楊斯惠，馬明芳，曹亞楠，任遠(yuǎn)航，萬(wàn) 燕，鄒 亮，彭鐮心,

（1.成都大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106；2.四川省雜糧產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，四川成都 610106；3.青海省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海西寧 810004）

雜糧是指除水稻、小麥、大豆、玉米和薯類作物以外的糧谷類作物[1]，具有生育期短、種植面積小、地域性強(qiáng)、種植方法特殊等種植特點(diǎn)[2]。谷類雜糧主要包括大麥、小米、青稞、燕麥、蕎麥等；豆類雜糧主要有綠豆、蕓豆、蠶豆、豌豆等[3]。隨著人們對(duì)膳食結(jié)構(gòu)多樣化和飲食均衡化重視的加深，人們逐步發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)飲食結(jié)構(gòu)和均衡膳食方面，雜糧是日常飲食中不可或缺的部分。與功能活性含量較低的稻谷、小麥相比，種類繁多的雜糧營(yíng)養(yǎng)成分含量更高[3]，其富含膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]，具有細(xì)糧不可替代的地位。我國(guó)作為雜糧生產(chǎn)大國(guó)，具有悠久的雜糧飲食文化，可雜糧產(chǎn)品主要集中于原糧，加工產(chǎn)品低端，如何充分利用雜糧生理功能活性物質(zhì)是雜糧開(kāi)發(fā)的方向之一。多糖物質(zhì)（如β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、纖維素）作為雜糧營(yíng)養(yǎng)組成的重要部分，對(duì)其功能活性深入研究于雜糧行業(yè)發(fā)展具有積極的意義。

多糖是由10個(gè)或10個(gè)以上的單糖經(jīng)過(guò)糖苷鍵聚合、脫水形成的天然高分子化合物[5]，主要分布于動(dòng)物、植物、藻類及微生物中[6]。根據(jù)來(lái)源不同，多糖可以被分為動(dòng)物多糖、植物多糖和微生物多糖[7]。作為多糖中的一種，廣泛存在于自然界植物體中的植物多糖具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、降血糖、益生作用等[8-9]。多糖作為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子化合物，其功能特性與結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)密切相關(guān)。因此，對(duì)多糖提取、分離技術(shù)的探究成為了研究多糖的鋪墊。目前，對(duì)多糖提取工藝的研究有熱水浸提、酸提法、堿提法、超聲波提取法等。其中，熱水浸提法是多糖中最常用的提取方法，具有經(jīng)濟(jì)、便捷、能較好地保存分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

近年來(lái)，植物多糖在加工、結(jié)構(gòu)和生物活性方面?zhèn)涫荜P(guān)注，成為越來(lái)越多科研工作者的研究熱點(diǎn)。其中針對(duì)雜糧多糖的研究也逐步增加。Hu等[10]通過(guò)DPPH法和ABTS法評(píng)估了柱層析純化后藜麥多糖的抗氧化能力，結(jié)果顯示，藜麥多糖對(duì)DPPH和ABTS自由基表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。Qian等[11]采用超聲輔助法提取大麥多糖，發(fā)現(xiàn)大麥多糖在總還原能力、清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基等方面具有抗氧化活性。Sargautiene等[12]探索了燕麥非淀粉多糖潛在益生作用，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌可以對(duì)燕麥非淀粉多糖進(jìn)行預(yù)消化，降低其β-葡聚糖的高粘度，使其他細(xì)菌能夠更容易利用半纖維素。Lin等[13]發(fā)現(xiàn)不同分子量的青稞β-葡聚糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的體外生長(zhǎng)抑制作用無(wú)明顯差異，分子質(zhì)量較低的青稞β-葡聚糖也具有較強(qiáng)的抗癌活性。雖然雜糧多糖的不同生物活性被逐步揭示，可目前研究更多集中于單種雜糧多糖的提取分離純化、理化特性及某種活性探究，由于提取、分析方法的差異，可比性不足，不利于雜糧的綜合評(píng)價(jià)。

本研究以燕麥、薏米、藜麥、糙米、黃小米、大麥、青稞、苦蕎、黑麥為原料，小麥作為對(duì)照，通過(guò)測(cè)定、比較10種多糖的抗氧化活性、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116活性以及對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響，綜合評(píng)價(jià)，篩選出活性強(qiáng)的多糖。以多糖為切入點(diǎn)，揭示其在雜糧中的功能作用，明確不同雜糧多糖的功效差異，為雜糧功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和雜糧多糖的合理利用提供理論依據(jù)，奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥、燕麥、薏米、藜麥 贛州康瑞農(nóng)產(chǎn)品有限公司；糙米、黃小米、大麥 福建盛耳食品有限公司；青稞 沈陽(yáng)信昌糧食貿(mào)易有限公司；苦蕎 云南健爽科技有限公司；黑麥 淶水縣金谷糧油食品有限公司；耐高溫α-淀粉酶（活性5萬(wàn)U/g）、高轉(zhuǎn)化率糖化酶（活性10萬(wàn)U/g） 河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；中性蛋白酶（活性10萬(wàn)U/g） 南寧東恒華道生物科技有限公司；長(zhǎng)雙歧桿菌（ATCC 15707）、短雙歧桿菌（ATCC 15700）、青春雙歧桿菌（ATCC 15703）、鼠李糖乳桿菌（ATCC 53103） 明州生物科技有限公司（中國(guó)寧波）；MRS培養(yǎng)基（不含葡萄糖） 山東拓普生物工程有限公司；TPY液體培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；HCT116細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640改性培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，F(xiàn)etal bovine serum） Gibco公司；NaOH（片狀）、鹽酸、無(wú)水葡萄糖、硫酸、苯酚、L(+)-抗壞血酸（VC）、硫酸亞鐵、水楊酸 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；30% H2O2分析純，成都市科龍化工試劑廠；Trolox標(biāo)準(zhǔn)品（水溶性VE）、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品、過(guò)硫酸鉀 上海麥克林生化科技有限公司；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司。

FE28型pH計(jì) 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；XMTD-7000恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FD-2型真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Synergy HTX多功能微孔板檢測(cè)儀酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；UPH-1-10T型超純水制造系統(tǒng) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；LDZX-50KB型高壓蒸汽滅菌鍋 上海中安醫(yī)療機(jī)構(gòu)廠；DHP-9160B生化培養(yǎng)箱 上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JJ-CJ-IFD超凈工作臺(tái) 蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取、分離 參考曾海龍[14]、王希[15]等的方法，略作修改。稱取100 g滅酶原料（原料米85 ℃烘1 h滅內(nèi)源酶活，備用），采用熱水提取法，料液比為1:20（g/mL），在100 ℃浸提2 h，過(guò)濾取上清液。調(diào)節(jié)溶液至pH5.5，在溶液中加入0.5 g耐高溫α-淀粉酶，93 ℃水浴30 min；加入1 g高轉(zhuǎn)化率糖化酶，60 ℃水浴處理30 min。在水浴溫度55 ℃下，再加入2 g中性蛋白酶，反應(yīng)30 min，再加熱至100 ℃滅酶10 min，收集酶解液。酶解液以1 mol/L NaOH液調(diào)至pH8.0，添加30% H2O2至淺黃色，于50 ℃下水浴加熱2 h。濃縮液體到原體積的1/4，向多糖溶液中逐漸加入4倍體積的無(wú)水乙醇，使體系中乙醇最終體積達(dá)到80%，4 ℃靜置24 h，離心取沉淀，冷凍干燥得粗多糖樣品。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定 參考楊雅蛟等[16]的方法，略作修改。取干燥后的多糖樣品用蒸餾水配制成濃度0.2 mg/mL的多糖溶液，備用。以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品（回歸方程為y=5.6483x+0.0094，R2=0.9993），采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。取1 mL多糖溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，混合均勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，置于40 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min，將反應(yīng)得到的溶液在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光值。

1.2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取干燥后的多糖樣品用蒸餾水配制成濃度5 mg/mL的多糖溶液。取2 mL 5 mg/mL多糖溶液，加入2 mL DPPH溶液，混勻暗反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定吸光度A1；取2 mL 5 mg/mL多糖溶液與2 mL無(wú)水乙醇溶液反應(yīng)測(cè)定吸光度A2；2 mL無(wú)水乙醇溶液與2 mL DPPH溶液反應(yīng)測(cè)定吸光度A0[17-18]。按下式計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。以Trolox標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，試驗(yàn)結(jié)果以每1 g干重（DW）樣品中等量Trolox（μmol）表示：μmol Trolox/g DW。

DPPH自由基清除率(%)=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.2.3.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定 參考李巨秀等[19]的方法，略作修改。取干燥后的多糖樣品用蒸餾水配制成濃度3 mg/mL的多糖溶液。取1 mL 3 mg/mL多糖溶液，加入4 mL ABTS溶液，混勻暗反應(yīng)10 min，在波長(zhǎng)為734 nm處測(cè)定吸光度A1；取1 mL 3 mg/mL多糖溶液與4 mL無(wú)水乙醇溶液反應(yīng)測(cè)定吸光度A2；1 mL蒸餾水與4 mL ABTS溶液反應(yīng)測(cè)定吸光度A0。按下式計(jì)算樣品的ABTS自由基清除率。以Trolox標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，試驗(yàn)結(jié)果以每1 g干重（DW）樣品中等量Trolox（μmol）表示：μmol Trolox/g DW。

1.2.3.3 羥自由基（·OH）清除率的測(cè)定 取干燥后的多糖樣品用蒸餾水配制成濃度3 mg/mL的多糖溶液。取2 mL H2O2（9 mmol/L）、FeSO4（9 mmol/L）、多糖溶液（3 mg/mL）混勻靜置10 min，加入2 mL水楊酸（9 mmol/L），混勻反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度A1；2 mL多糖溶液（3 mg/mL）與6 mL蒸餾水反應(yīng)測(cè)定吸光度A2；蒸餾水代替多糖溶液測(cè)得對(duì)應(yīng)吸光度A0[20]。按下式計(jì)算樣品的羥自由基清除率。以VC為對(duì)照品，試驗(yàn)結(jié)果以每1 g干重（DW）樣品中等量VC（μmol）表示：μmol VC/g DW。

1.2.4 對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響

1.2.4.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 鼠李糖乳桿菌：MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。

長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌：TPY培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 選擇長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌，活化后（OD600nm=0.5）以2%（v/v）的比例接種于不添加碳水化合物的液體培養(yǎng)基中，混勻后吸取180 μL于無(wú)菌96孔板中，加入20 μL多糖溶液（1%、10%）共培養(yǎng)，每個(gè)孔中多糖的最終濃度為0.1%、1%（w/v），每孔200 μL，每組分別設(shè)置6個(gè)平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔4 h檢測(cè)發(fā)酵液的OD600nm值，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇連續(xù)測(cè)定40 h，最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制微生物生長(zhǎng)曲線，以無(wú)碳水化合物培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以添加菊糖為唯一碳源的培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照[21-22]。

1.2.5 體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的活性測(cè)定采用MTT法測(cè)定雜糧多糖對(duì)HCT116細(xì)胞增殖抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，種板到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。吸棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度多糖的培養(yǎng)基100 μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)計(jì)5個(gè)復(fù)孔，將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48和72 h[23-25]。對(duì)照組（陰性對(duì)照）只加細(xì)胞和新鮮培養(yǎng)基，空白組不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液。按下式計(jì)算樣品的細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率（%）=[(對(duì)照組細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值)/(對(duì)照組細(xì)胞OD值-空白組OD值)]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，采用Excel 2010軟件分析整理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜糧粗多糖的多糖含量

不同雜糧粗多糖的多糖含量如圖1所示，小麥、黑麥、青稞、黃小米、糙米、薏米、燕麥、大麥、藜麥、苦蕎中的多糖含量分別為37.11%、10.61%、56.74%、40.24%、45.97%、49.89%、45.61%、57.59%、42.83%、36.11%。多糖含量最高的為大麥粗多糖（57.59%），與之前王希[26]報(bào)道水提法提取的大麥多糖中多糖含量為64.29%相接近，本研究中過(guò)氧化氫脫色步驟可能導(dǎo)致部分多糖的損失[14]；多糖含量最低的為黑麥粗多糖（10.61%）。

圖 1 不同雜糧粗多糖的多糖含量Fig.1 Polysaccharide content of crude polysaccharide in different coarse cereals

2.2 體外抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力 DPPH·（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，其最大吸收波長(zhǎng)為517 nm，被廣泛用于評(píng)價(jià)自由基清除活性[27-28]。如圖2所示，不同多糖對(duì)DPPH自由基清除能力具有顯著性差異（P＜0.05）。10種雜糧多糖中，苦蕎多糖的DPPH自由基清除能力顯著高于小麥多糖，達(dá)12.76 μmol Trolox/g DW；而黃小米、薏米、燕麥等5種雜糧多糖均顯著低于小麥多糖（P＜0.05），其中DPPH自由基清除能力最弱的是黃小米多糖。在結(jié)構(gòu)研究方面，王帥等[29]利用最小偏二乘分析初步分析純化后6種多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)對(duì)其體外抗氧化活性的影響，提出單糖的組成（葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖）和分子量能對(duì)多糖抗氧化活性起到影響。已有報(bào)道中，苦蕎多糖主要由葡萄糖、半乳糖組成[30]，小米多糖則由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖組成[31]。因此，苦蕎多糖和黃小米多糖清除DPPH自由基能力的差異可能是由于其單糖組成不同。除去單獨(dú)存在的多糖，多糖還可通過(guò)與蛋白質(zhì)、多肽以及酚類化合物的結(jié)合向缺乏電子的自由基提供質(zhì)子從而增強(qiáng)其抗氧化能[32]。故苦蕎多糖組清除能力強(qiáng)可能與多糖和酚類化合物的結(jié)合有關(guān)[33-34]。

圖 2 不同雜糧多糖的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging ability of different coarse cereal polysaccharides

圖 3 不同雜糧多糖的ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging ability of different coarse cereal polysaccharides

2.2.2 ABTS自由基清除能力 在反應(yīng)體系中，ABTS自由基與抗氧化物質(zhì)結(jié)合使體系褪色，通過(guò)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)734 nm下吸光度的變化評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力[35]。不同雜糧多糖的ABTS自由基清除能力如圖3所示。在ABTS自由基清除能力上，不同多糖間具有顯著性差異（P＜0.05）。10種多糖中苦蕎多糖顯著高于小麥多糖（P＜0.05），達(dá)39.56 μmol Trolox/g DW，而黑麥、黃小米、糙米、薏米和藜麥多糖均顯著低于小麥多糖（P＜0.05）。與DPPH自由基清除能力結(jié)果不同，ABTS自由基清除活性最弱的是薏米多糖（9.33 μmol Trolox/g DW）。復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)是造成多糖生物活性多變的重要原因。其中，單糖的組成和摩爾比是影響多糖的抗氧化活性的因素之一。孫元彬等[36]對(duì)純化得到的苦蕎多糖進(jìn)行單糖組成分析，發(fā)現(xiàn)其只含有葡萄糖和少量的木糖。莊瑋婧[37]發(fā)現(xiàn)水提法得到的薏米多糖由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖六種單糖組成。因此，葡萄糖含量高可能是苦蕎多糖ABTS自由基清除能力強(qiáng)的原因。從杏鮑菇菇頭[38]中提取的主要由葡萄糖組成（占84.4%）的多糖對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)的淬滅作用也印證了多糖的單糖組成與抗氧化活性具有相關(guān)性這一觀點(diǎn)。同時(shí)與DPPH自由基清除能力結(jié)果不同，在ABTS反應(yīng)體系中，10種多糖清除率明顯增大，這可能與ABTS的親水親脂特性及較大空間位阻有關(guān)[39]。

2.2.3 羥自由基（·OH）清除能力 羥自由基是活性氧中最具活力的，具有很強(qiáng)的電子氧化能力，是最有毒害的自由基，可對(duì)相鄰的生物分子造成損害[40-41]，加快生物體衰老，誘發(fā)疾病[42]。因此，清除羥自由基是體現(xiàn)多糖抗氧化作用的重要指標(biāo)之一。不同雜糧多糖的羥自由基清除能力如圖4所示。不同雜糧粗多糖間羥自由基清除能力有顯著差異（P＜0.05）。10種多糖中，苦蕎多糖的羥自由基清除能力顯著高于小麥多糖（P＜0.05），達(dá)1615.32 μmol VC/g DW，而與DPPH、ABTS自由基清除能力結(jié)果不同，僅燕麥多糖活性低于小麥多糖?？嗍w多糖比燕麥多糖表現(xiàn)出更高的羥自由基清除能力，這可能是由于其糖醛酸含量較高，糖醛酸含量的增加能增進(jìn)多糖的還原能力并減少羥自由基的產(chǎn)生[43]。據(jù)報(bào)道，苦蕎可溶性膳食纖維中含有糖醛酸26.10%[44]，燕麥多糖含糖醛酸5.9%[45]。研究表明，糖醛酸含量較高（33.27%±0.10%）的硫酸化涼草粉多糖自由基清除效果更佳[46]，這與之前Zhang等[47]的推測(cè)相似。同時(shí)，比較裙帶菜中不同分子質(zhì)量巖藻多糖的抗氧化性發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量（分子質(zhì)量小于1×104u）巖藻多糖對(duì)羥自由基清除能力更佳[48]。但鑒于本研究中未進(jìn)行多糖分子量測(cè)定，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，苦蕎中富含黃酮類物質(zhì)，李寧等[49]發(fā)現(xiàn)通過(guò)優(yōu)化聯(lián)合提取工藝即水提醇沉法可以提高苦蕎籽中的黃酮和多糖的提取率。之前的研究證明，苦蕎黃酮粗提物具有清除羥自由基的能力，可隨著對(duì)黃酮粗提物的精制，清除羥自由基的效果有所下降[50]，故苦蕎多糖表現(xiàn)出具有較強(qiáng)的抗氧化作用可能與黃酮的協(xié)同作用有關(guān)。

圖 4 不同雜糧多糖的羥自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging ability of different coarse cereal polysaccharides

本研究通過(guò)三種方法對(duì)不同雜糧多糖的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定?？傮w而言，苦蕎多糖表現(xiàn)出了良好的抗氧化能力。而不同多糖在DPPH、ABTS和羥自由基清除效果具有一定的差異。特別是小麥對(duì)照在清除DPPH、ABTS自由基上表現(xiàn)出優(yōu)于部分雜糧多糖，但對(duì)羥自由基清除能力較弱。阿拉伯木聚糖，也稱為戊聚糖，作為一種非淀粉多糖廣泛存在于谷物中，特別在小麥籽粒中尤為豐富[51]。因其分子結(jié)構(gòu)中具有一定的阿魏酸基團(tuán)，阿拉伯木聚糖具有抗氧化活性[52]。在之前的報(bào)道中，具有較高的分子量和酯化阿魏酸的阿拉伯木聚糖被認(rèn)為是較好的抗氧化劑[52-53]。Chen等[53]發(fā)現(xiàn)低取代度有益于阿拉伯木聚糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的羥自由基清除活性，與之相反，阿拉伯木聚糖的DPPH自由基清除活性隨取代度的增加而提高，因?yàn)槿〈仍礁叩陌⒗揪厶歉追稚⒌椒磻?yīng)混合物中參與氧化還原反應(yīng)。因此，對(duì)照小麥中阿拉伯木聚糖取代度較高可能是清除DPPH、ABTS自由基能力較佳，對(duì)羥自由基清除能力較弱的原因之一。

2.3 對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響

本研究采用體外單菌培養(yǎng)方法對(duì)不同雜糧多糖的益生活性進(jìn)行分析。不同雜糧多糖對(duì)益生菌的增殖具有菌株特異性（圖5）。在多糖濃度為0.1%時(shí)，除黑麥、青稞多糖外，其余8種多糖均能作為唯一碳源被長(zhǎng)雙歧桿菌利用（圖5a）；除黑麥、薏米多糖外，短雙歧桿菌能利用其余8種多糖生長(zhǎng)增殖（圖5b）；10種多糖對(duì)青春雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用不明顯，均低于菊糖（圖5c）；而鼠李糖乳桿菌則能利用10種多糖作為唯一碳源生長(zhǎng)增殖（圖5d）。在多糖濃度為1%時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌不能利用10種多糖，培養(yǎng)40 h后發(fā)酵液OD600nm與陰性對(duì)照無(wú)糖培養(yǎng)基相近（圖5e），這可能與多糖的濃度具有一定關(guān)系，多糖濃度過(guò)高可能導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓增加，從而導(dǎo)致菌體脫水，影響益生菌生長(zhǎng)[54-55]；黃小米和大麥多糖對(duì)短雙歧桿菌的益生活性高于菊糖，燕麥多糖與菊糖對(duì)短雙歧桿菌的益生活性相近（圖5f）；黃小米和大麥多糖對(duì)青春雙歧桿菌的益生活性高于菊糖，燕麥多糖與菊糖對(duì)青春雙歧桿菌的益生活性相近（圖5g）；鼠李糖乳桿菌能利用黃小米、燕麥、糙米和大麥多糖作為唯一碳源生長(zhǎng)增殖（圖5h）。本研究結(jié)果顯示，濃度為1%時(shí)，黃小米、大麥、燕麥多糖能夠更易被短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌選擇利用，對(duì)照小麥多糖則表現(xiàn)出抑制4種益生菌增長(zhǎng)的趨勢(shì)，同時(shí)不同雜糧多糖對(duì)益生菌的增殖作用不全是隨著濃度增加而增強(qiáng)。據(jù)劉麗莎等[56]報(bào)道，高濃度（添加量大于2.0%）的白術(shù)多糖可能引起滲透壓、pH改變及代謝物的積累等限制了雙歧桿菌的生長(zhǎng)。同樣，張桂蘭等[57]也發(fā)現(xiàn)褐藻硫酸多糖濃度為2.0%～2.5%時(shí)對(duì)雙歧桿菌增殖作用最好；濃度大于5%時(shí)，雙歧桿菌數(shù)量無(wú)明顯增加。而來(lái)源不同的多糖對(duì)不同的益生菌作用不同，這也可能與其高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、物理特性密切相關(guān)[58]，例如，水溶性高和黏度低的多糖被認(rèn)為可以更快、更易被益生菌利用[59]，因此還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖 5 不同雜糧多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effects of polysaccharides from different coarse cereals on the growth of probiotics

2.4 體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的活性測(cè)定

對(duì)10種多糖進(jìn)行體外MTT增殖抑制試驗(yàn)初篩抗腫瘤活性，其中小麥、黃小米、糙米、薏米和大麥多糖對(duì)HCT116細(xì)胞有一定抑制作用，其余5種多糖對(duì)HCT116細(xì)胞沒(méi)有明顯抑制作用。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取5個(gè)濃度梯度，48、72 h兩個(gè)時(shí)間梯度，對(duì)具有抑制作用的5種多糖進(jìn)行MTT試驗(yàn)，如圖6、圖7所示，利用SPSS軟件分析計(jì)算得出其對(duì) HCT116細(xì)胞的半數(shù)致死濃度 IC50，不同多糖之間 IC50具有顯著差異（P＜0.05），如圖8所示。隨著對(duì) HCT116細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，5種多糖抑制率也相應(yīng)提高，表現(xiàn)出時(shí)間依賴關(guān)系。

圖 6 48 h下不同濃度小麥（a）、黃小米（b）、糙米（c）、薏米（d）、大麥（e）多糖對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制活性Fig.6 Inhibitory activity of different concentrations of wheat (a), yellow millet (b), brown rice (c), adlay (d) and barley (e)polysaccharides on HCT116 cells at 48 h

圖 7 72 h下不同濃度小麥（A）、黃小米（B）、糙米（C）、薏米（D）、大麥（E）多糖對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制活性Fig.7 Inhibitory activity of different concentrations of wheat (A), yellow millet (B), brown rice (C), adlay (D) and barley (E)polysaccharides on HCT116 cells at 72 h

圖 8 HCT116細(xì)胞上不同雜糧多糖的IC50值Fig.8 IC50 values of polysaccharides from different coarse cereals on the HCT116 cells

在48 h，小麥、黃小米、糙米、薏米和大麥多糖的IC50值分別為1.24、2.90、1.40、1.79、2.82 mg/mL。對(duì)比 IC50值大小說(shuō)明 48 h 下不同多糖抑制 HCT116細(xì)胞增殖的活性強(qiáng)弱：小麥＞糙米＞薏米＞大麥＞黃小米。在72 h，小麥、黃小米、糙米、薏米和大麥多糖的IC50值分別為0.98、2.55、1.33、1.23、2.82 mg/mL。對(duì)比 IC50值大小說(shuō)明 72 h 下不同多糖抑制 HCT116細(xì)胞增殖的活性強(qiáng)弱：小麥＞薏米＞糙米＞黃小米＞大麥。李彩嬌[8]曾證明大麥多糖對(duì)HT 29結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制作用，且通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與本研究中大麥多糖抑制HCT116細(xì)胞活性的途徑是否一致，可以作進(jìn)一步研究。令人意外的是，48、72 h下5種多糖中對(duì)照小麥多糖抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性最強(qiáng)。之前的報(bào)道中，Murtazina等[60]已證實(shí)通過(guò)培養(yǎng)小麥細(xì)胞提取獲得小麥細(xì)胞培養(yǎng)多糖（wheat cell culture polysaccharides，WCCPSs）具有抗HCT 116結(jié)腸癌細(xì)胞能力并提出從WCCPSs的單糖組成比例來(lái)看，葡萄糖的含量和葡萄糖:阿拉伯糖:甘露糖的比例可能是決定抗癌活性的主要因素。但小麥多糖具體如何表現(xiàn)出較高的抑制HCT 116細(xì)胞活性的原因和構(gòu)效關(guān)系，有必要進(jìn)一步深入探究。綜上，明確多糖結(jié)構(gòu)與抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性的構(gòu)效關(guān)系以及多糖抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖機(jī)制仍是需要廣大研究者們投入研究的關(guān)鍵。

3 結(jié)論

本研究以9種雜糧多糖為研究對(duì)象，小麥多糖為對(duì)照，對(duì)比了十種多糖的抗氧化活性、體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的活性和對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，不同雜糧多糖在三種體外活性上存在顯著性差異。十種多糖對(duì)DPPH、ABTS和羥自由基均具有清除能力。其中，苦蕎多糖對(duì)三種自由基的清除能力最強(qiáng)。在對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響上，1%濃度的黃小米、大麥、燕麥多糖能夠更易被短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌選擇利用。在48 h下多糖抑制HCT116細(xì)胞增殖的活性強(qiáng)弱：小麥＞糙米＞薏米＞大麥＞黃小米，在72 h下多糖抑制HCT116細(xì)胞增殖的活性強(qiáng)弱：小麥＞薏米＞糙米＞黃小米＞大麥。本研究通過(guò)測(cè)定比較不同雜糧多糖的三種體外活性，明確不同雜糧多糖在體外活性上的差異，為雜糧多糖的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，為其在食品、生物等不同領(lǐng)域的精準(zhǔn)利用提供思路。

本研究?jī)H對(duì)9種谷類雜糧進(jìn)行了研究，然而雜糧種類豐富，品系龐雜，如何綜合評(píng)價(jià)不同種類雜糧多糖生理活性將是一重大挑戰(zhàn)。此外，本研究采用熱水浸提法提取不同雜糧中的多糖，而熱水浸提得到的大多是分子量較小的中性多糖[61]，如采用酸提法、堿提法、酶解法等不同方法提取，得到的多糖結(jié)構(gòu)不同，其在體外活性上的強(qiáng)弱可能會(huì)隨結(jié)構(gòu)的改變而產(chǎn)生變化。本文未對(duì)各種雜糧多糖進(jìn)一步的純化和鑒定，存在一定局限，但也為不同雜糧的活性差異提供重要參考。未來(lái)，可對(duì)活性較強(qiáng)的雜糧多糖進(jìn)一步分離純化，探討其活性機(jī)制。