陳愛玲，馬靜，朱仁慈，高建一，陳瑛

無錫市婦幼保健院優(yōu)生優(yōu)育遺傳醫(yī)學研究所轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究室，江蘇無錫 412003

2015 年全球約有5 億聽力損失（Hearing loss，HL）患者［1］。HL 是一種較為常見的出生缺陷，給個人、家庭造成沉重的精神及經(jīng)濟負擔［2］。我國年齡<7歲的聾啞兒童例數(shù)逐年遞增［3］。HL 患兒的早期語言、認知能力明顯落后于正常兒童，早發(fā)現(xiàn)并及時給予助聽器或耳蝸植入干預治療有助于HL 患兒的語言能力恢復［4］。HL 的遺傳類型有常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體和X 連鎖遺傳［5］。目前已發(fā)現(xiàn)約110 個基因與HL 有關(guān)［6］。我國常見的耳聾基因有GJB2、SLC26A4、GJB3 及線粒體12S rRNA 基因等［7］。明確HL 患兒的基因突變情況，有助于后續(xù)個體化精準遺傳基因咨詢。耳聾基因檢測可發(fā)現(xiàn)普通聽力篩查無法發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性HL、藥物敏感性HL，有助于后續(xù)臨床診療。存在GJB2 基因突變的HL 患兒可進行耳蝸植入干預；存在SLC26A4 基因突變的遲發(fā)性HL 患者，臨床應(yīng)對患兒語言干預，同時家庭再次生育時應(yīng)進行遺傳咨詢；攜帶有藥物耳聾基因線粒體12S rRNA 突變的HL 新生兒應(yīng)預防藥物致聾［8］。為初步了解無錫市區(qū)新生兒耳聾基因突變情況，我們對無錫市區(qū)的5 562例新生兒耳聾基因突變情況進行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019 年9 月—2021 年8 月出生的5 562 例新生兒，其中男2 930 例、女2 632 例，出生24 h 內(nèi)均行耳聲發(fā)射（OAE）、自動聽性腦干反應(yīng)（AABR）聽力篩查，其中125 例未通過聽力篩查（2.25%，125/5 562）；新生兒父母均長期居住在無錫市區(qū)。本研究經(jīng)無錫市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審查通過（2022-06-0106-01），新生兒父母均知情同意并簽署同意書自愿進行后續(xù)遺傳性耳聾基因篩查。

1.2 新生兒GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12S rRNA 基因檢測 5 562例新生兒均于出生72 h后采集足跟內(nèi)側(cè)或外側(cè)血于濾紙片，將血片自然晾干3～4 h 呈深褐色，2 ℃～8 ℃保存。于無錫市婦幼保健院新生兒篩查中心采用采用熒光PCR 熔解曲線法檢測新生兒耳聾基因。試劑購自廈門致善生物科技股份有限公司。GJB2、SLC26A4 基因為常染色體隱性遺傳模式，GJB3基因為常染色體顯性和隱形遺傳模式，線粒體12S rRNA 為母系遺傳模式，其發(fā)病率均與性別無關(guān)。本研究納入基因包括GJB2基因，覆蓋的位點有c. 235delC、c. 299_300delAT、c. 176_191del16、c.35delG、c.167delT；SLC26A4 基因，覆蓋的位點有c. 919-2A>G、c. 2168A>G、c. 1226G>A、c.1707+5G>A、c.1975G>C、c.1229C>T、c.2162C>T、c.2027T>A、c.1174A>T、c.749T>C、c.754T>C；GJB3基因，覆蓋的位點有c. 538C>T、c. 547G>A；線粒體12S rRNA，覆蓋的位點有m.1555A>G和m.1494C>T。采用磁珠法提取新生兒足跟血DNA，PCR 擴增GJB2、SLC26A4、GJB3 及線粒體12S rRNA 等4 個耳聾基因，通過熔解曲線來分析新生兒足跟血耳聾基因突變情況及相應(yīng)突變類型。每份樣本需4 個PCR反應(yīng)體系，可定性檢測出中國人群中90%的GJB2基因，>80%的SLC26A4以及90%藥物性HL患者。當研究對象樣本檢測到試劑盒未覆蓋到的未知突變位點信號時，后續(xù)將其寄送至廈門致善生物科技股份有限公司進行Sanger測序分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料比較用χ2 檢驗。為驗證本研究納入樣本量能準確反應(yīng)無錫市區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因突變分布特點，對納入新生兒的性別進行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

5 562 例新生兒中共檢出耳聾基因突變336 例（6.04%，336/5 562），其中GJB2 基因突變158 例（2.84%，158/5 562）、SLC26A4 基因突變127 例（2.28%，127/5 562）、GJB3 基因突變29 例（0.52%，29/5 562）、線粒體12S rRNA 基因突變18 例（0.32%，18/5 562）、復合GJB2 和SLC26A4 基因突變4例（0.07%，4/5 562）。

2.1 新生兒GJB2 基因突變情況 336 例新生兒中GJB2 基因突變類型為c. 235delC 雜合突變119 例（其中12 例通過聽力篩查、7 例未通過）、c. 299_300delAT 雜合突變22 例（19 例通過、3 例未通過）、c.176_191del16 雜合突變17 例（15 例通過、2 例未通過）、c.235delC 純合突變2 例（均未通過）、c.35delG雜合突變3 例（均通過）、c.35_36insG 雜合突變1 例（通過）。

2.2 新生兒SLC26A4 基因突變情況 SLC26A4 基因突變類型為c. 919-2A>G 雜合突變84 例（79 例通過、5 例未通過）、c.2168A>G 雜合突變10 例（7 例通過、3 例未通過）、c. 1226G>A 雜合突變8 例（7 例通過、1 例未通過）、c.1707+5G>A 雜合突變6 例（5 例通過、1 例未通過）、c.1975G>C 雜合突變5 例（均通過）、c.1229C>T 雜合突變4 例（均通過）、c.2162C>T雜合突變4例（均通過）、c.2027T>A雜合突變3例（均通過）、c.757A>G雜合突變3例（均通過）、c.1174A>T 雜合突變2 例（均通過）、c. 2029C>T 雜合突變2 例（均通過）、c.1226G>A純合突變1例（未通過）。

2.3 新生兒GJB3 基因突變情況 GJB3 基因突變類型為c.538C>T 雜合突變15例（均通過）、c.547G>A雜合突變14例（均通過）。

2.4 新生兒線粒體12S rRNA 突變情況 線粒體12S rRNA 突變?yōu)閙. 1555A>G 均質(zhì)突變10 例（均通過）、m.1503G>A均質(zhì)突變4例（均通過）、m.1555A>G異質(zhì)突變3例（均通過）、m.1494C>T異質(zhì)突變1例（通過）。

通過聽力篩查的5 437 例中存在耳聾基因突變317 例，其中GJB2 基因突變146 例、SLC26A4 基因突變120 例、GJB3 基因突變29 例、線粒體12S rRNA 基因突變18 例、復合GJB2 和SLC26A4 基因突變4 例；未通過聽力篩查的125 例中存在耳聾基因突變19例，其中GJB2 基因突變12 例、SLC26A4 基因突變7例。

5 562 例新生兒中7 例為雙雜合突變，分別為GJB2 基因c.235delC 雜合突變復合c.176_191del16雜合突變1 例（未通過）、GJB2 基因c. 235delC 雜合突變復合c.299_300delAT 雜合突變1 例（未通過）、SLC26A4 基因c.919-2A>G 雜合突變復合c.1226G>A 雜合突變1 例（未通過）、GJB2 基因c.35delG 雜合突變復合SLC26A4 基因4c.919-2A>G 雜合突變1 例（通過）、GJB2 基因c. 235delC 雜合突變復合SLC26A4 基因c. 919-2A>G 雜合突變1 例（通過）、GJB2 基因c. 235delC 雜合突變復合SLC26A4 基因c. 1707 + 5G>A 雜合突變1 例（通過）、GJB2 基因c. 235delC 雜合突變復合SLC26A4 基因c. 2168A>G雜合突變1例（通過）。

5 562 例新生兒中5 226 例未發(fā)生基因突變，其中男2 767 例、女2 459 例；GJB2 基因突變158 例，其中男72 例、女86 例；GJB3 基因突變29 例，其中男17例、女12 例；SLC26A4 基因突變127 例，其中男64例、女63 例；線粒體12S rRNA 突變18 例，其中男7例、女11 例；GJB2 基因和SLC26A4 基因復合突變4例，其中男3 例、女1 例。不同性別新生兒足跟血GJB2 基因、SLC26A4 基因、GJB3 基因及線粒體12S rRNA 突變情況間差異沒有統(tǒng)計學意義（χ2分別為3.30、0.41、0.27、1.38、0.15；P均>0.05），說明本研究納入樣本量能準確反應(yīng)無錫市區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因突變的分布情況。

3 討論

5 歲和14 歲兒童HL 患病率分別為2.5%～3%和3.5%～4%［9］，其原因是新生兒遲發(fā)性非綜合征性HL（GJB2 基因突變）和氨基糖苷類藥物誘發(fā)的HL（線粒體12SrRNA 基因突變）。單一的聽力篩查可能會漏診遲發(fā)性HL 患兒和藥物性耳聾基因攜帶者。對于此類高危人群，新生兒聽力篩查結(jié)合耳聾基因篩查是一種早期診斷語言發(fā)育前HL 的好策略［10］。HL 的臨床和遺傳異質(zhì)性往往使其診斷復雜化。如果聽力篩查與耳聾基因篩查相結(jié)合，60%的HL風險兒童可以在癥狀出現(xiàn)之前得到診斷，并為部分遲發(fā)性非綜合征性HL 和氨基糖苷類藥物誘發(fā)的HL提供基因診斷［11］。

耳聾基因突變分布具有地域差異［12-13］，為了解無錫市區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因突變攜帶率及特點，我們對無錫市區(qū)2019 年9 月-2021 年8 月出生的新生兒聽力篩查和遺傳性耳聾基因檢測數(shù)據(jù)進行分析。5 562 例新生兒中有125 例未通過聽力篩查，未通過率為2.25%。無錫市區(qū)新生兒的耳聾基因突變率為6.04%，最常見的突變?yōu)镚JB2，突變率為2.91%，其中c. 235delC、c. 299_300delAT 和c. 176_191del16 的雜合突變率分別為2.14%、0.4% 和0.31%。在中國人群中，耳聾基因變異的攜帶者頻率為5%～6%［14］，最常見的變異為GJB2基因突變［3］。超過110 個基因座中報道過GJB2 基因突變，4 種常見突變類型有c. 235delC、c. 299_300delAT、c. 176_191del16 和c. 35delG［15］。中國新生兒GJB2 基因c. 235delC 和c. 299_300delAT 的攜帶率分別為1.64%和0.33%，本研究中無錫市區(qū)新生兒GJB2基因c.235delC 和c.299_300delAT 的攜帶率與文獻報道［16］結(jié)論相近。在GJB2基因突變的新生兒中，聽力篩查未通過率最高的突變位點為c.235delC 純合突變，未通過率為100%；其次為c.299_300delAT 雜合突變，未通過率為15.79%。GJB2 基因上有雙等位基因突變的3 例新生兒均未通過聽力篩查，但是復合GJB2 和SLC26A4 基因突變的4 例新生兒均通過了聽力篩查。雙等位基因突變基因GJB2 聽力損失在全世界都很常見，它占感音神經(jīng)性聾先證者的10%以上［17］。

SLC26A4 基因與Pendred 綜合征和大前庭導水管綜合征感音神經(jīng)性HL 相關(guān)。SLC26A4 基因突變表型以內(nèi)耳畸形為特征，包括前庭導水管擴大、Ⅱ型耳蝸分區(qū)不完全和耳蝸發(fā)育不全、進行性和波動性聽力損失以及前庭功能障礙。中國的流行病學數(shù)據(jù)顯示，SLC26A4是導致非綜合征性HL的第二流行基因［18］。在中國，前庭導水管擴大患者的SLC26A4 基因突變率約為97%［19］。無錫市區(qū)新生兒c.919-2A>G的突變率為1.51%，c.2168A>G 的突變率為0.18%，在亞洲人群中，SLC26A4 基因3 種突變類型c. 919-2A>G、c. 2168A>G 和c. 1229C>T 的發(fā)生率最高［3］。我們的結(jié)果與文獻報道結(jié)論一致，SLC26A4 基因突變在無錫地區(qū)也是僅次于GJB2基因的第二大突變。在無錫市區(qū)SLC26A4 基因突變的新生兒中，聽力篩查未通過率最高的突變位點為c. 1226G>A 純合突變，未通過率為100%；其次為c. 2168A>G 雜合突變，未通過率為30%。SLC26A4 基因c.919-2A>G 和c.1226G>A 雙等位基因突變的1 例新生兒未通過聽力篩查。對于具有雙等位基因SLC26A4 突變的嬰兒，聽力損失程度主要為重度至極重度［19］。家族性甲狀腺腫先天性聾綜合征和伴前庭導水管擴張的非綜合征型通常由SLC26A4 的雙等位基因突變引起［18］。

GJB3 基因通常涉及常染色體顯性和常染色體隱性聽力障礙［20］，其突變首先在具有常染色體顯性遺傳性聽力障礙的中國家庭中發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為后天高頻感音神經(jīng)性HL［20］。在無錫市區(qū)新生兒中c.538C>T 的突變率為0.7%，c.547G>A 的突變率為0.25%，攜帶有GJB3 基因突變的新生兒均通過了聽力篩查。GJB3 基因突變患者表現(xiàn)為青少年時期聽力正常，但是青壯年期間聽力逐漸下降，直至發(fā)生重度HL。

線粒體12S rRNA 是線粒體基因突變的研究熱點，在許多家族中已發(fā)現(xiàn)m.1555A>G和m.1494C>T這兩種常見的變體類型與氨基糖苷誘導的非綜合征型HL有關(guān)［21］。攜帶12S rRNA 基因突變的人群對氨基糖苷類藥物高度敏感，即使正常劑量甚至微量的氨基糖苷類抗生素都可能引起HL，這種突變可以通過母體傳遞給后代［22］。在無錫市區(qū)新生兒中m.1555A>G突變率為0.23%，其中均質(zhì)突變率為0.18%，異質(zhì)突變?yōu)?.05%，攜帶有線粒體12S rRNA基因突變的新生兒均通過了聽力篩查。線粒體12S rRNA 基因m. 1555A>G 和m. 1449C>T 在中國新生兒中的突變率分別為0.20%和0.03%，其中m.1555 A>G 是線粒體12S rRNA 基因的主要變異形式。無錫市區(qū)線粒體12S rRNA 的突變率與我國整體突變率相一致。

早期發(fā)現(xiàn)新生兒先天性HL 和早起對癥干預對兒童的語言和認知能力有著深遠的影響，早期干預進行康復有助于顯著改善語言發(fā)展［23］。隨著我國新生兒耳聾基因篩查的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量具有單一等位基因突變的個體。具有單一等位基因突變患者的診斷、治療和遺傳咨詢越來越受到臨床醫(yī)生的重視。耳聾基因檢測可以作為預測聽覺的輔助檢測，為醫(yī)生在計劃配戴助聽器和隨訪時提供有價值的信息，并采取嚴格的保護措施，避免誘發(fā)因素，保護新生兒聽力受外界因素影響，延緩HL 的發(fā)生，保障其最佳的言語和聽力發(fā)展機會。

綜上所述，無錫市區(qū)2019 年9 月—2021 年8 月出生的5 562新生兒耳聾基因突變以GJB2基因突變?yōu)槌Ｒ?，其次為SLC26A4、GJB3、線粒體12S rRNA；耳聾基因突變類型主要為雜合突變；突變頻率最高的耳聾基因位點為GJB2 基因c. 235delC、SLC26A4基因c. 919-2A>G 及GJB2 基因c. 299_300delAT 位點；聽力篩查未通過新生兒的常見耳聾基因突變類型為GJB2 基因c. 235delC 純合突變、SLC26A4 基因c. 1226G>A 純合突變和c. 2168A>G 雜合突變。了解無錫市區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因的攜帶率及特點，可為進一步提高HL 出生缺陷預防、診斷、干預、治療、康復等環(huán)節(jié)服務(wù)能力提供理論依據(jù)。