張 榮，賈 瑋，2*

（1．陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2．陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710021）

隨著人們膳食營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的完善和生活水平的提高，對乳制品市場的需求不斷增加，同時(shí)，國家為促進(jìn)奶業(yè)發(fā)展實(shí)施了一系列政策，使得羊乳市場進(jìn)入快速成長期，成為國內(nèi)乳品市場的一股新能量［1］。羊乳因脂肪顆粒小、微量元素及維生素含量高且不含牛乳中易致敏蛋白等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最接近母乳的乳品，也是現(xiàn)代人類的健康營養(yǎng)佳品［2］。隨著羊乳產(chǎn)業(yè)的升級和加工技術(shù)的不斷發(fā)展，對羊乳的營養(yǎng)功能成分研究也需要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上繼續(xù)深入。

乳脂肪是羊乳的主要成分之一，以脂肪球的形式存在于乳體系中。乳脂肪球形成于乳腺分泌細(xì)胞中，首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面合成前體，隨后以微脂質(zhì)滴的形式聚成大小約0.2～8 nm的球體，相互融合生長并通過細(xì)胞質(zhì)到達(dá)細(xì)胞頂端，待從上皮細(xì)胞分泌出去時(shí)再包裹上一層等離子膜即乳脂肪球膜［3］。乳脂肪球膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由以糖蛋白為主的特異性膜蛋白質(zhì)和以神經(jīng)鞘脂類為主的磷脂組成［4］。乳脂肪球膜雖然在整個(gè)乳體系中占比很少，但具有重要的生物功能特性，如抗黏附性、抗菌、抗癌等，并且與腸道相關(guān)疾病、自閉癥和多發(fā)性硬化癥等疾病相關(guān)，同時(shí)也參與信號傳導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)節(jié)、凋亡、分化、生長等生物過程［5］。乳脂肪球膜中含有25%～60%的蛋白質(zhì)，其中含量較高且具有顯著生理活性功能的蛋白質(zhì)有嗜乳脂蛋白（BTN）、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（XDH/XO）、血小板糖蛋白4（CD36）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）、脂滴包被蛋白-2（PLIN2）和黏蛋白-1（MUC1）等［6］。

乳脂肪球膜（MFGM）蛋白因結(jié)構(gòu)特異和具有多重生物功能，越來越受到人們的關(guān)注［7］。研究發(fā)現(xiàn)母乳與牛乳中的MFGM蛋白存在較大差異，母乳中存在1 230種特異性蛋白質(zhì)，且有24種蛋白質(zhì)參與免疫相關(guān)的通路［8］，牦牛乳與牛乳中的主要乳脂肪球膜蛋白在相對豐度上雖有所不同，但其生物學(xué)功能幾乎無差異［9］。同時(shí)非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合MaxQuant軟件及Andromeda搜索引擎，為蛋白質(zhì)組學(xué)中的大多數(shù)定量實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案［10］。

為了更好地了解不同泌乳期羊乳的MFGM蛋白質(zhì)組成并評估其差異，本研究從羊初乳和羊常乳樣品中分離提取MFGM蛋白，使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合MaxQuant軟件對其種類和數(shù)量進(jìn)行研究。隨后使用偏最小二乘判別分析篩選并確證標(biāo)志性特征蛋白質(zhì)，使用基因本體論（Gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析評估了差異蛋白質(zhì)的潛在生物活性功能，以便更好地了解羊乳MFGM蛋白質(zhì)的組成，為今后羊乳的深加工及副產(chǎn)品加工提供方向。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

納升級液相色譜系統(tǒng)（EASY-nLC 1000）串聯(lián)四極桿－靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、真空冷凍干燥機(jī)、酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；Milli－Q Integral型純水儀（美國Millipore公司）；AL204－IC型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

胰蛋白酶（測序級），甲酸、乙腈（色譜純）（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；BCA快速蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、Tris、尿素、碳酸氫銨（分析純，美國Sigma公司）；10 kDa超濾管購自美國Millipore公司。

羊乳樣品取自陜西省西安市的關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場，選取40只健康且沒有急性乳腺炎和明顯臨床疾病的關(guān)中奶山羊，年齡為2～4歲。在2021年5月采集產(chǎn)后0～5天的羊乳初乳和產(chǎn)后1～6個(gè)月的羊乳常乳樣品各20份，并于2～4 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。分析前，將各個(gè)樣本集各自混合以減少個(gè)體差異。

1.2 蛋白質(zhì)的分離提取

量取50 mL羊初乳和50 mL羊常乳樣品，在4℃下于12 000 r/min離心40 min獲得乳脂肪層、乳清層和固體顆粒。將乳脂肪層轉(zhuǎn)移至新的離心管并用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 6.8）超聲洗滌15 min，在4℃下以12 000 r/min離心20 min。重復(fù)該洗滌過程3次。隨后，用0.4%十二烷基硫酸鈉超聲洗滌乳脂肪層1 min，在4℃下以12 000 r/min離心20 min，收集MFGM蛋白。使用BCA快速蛋白定量試劑盒對不同泌乳期的羊乳MFGM蛋白質(zhì)進(jìn)行測定。

1.3 超濾輔助樣品制備及消化

取100 μL提取的MFGM蛋白樣品，加入10 μL 100 mmol/L二硫蘇糖醇，于56℃下孵育1 h，以保持蛋白質(zhì)巰基處于還原狀態(tài)。冷卻至室溫后，加入碘乙酰胺至終濃度為55 mmol/L，在25℃下避光孵育30 min完成巰基烷基化。將孵育完成樣品轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾離心管中，加入100 μL尿素緩沖液（150 mmol/L Tris HCl和8 mol/L尿素，pH 8.0）洗滌MFGM蛋白樣品兩次，隨后加入100 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液離心。取胰蛋白酶-50 mmol/L碳酸氫銨溶液，使酶與底物的質(zhì)量比為1∶50，加入超濾離心管中，37℃下酶解12 h。加入1%甲酸終止消化，使用C18柱對樣品酶解肽溶液進(jìn)行脫鹽凍干，以40 μL 0.1%甲酸復(fù)溶后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.4 儀器條件

色譜條件：Hypersil Gold aQ C18反相色譜柱（100 mm×75 μm，3 μm，Thermo Fisher Scientific公司），流動(dòng)相A：4 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：4 mmol/L甲酸銨乙腈溶液（含0.1%甲酸）；流速：250 nL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃；梯度洗脫程序：0～50 min，5%～35%B；50～95 min，35%～100%B；95～100 min，100%B；100～110.1 min，100%～5%B；110.1～120 min，5%B。

質(zhì)譜條件：加熱電噴霧離子源（HESI），鞘氣流速48 L/min，輔助氣流速5 L/min；噴霧電壓3.8 kV；離子源溫度350℃；毛細(xì)管溫度300℃。在m/z300～1 700范圍內(nèi)采集所有數(shù)據(jù)信息，正離子模式下一級掃描的分辨率為70 000（m/z200的半峰寬），二級掃描的分辨率為17 500，最大離子注入時(shí)間為120 ms，在線性離子阱中對前20個(gè)響應(yīng)最高的前體離子進(jìn)行碎裂，隔離窗口為m/z2，碰撞能量高達(dá)27 eV。通過UniProtKB在線數(shù)據(jù)庫下載羊的蛋白序列數(shù)據(jù)庫，使用MaxQuant 1.6.7.0軟件對二級實(shí)際譜圖與肽段理論碎裂譜圖進(jìn)行匹配，以Andromeda為搜索引擎，并采用非標(biāo)記定量（Label-free quantification，LFQ）算法進(jìn)行相對定量分析。使用Target-decoy搜索策略調(diào)整肽段和蛋白質(zhì)鑒定的閾值，使錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率在0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊乳脂肪球膜全蛋白譜鑒定及表達(dá)差異分析

通過肽段在不同泌乳期的羊乳中鑒定出473種MFGM蛋白，并對419種蛋白實(shí)現(xiàn)了定量，其LFQ強(qiáng)度跨越近5個(gè)數(shù)量級，其中羊初乳中定量331種蛋白質(zhì)，羊常乳中定量252種蛋白質(zhì)。初乳中MFGM表達(dá)的蛋白種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常乳，說明初乳富含免疫球蛋白和生物活性蛋白，營養(yǎng)價(jià)值更為豐富。在鑒定出的MFGM蛋白中，羊初乳中含有包括6-磷酸果糖激酶、α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白和維生素D結(jié)合蛋白在內(nèi)的167種特征表達(dá)蛋白，羊常乳中含有包括粘蛋白-15、脂滴包被蛋白-1、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3－1在內(nèi)的88種特征表達(dá)蛋白，164種蛋白在這兩組樣品中共有表達(dá)（圖1）。

圖1 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白的組成表達(dá)差異Fig.1 MFGM protein of goat milk at different lactation periods

對2組樣品集的混合樣品分別平行3次進(jìn)樣，得到的LFQ強(qiáng)度先進(jìn)行均值歸一化處理，將數(shù)據(jù)矩陣轉(zhuǎn)換為高斯型分布，以消除3次平行分析之間離子強(qiáng)度的系統(tǒng)性偏差，使所鑒定蛋白豐度更具可比性［11］；隨后進(jìn)行單變量分析，分別以2和0.05為倍數(shù)變化及顯著性差異的閾值，繪制雙對數(shù)火山圖，最終獲得羊初乳和羊常乳樣品中具有顯著差異的蛋白質(zhì)310種，其中羊初乳中上調(diào)蛋白質(zhì)有131種，下調(diào)蛋白質(zhì)有179種（圖2）。不同泌乳期羊乳中鑒定出的特征蛋白質(zhì)及共有蛋白質(zhì)豐富了人們對于羊乳蛋白質(zhì)成分的了解，為羊乳基嬰幼兒乳粉和功能食品的研發(fā)及進(jìn)一步的功能開發(fā)提供了有效的理論基礎(chǔ)。

圖2 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白的火山圖Fig.2 Volcano plot of goat milk MFGM protein at different lactation periods

2.2 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白質(zhì)的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

以篩選的具有顯著性差異的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，利用正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least－squares discrimination analysis，OPLS－DA）對羊初乳和羊常乳樣品進(jìn)行分析。2組樣本的R2X為0.962，R2Y為0.992，Q2為0.999，表明所建立的模型具有良好的擬合能力和預(yù)測性能［12］。樣品明顯分開且各自聚集緊密（圖3），表明羊初乳和羊常乳樣品之間觀察到的分布差異主要是由于生物學(xué)原因。選擇VIP值大于1.2的蛋白為標(biāo)志物進(jìn)行后續(xù)研究（表1）。使用熱圖對羊初乳和羊常乳中鑒定的具有顯著表達(dá)差異，同時(shí)滿足VIP值大于1.2的MFGM蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化分析。左邊的每一個(gè)方格代表一種MFGM蛋白質(zhì)，其顏色表示該蛋白表達(dá)的相對豐度，相對豐度越高顏色越深，紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)；右邊為每種MFGM蛋白在Uniprot中的基因名稱（圖4）。在羊初乳和羊常乳樣品中有47個(gè)顯著差異的特征蛋白顯示兩個(gè)不同的趨勢，其中羊初乳中的上調(diào)蛋白包括載脂蛋白E（APOE）、紫蘇苷-2（PLIN2）、Ras相關(guān)蛋白18（RAB18）、多聚免疫球蛋白受體（PIGR）和黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（XDH）等21種，下調(diào)蛋白包括EH結(jié)構(gòu)域蛋白1（EHD1）、EH結(jié)構(gòu)域蛋白4（EHD4）、Ras樣原癌基因A（RALA）、跨膜蛋白263（TMEM263）等26種。

表1 羊初乳和常乳中顯著表達(dá)的差異MFGM蛋白質(zhì)（P＜0.05，fold change（FC）＞2，VIP＞1.2）Table 1 Significantly expressed proteins in colostrum and mature milk（P＜0.05，fold change（FC）＞2，VIP＞1.2）

圖3 不同泌乳期羊乳的OPLS－DA分析圖（n=3）Fig.3 OPLS－DA analysis diagram of goat milk at different lactation periods（n=3）

圖4 不同泌乳期羊乳特征MFGM蛋白組成及表達(dá)差異Fig.4 Composition and expression difference of characteristic MFGM of goat milk at different lactation periods

APOE可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的激活和持續(xù)的炎癥反應(yīng)，從而在動(dòng)脈粥樣硬化中具有保護(hù)作用［13］。PLIN2主要分布在脂質(zhì)滴表面，通過阻礙主要的三?；视椭窤TGL的相互作用保護(hù)脂滴免受脂解，對于哺乳期脂滴的代謝和分泌至關(guān)重要［14］。PIGR通過多聚免疫球蛋白A和免疫球蛋白M分子上的J鏈結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)PIGR的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌，發(fā)揮免疫球蛋白在粘膜屏障中的病原體清除作用，提高機(jī)體免疫力［15］。在哺乳動(dòng)物中的XDH是復(fù)雜金屬黃素蛋白質(zhì)的基準(zhǔn)物，可廣泛催化醛類、嘧啶、嘌呤和喋呤的羥基化反應(yīng)［16］。Ras相關(guān)蛋白是在活性鳥苷三磷酸（GTP）結(jié)合態(tài)和非活性鳥苷二磷酸（GDP）結(jié)合態(tài)之間循環(huán)的二元分子開關(guān)。這種轉(zhuǎn)換機(jī)制在各種不同的GDP/GTP結(jié)合蛋白如細(xì)菌伸長因子、異三聚體G蛋白和多種具有不同生物學(xué)功能的小GTP酶中高度保守，其活性異常也可能在自閉癥和其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［17］。EH結(jié)構(gòu)域蛋白是參與受體回收的關(guān)鍵適配器蛋白，可對一些關(guān)鍵的內(nèi)吞事件進(jìn)行功能調(diào)節(jié)，包括各種受體的內(nèi)化和再循環(huán)，EHD1控制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ蛋白質(zhì)和β-整合素等受體從內(nèi)吞小泡到質(zhì)膜的循環(huán)。同時(shí)，EHD1已被證明可協(xié)同促進(jìn)有氧糖酵解［18］。

2.3 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對羊初乳和羊常乳差異表達(dá)的MFGM蛋白質(zhì)從生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3大分支進(jìn)行GO富集注釋，各分支中最顯著的富集注釋信息見圖5A～C。MFGM蛋白參與不同的生物學(xué)過程，其中，細(xì)胞過程、定位和生物調(diào)節(jié)為主要參與。另外，MFGM蛋白也在生物粘附、代謝過程和免疫過程中發(fā)揮作用，參與通路的蛋白質(zhì)在泌乳期間的豐度變化可為不同階段生長發(fā)育提供特定營養(yǎng)與保護(hù)。特征差異蛋白質(zhì)所參與的代謝過程可調(diào)節(jié)嬰兒腸道的結(jié)構(gòu)和功能成熟［19］。MFGM蛋白主要富集在脂質(zhì)微滴、細(xì)胞外間隙和細(xì)胞外囊泡等，說明初乳中的低豐度蛋白組分是血清中蛋白質(zhì)在乳腺細(xì)胞的緊密連接處通過細(xì)胞外囊泡在細(xì)胞間或跨細(xì)胞傳遞到乳脂肪球膜中，進(jìn)而參與行使關(guān)鍵生理功能［20］。這些蛋白在羊乳中的分子功能包括ATP依賴活性、結(jié)合作用、催化活性。為對羊初乳和羊常乳的差異表達(dá)MFGM蛋白生物學(xué)功能進(jìn)行更深入分析，使用KEGG分析了MFGM蛋白所參與的主要通路，結(jié)果如圖5D所示。圖中顯示了差異表達(dá)的MFGM蛋白參與的通路，表明趨化因子和細(xì)胞因子信號通路介導(dǎo)的炎癥過程和整合素信號通路為主要參與通路。整合素從細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)出信號完成乳腺上皮細(xì)胞分化和羊乳合成［21］。趨化因子作用于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表面，招募細(xì)胞到損傷或感染位點(diǎn)，參與啟動(dòng)和調(diào)節(jié)急性組織損傷或代謝不平衡觸發(fā)的炎性反應(yīng)［22］，這也證實(shí)了羊初乳可在一定程度上降低機(jī)體炎癥反應(yīng)。半乳糖的代謝通過Leloir途徑進(jìn)行，首先由半乳糖變構(gòu)酶將α-D-半乳糖異構(gòu)化為β-D-半乳糖，然后由半乳糖激酶將β-D-半乳糖磷酸化。隨后半乳糖-1-磷酸通過半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶將UDP葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP半乳糖并釋放葡萄糖-1-磷酸，UDP半乳糖通過UDP-半乳糖-4-差異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為UDP葡萄糖［23］，而羊初乳和羊常乳在調(diào)節(jié)半乳糖代謝方面存在差異。

圖5 不同泌乳期羊乳蛋白GO功能注釋和KEGG通路富集Fig.5 GO functional annotation and KEGG pathway enrichment of goat milk protein at different lactation periods

3 結(jié)論

本研究采用非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對羊初乳和羊常乳的乳脂肪球膜蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。羊初乳和羊常乳中共定量419種MFGM蛋白，其中羊初乳中存在167種特征表達(dá)蛋白，羊常乳中有88種，164種蛋白在這兩組樣品中共有表達(dá)。通過單變量及多變量分析篩選出羊初乳和羊常乳樣品中47個(gè)顯著差異的特征蛋白。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，所鑒定乳脂肪球膜蛋白質(zhì)主要參與的生物過程是細(xì)胞過程、定位和生物調(diào)節(jié)，KEGG通路為趨化因子和細(xì)胞因子信號通路介導(dǎo)的炎癥過程和整合素信號通路。為了充分利用羊乳的乳脂肪球膜營養(yǎng)保健功能，有必要進(jìn)一步詳細(xì)描述羊乳乳脂肪球膜中這些蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和相關(guān)的生物學(xué)功能。