賴亞琳，禹紫云，秦該照，袁黎明

（云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500）

高效液相色譜法（HPLC）是在經(jīng)典色譜法的基礎上發(fā)展而來的分離分析方法，具有柱效性高、靈敏度高、選擇性多、解析速度快、使用范圍廣等優(yōu)點［1－3］，能夠用于分析分離大部分有機物，在定性定量分析的眾多領域中被廣泛應用。手性固定相（CSP）能夠提供手性識別位點，對不同的對映體表現(xiàn)出立體定向的相互作用，直接影響手性識別和分離的效果，在HPLC手性分離中，CSP的選擇具有至關重要的作用［4］。共價有機框架材料（COFs）是一類由C、N、H等簡單原子構成，具有高度共價孔隙率和周期性的二維或三維有機多孔聚合物［5－7］。與其他聚合物不同，COFs的顯著特征是其結構可預先設計且長程有序，并具有比表面積大、超低密度、孔道均一可調、結構易于調控和化學穩(wěn)定性高等特點［8－10］。

手性是自然界的基本屬性之一，也廣泛存在于化學領域。手性化合物的對映異構體具有不同的生化和藥理活性，在進入生命體后，一種對映體能夠顯示出活性，而另一種對映體往往活性較低甚至會產生生理毒性從而危害生命健康。因此，有關手性的檢測和分離成為人類生命健康的重要課題。隨著手性科學的不斷發(fā)展，手性共價有機框架化合物（CCOFs）材料由于其優(yōu)異的性質得到了研究人員的廣泛關注，也使其在手性識別［11］、手性分離［12］、生物醫(yī)學［13］和不對稱催化［14］等領域得以迅速發(fā)展。然而，在CCOFs的合成過程中仍然存在一個主要挑戰(zhàn)：平衡手性單體的不對稱性和材料結晶度。因此，精確控制手性、功能性和結晶性是一項關鍵任務［15］。2018年，崔勇課題組［16］首次將CCOFs材料CCOF－6用于HPLC，實現(xiàn)了1-苯基-1-戊醇、1-苯基-1-丙醇、1-苯基-2-丙醇、1-（4-溴苯）-乙醇的基線分離。2022年，本課題組與崔勇課題組［17］合作將CCOFs材料CCOF－17和CCOF－18用于HPLC和氣相色譜（GC），證明兩種CCOFs材料在溫和及苛刻的色譜條件下均能分離大量外消旋分子和藥物，且手性柱的選擇性和耐用性與相關的商用手性柱相當，通用性優(yōu)于相關的商用手性柱，是一種極具潛力的新型手性柱。由此可見，CCOFs材料在手性分離領域具有廣闊前景。

本文采用溶劑熱法合成了非手性COFs（TpBD-（NO2）2），再將TpBD-（NO2）2還原為TpBD-（NH2）2，然后用D-（-）-α-苯甘氨酸對其進行手性修飾，最終得到了具有高孔隙率和結晶度以及熱穩(wěn)定性高的CCOFs材料TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸。對上述3種COFs材料進行表征，采用“網(wǎng)包法”制備TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性固定相，用于高效液相色譜柱的制備，并采用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱成功拆分了13種手性化合物和5種苯系位置異構體，且該色譜柱具有良好的重現(xiàn)性。以上結果表明CCOFs材料作為固定相在高效液相色譜領域具有廣闊的發(fā)展前景。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

手性化合物（99%）購于美國Sigma－Aldrich有限公司；苯系位置異構體、六亞甲基四胺（99.5%）、無水間苯三酚（99%）、三氟乙酸（TFA，99.5%）、1，4-二氧六環(huán)（99%）、無水氯化亞錫（98%）、苯甲醚（99%）、1，3，5-苯三甲酰氯（98%）均購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；四氫呋喃（THF，99%）、甲醇（99.5%）均購于成都科隆化學品有限公司；無水硫酸鈉（99%）、乙酸（99.5%）、二氯甲烷（DCM，99.5%）、異丙醇（99.7%）、正己烷（98%）均購于天津市風船化學試劑科技有限公司；丙酮（99.5%）、鹽酸（HCl，36.0%～38.0%）均購于云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；1，3，5-三甲苯（99%）、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸鹽（PyBrOP，98%）、哌嗪（99%）均購于Adamas試劑有限公司；D-（－）-α-苯甘氨酸（99%）、3，3′-二硝基對二氨基聯(lián)苯（DNB，96%）均購于北京伊諾凱科技有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP，99%）購于美侖生物。

采用配有EC 2006型色譜工作站的230Ⅱ高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）進行色譜分離實驗；高壓勻漿裝柱機（深圳市正大流體機電設備有限公司）；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華有限責任公司）；利用D-max-3B X射線粉末衍射儀（PXRD，日本Rigaku公司）、Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜儀（FT－IR，美國賽默飛世爾科技公司）、AVANCEIIIHD 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）、Nova NanoSEM 450掃描電子顯微鏡（SEM，美國FEI公司）、Chirascan圓二色譜儀（CD，英國Applied Photophysics公司）對合成材料進行表征。

1.2 1，3，5-三甲醛間苯三酚（Tp）的制備

根據(jù)文獻合成Tp［18］。分別稱取6.014 g（49 mmol）無水間苯三酚（C6H6O3）、15.098 g（108 mmol）六亞甲基四胺（C6H12N4），將兩者充分混勻后加入到500 mL的三頸圓底燒瓶中，在N2保護下加入90 mL TFA，于100℃下回流加熱反應3.5 h，直至溶液由黃色變?yōu)榧t褐色；隨后加入150 mL（0.3 mol/L）HCl反應3 h，用適量DCM進行少量多次萃取，加入適量無水Na2SO4除水，旋干；最后用適量甲醇多次洗滌，干燥后得到粉紅色粉末產品。

1.3 TpBD-（NO2）2的制備

根據(jù) 文 獻［19］合成TpBD-（NO2）2。分別 稱取31.5 mg（0.3 mmol）Tp、61.7 mg（0.45 mmol）DNB、0.25 mL 1，3，5-三甲苯、0.25 mL 1，4-二氧六環(huán)和0.25 mL（3 mol/L）的乙酸水溶液于耐熱玻璃管中，混合超聲處理30 min后，將耐熱玻璃管在77 K液態(tài)N2浴中迅速冷凍，并連續(xù)3次通過冷凍－泵－解凍循環(huán)脫氣，將耐熱玻璃管密封，隨后將其在120℃溫度條件下加熱3 d。將得到的混合物過濾，收集得到暗紅色沉淀，以適量的丙酮、THF、DCM依次洗滌3次后，于180℃下真空干燥12 h，獲得TpBD-（NO2）2。

1.4 TpBD-（NO2）2還原為TpBD-（NH2）2

實驗前先將THF溶液除水。根據(jù)文獻［20］將稱取的2.52 g無水氯化亞錫置于5 mL THF中使其充分溶解，隨后加入150 mg TpBD-（NO2）2，并將三者的混合物于50℃下回流加熱攪拌3 h。反應期間配制1 mol/L的HCl溶液備用，待反應結束后將得到的產物離心并懸浮在10 mL配制好的HCl中。依次用70 mL HCl洗滌10次，一定量的去離子水洗滌3次，100 mL丙酮洗滌1次。將得到的紅棕色粉末重新懸浮于5 mL苯甲醚中后將其置于25 mL三頸圓底燒瓶中，將懸浮液在120℃下加熱24 h。最后，用100 mL丙酮洗滌、過濾，得到產物TpBD-（NH2）2。

1.5 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的制備

實驗前先將DCM除水。再分別稱取91 mgD-（－）-α-苯甘氨酸、300 mg PyBrOP，并量取5 mL DCM，將三者混合超聲2 min，混合均勻后在室溫下反應約2 h，再加入50 mg TpBD-（NH2）2和156 mg DMAP反應4 d。將得到的產物用100 mL水離心，洗去多余的D-（－）-α-苯甘氨酸后得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性產物。其合成路線如圖1所示。

圖1 TpBD-（NH2）2-D－（－）-α-苯甘氨酸的合成路線圖Fig.1 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine synthesis roadmap

1.6 “網(wǎng)包法”制備高效液相色譜TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相［21］

由于合成的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的粒徑過大且不均勻，不適合直接用來制備填充柱。故先將TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸粉末置于研缽中研磨14 d左右，再借助溶劑使其懸浮獲得較為合適的粒徑。實驗前備好除過水的三乙胺、正己烷、異丙醇3種溶液，稱取4.0 g硅膠并浸入含有100 mg TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的50 mL（0.05 mol/L）1，3，5-苯三甲酰氯的正己烷溶液中，將混合物攪拌30 min，再除去過量的正己烷溶液。5 min后，將50 mL（0.46 mol/L）哌嗪的異丙醇水溶液（滴加2 mL無水三乙胺）輕輕倒在硅膠上，靜置30 min后排出水溶液，再將其置于110℃烘箱中熱處理15 min，得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相。

1.7 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸液相色譜柱的制備

準確稱取4.0 g已過篩（250目）的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸于50 mL燒杯中，將其分散于40 mL正己烷－異丙醇（體積比9∶1）的混合液中，待懸浮均勻后快速倒入勻漿罐中，且以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）混合液為頂替液，在35 MPa壓力下將懸浮液填充至一個空的色譜柱（250 mm×4.6 mm）中保持5 min，然后將壓力調至25 MPa，保持30 min，緩慢減至常壓后將其取下，得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸液相色譜柱。

2 結果與討論

2.1 TpBD-（NO2）2、TpBD-（NH2）2及TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的表征

采用核磁共振氫譜（1H NMR）對合成的單體Tp進行表征：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：10.18（s，3H），14.15（s，3H）。

由圖2A可知，TpBD-（NO2）2在3.5°和26°處顯示出主要衍射峰，分別對應于（100）面和（001）面，該結果與AA堆疊排列的理論預測一致［11］。對比TpBD-（NO2）2、TpBD-（NH2）2以及衍生后所得的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸3個COFs材料的XRD圖發(fā)現(xiàn)，經(jīng)D-（－）-α-苯甘氨酸衍生后，CCOFs的衍射峰強度略有減弱（圖2A曲線c），原因可能是修飾上去的D-（－）-α-苯甘氨酸手性基團對該多孔材料產生了影響。

圖2 TpBD-（NO2）2（a）、TpBD-（NH2）2（b）及TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸（c）的XRD圖（A）和FT－IR圖（B）Fig.2 XRD patterns（A）and FT－IR spectra（B）of TpBD-（NO2）2（a），TpBD-（NH2）2（b）and TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine（c）

考察了TpBD-（NO2）2、TpBD-（NH2）2以及TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的FT－IR圖譜?？梢悦黠@看出TpBD（NO2）2還原為TpBD-（NH2）2后，其硝基（—NO2）在1 511 cm-1處的特征伸縮振動吸收峰減弱，并在1 295 cm-1處出現(xiàn)了對應于伯胺的C—N伸縮振動吸收峰，證明硝基已被成功還原為氨基。通過圖2B曲線c可知，經(jīng)D-（－）-α-苯甘氨酸手性修飾后的COFs在770 cm-1處的苯環(huán)伸縮振動吸收峰顯著增強，表明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸成功合成。

考察了TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的熱穩(wěn)定性，將其從25℃勻速升溫至800℃，所得熱重曲線見圖3。從圖3中可以看出，該材料在約300℃時方開始大量分解，說明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的熱穩(wěn)定性較好。

圖3 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的熱重曲線圖Fig.3 Thermogravimetric curve of TpBD-（NH2）2-D-（－）-αphenylglycine

由圖4可知，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸具有明顯的科頓（Cotton）效應，說明該物質具有手性。

圖4 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的CD圖Fig.4 CD diagram of TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine

此外，通過觀察硅膠和“網(wǎng)包法”制備的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相的SEM圖（圖5），發(fā)現(xiàn)TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸包裹在硅膠表面，表明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸材料通過“網(wǎng)包法”成功固載在硅膠表面。

圖5 硅膠（A）和“網(wǎng)包法”制備的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相（B）的SEM圖Fig.5 SEM images of silica gel（A）and TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine stationary phase prepared by“net-wrap”method（B）

為了測試TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的孔徑和比表面積大小，對其進行氮氣吸附測試（圖6），得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的比表面積為270 m2/g，孔體積為1.423 cm3/g；通過BJH分析得到該材料的孔徑大小為1.88 nm。

圖6 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的N2吸附－解吸附等溫曲線（A）及BJH孔尺寸分布曲線（B）Fig.6 N2 adsorption-desorption isothermal curve（A）and BJH hole size distribution（B）of TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine

2.2 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱拆分手性化合物

為了檢測TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對手性化合物的拆分性能。首先以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）為流動相，在流速0.6 mL/min，檢測波長230、210 nm，柱溫25℃的條件下，用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對手性化合物進行拆分，其在檢測波長為230 nm時拆分得到1-（9-蒽基）-2，2，2-三氟乙醇、反-1，2-二苯環(huán)氧乙烷、1-苯乙醇；在檢測波長為210 nm時拆分得到2-戊醇、3-丁炔-2-醇、γ-戊內酯、2-氯丙酸、氧化苯乙烯、2-氯環(huán)己酮、異丙基縮水甘油醚。其次，以甲醇－水（體積比9∶1）為流動相，在流速0.6 mL/min，檢測波長205 nm，柱溫25℃條件下，用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對手性化合物進行拆分，得到DL-絲氨酸、DL-蘇氨酸、DL-纈氨酸。拆分結果如表1所示。

表1 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對13種手性化合物的拆分結果Table 1 Separation results of 13 chiral compounds on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column

從分離結果可以看出，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對1-（9-蒽基）-2，2，2-三氟乙醇、反-1，2-二苯環(huán)氧乙烷、1-苯乙醇、3-丁炔-2-醇、γ-戊內酯、2-氯丙酸、DL-絲氨酸7種手性化合物達到了基線分離。而2-戊醇、氧化苯乙烯、2-氯環(huán)己酮、異丙基縮水甘油醚、DL-蘇氨酸、DL-纈氨酸6種手性化合物得到了不同程度的分離。圖7為TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對上述13種手性化合物的拆分譜圖。

圖7 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對13種手性化合物的拆分譜圖Fig.7 HPLC chromatograms on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column for the separation of 13 chiral compounds A－M were the same as those in Table 1

TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性填充柱對手性化合物的拆分能力可能來自COFs材料中規(guī)整的手性通道［22］。由于每個COFs分子都是手性的，且有一個可通達的空腔，使得分析物可以進入空腔并進行主客體包合，這在手性分離中起著重要作用。此外，CSP和手性物質之間的其他相互作用力也可能對分離過程產生一定的影響。

2.3 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱拆分苯系位置異構體

為了檢測TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對苯系位置異構體的拆分性能，以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）為流動相，在流速0.6 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫為25℃的條件下，用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱成功拆分了o，m，p-碘苯胺、o，m，p-氯苯胺、o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-溴苯胺、o，m，p-溴硝基苯5種苯系位置異構體。以上各苯系位置異構體的拆分結果見表2，圖8為其拆分譜圖。

圖8 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對5種苯系位置異構體的拆分譜圖Fig.8 HPLC chromatograms on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column for the separation of 5 benzene positional isomers

表2 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對5種苯系位置異構體的拆分結果Table 2 Separation results of 5 benzene positional isomers on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column

TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對苯系位置異構體的拆分，可能是由于誘導力、色散力、偶極之間的相互作用，以及包結作用等的共同作用，而對于某一系列的位置異構體拆分來說，起決定作用的可能是其中的某種作用力。此外，苯系位置異構體由于各個基團所處的位置不同，且鄰位、間位和對位分子之間的體積與長寬比也不一樣，因此在TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相上的受力有所差別，導致其在TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱上的保留時間各不相同，從而可得到一定程度的分離。

2.4 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱的重復性評價

為探究TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱的重復性，以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）為流動相，選用2-氯環(huán)己酮作為測試物，連續(xù)5次進樣，其保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.53%，峰面積的RSD為1.1%。結果表明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱具有較好的重復性。

3 結論

本文采用溶劑熱法合成了一種熱穩(wěn)定性較高的功能化CCOFs材料—TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸，并采用“網(wǎng)包法”制備了TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性固定相，將其用于制備HPLC手性柱，并對其手性拆分能力進行了考察。實驗結果表明，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱可拆分13種手性化合物和5種苯系位置異構體，其中對反-1，2-二苯環(huán)氧乙烷、1-（9-蒽基）-2，2，2-三氟乙醇、1-苯乙醇、3-丁炔-2-醇、γ-戊內酯、2-氯丙酸、DL-絲氨酸7種手性化合物達到了基線分離。因此，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸作為新型CSP具有較大的應用潛力。