruz)和GAPDH(Proteintech)一抗中4 ℃孵育過夜，吸凈一抗并清洗后加入HRP標記的山羊抗兔lgG和山羊抗鼠lgG二抗(北京康為世紀公司)稀釋比例為1∶10 000，室溫孵育1 h,吸凈二抗并清洗。用超敏ECL發(fā)光試劑盒(蘇州宇恒公司)和化學發(fā)光成像系統(tǒng)(BioRad)進行曝光分析。

1.6 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計算Spearman相關系數(shù)以檢查連續(xù)變量之間的關聯(lián)，分類變量之間的關系采用卡方檢驗。對Cox比例風險回歸模型進行 Kaplan-Meier 單變量和多變量預后分析，以評估每個變量對生存的影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FDX1在胃癌中的表達:評估TCGA和GTEx泛癌數(shù)據(jù)庫中FDX1的表達發(fā)現(xiàn)，與相應的正常組織相比，F(xiàn)DX1在結腸癌、胰腺癌、直腸腺癌、卵巢漿液性囊腺癌、胃癌等組織中呈顯著高表達,見圖1D(封二)。特別是TCGA 數(shù)據(jù)庫中，F(xiàn)DX1在胃癌組織中表達水平明顯高于正常組織(P<0.05)，見圖1A(封二)。TCGA隊列在胃癌中觀察到FDX1高表達，Western blot 方法分別檢測了胃癌與正常組織中FDX1表達差異，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B至圖1C(封二)，表明FDX1可能參與了胃癌的發(fā)病。

2.2 FDX1在胃癌中的預后價值:Kaplan-Meier分析證明，F(xiàn)DX1表達下降與胃癌患者預后較好相關。單因素和多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1低表達、年齡>65歲、M分期(遠處轉移)是胃癌患者獨立預后因素,見表1。

表1 FDX1表達與胃癌臨床病理學特征相關性

2.3 FDX1相關性基因潛在功能及途徑:為了進一步探索受FDX1影響的功能和途徑，使用TCGA數(shù)據(jù)進行FDX1與胃癌中所有其他mRNA之間的相關性分析，選擇與FDX1最正相關的基因進行富集分析，使用R軟件clusterProfiler包進一步探索基于前300個基因的潛在功能途徑。基因富集分析京都基因和基因組百科全書(KEGG)和Reactome通路數(shù)據(jù)庫，KEGG分析結果顯示細胞因子受體相互作用顯著富集。Reactome 分析揭示了細胞外基質途徑、G蛋白耦聯(lián)家族顯著富集，表明FDX1的低表達與胃癌中多種致癌途徑的過度激活有關。

2.4 FDX1表達與22種胃癌免疫細胞浸潤的相關性:分析375例胃癌樣本中的浸潤性免疫細胞分布，并分析FDX1表達與22種免疫細胞的關系，結果顯示FDX1表達與Th2 、Th17、輔助性Th細胞呈正相關，而與漿細胞樣樹突狀細胞、NK細胞及CD8+T細胞、巨噬細胞等呈負相關。

3 討論

胃癌具有嚴重不良預后及高死亡率等特點，預計在2035年仍將在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率[6]，因此探索新的生物學分子標記物有利于胃癌的早期篩查、診斷及治療。FDX1是人類線粒體中的一種鐵氧還原蛋白，F(xiàn)DX1是一種多功能電子介體參與了多種生理過程，例如向細胞色素P450酶提供電子作為類固醇激素生物合成和維生素D代謝的一部分[4]。有研究發(fā)現(xiàn)FDX1對Fe-S簇的生物發(fā)生很重要，參與了類固醇激素的產(chǎn)生[7-8]。最近，F(xiàn)DX1已成為銅死亡關鍵調(diào)節(jié)基因。ZHANG等人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1的下調(diào)對LUAD細胞的生長、凋亡和細胞周期分布沒有明顯影響，但可能會影響細胞的代謝。敲除FDX1主要促進糖酵解和脂肪酸氧化，并改變氨基酸代謝[5]。目前對FDX1的研究層出不窮，但對FDX1在癌癥中的研究特別是胃癌中的研究仍然缺乏。因此，我們通過在胃癌中探索FDX1差異表達、預后以及免疫浸潤，以期發(fā)現(xiàn)其在胃癌中的潛在價值。

本研究利用生物信息學發(fā)現(xiàn)FDX1 在多種腫瘤組織中普遍失調(diào)，在胃癌腫瘤組織中上調(diào)，而通過胃癌與正常組織中FDX1蛋白表達驗證也證實了胃癌組織中FDX1顯著表達高于正常組織，表明FDX1可能與胃癌的發(fā)生有密切關系。通過 Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1高表達患者的預后要優(yōu)于低表達者，進一步進行Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1低表達與高齡(年齡>65歲)、更深的組織學浸潤(T分期)、區(qū)域淋巴結轉移程度(N分期)、發(fā)生遠處轉移(M分期)程度相關，均為胃癌預后影響因素。而FDX1低表達與高齡(年齡>65歲)、M分期是胃癌患者的獨立預后風險因素，且FDX1這種預后差異獨立于其他臨床病理因素。表明FDX1有望成為胃癌潛在的生物標志物及治療靶點。

GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1的低表達與胃癌細胞外基質途徑(ECM)顯著相關，而細胞外基質(ECM)是胃腫瘤微環(huán)境的關鍵組成部分[9]。事實上，ECM為癌細胞提供持續(xù)的增殖信號，例如生長因子和趨化因子，并保護它們免受生長抑制物的影響，充當拮抗常規(guī)化療藥物的擴散屏障[10]。此外，ECM受體的上調(diào)會影響細胞死亡、血管生成、癌癥化學抗性的下游信號通路細胞侵襲和轉移[8]。因此我們推測，F(xiàn)DX1下調(diào)可能通過與細胞外基質串擾，從而影響胃癌細胞對細胞死亡、血管生成、癌癥化學抗性的下游信號通路的激活而促進侵襲和轉移，這也是為什么通過生存分析發(fā)現(xiàn)FDX1低表達預后更差的原因，但其潛在機制仍需要深入研究。

腫瘤微環(huán)境中的基質細胞，尤其是免疫細胞，是調(diào)節(jié)腫瘤細胞惡性行為的重要因素,越來越多的證據(jù)闡明了它們在預測癌癥患者的結果和治療效果方面的臨床病理學意義。據(jù)報道，CD8+T細胞和腫瘤相關巨噬細胞的浸潤促進了上皮性胃癌的進展[11]。本研究中FDX1低表達的胃癌組CD8+T細胞和巨噬細胞的浸潤水平顯著升高。此外，F(xiàn)DX1的表達與CD8+T細胞和巨噬細胞的浸潤水平呈正相關，表明FDX1在調(diào)節(jié)腫瘤免疫學中具有關鍵作用，提示FDX1可能參與腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)，F(xiàn)DX1低表達可能促進胃癌中的免疫調(diào)節(jié)，從而促進胃癌進展及免疫逃逸。

總之，F(xiàn)DX1與胃癌免疫浸潤水平相關，其可能通過影響巨噬細胞、NK細胞，進而導致胃癌免疫抑制狀態(tài)及腫瘤進展。FDX1可以視為免疫治療的相關靶點，并可以作為預測患者預后的標志物。本研究的不足之處是僅在表達水平方面利用胃癌細胞進行了驗證。后續(xù)將進一步開展功能驗證來探索FDX1對胃癌細胞的影響。本研究首次將銅死亡關鍵基因FDX1作為胃癌潛在標志物，也提示銅死亡與胃癌免疫及預后的潛在關系，為進一步開展靶向治療開辟了新的方向。