曾順良 綜述，曾 濤 審校

1.潮州衛(wèi)生學(xué)校，廣東潮州 521041；2.廣東省惠州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東惠州 516001

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是后天獲得性干細(xì)胞疾病，是部分造血干細(xì)胞磷脂酰肌醇聚糖A(PIG-A)基因突變及其非惡性克隆所致。PIG-A基因突變的造血干細(xì)胞經(jīng)克隆及多向分化，將缺陷經(jīng)各系祖細(xì)胞依次傳導(dǎo)至下游各階段血細(xì)胞，使其性能改變而致PNH患者產(chǎn)生慢性(陣發(fā)性)血管內(nèi)溶血、外周血細(xì)胞減少、血栓形成等各異的主要臨床表現(xiàn)[1-3]。正常PIG-A基因表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶是血細(xì)胞膜糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成的關(guān)鍵酶[4]。異常PIG-A基因表達(dá)的蛋白，部分或全部不具有糖基轉(zhuǎn)移酶功能，導(dǎo)致血細(xì)胞膜GPI合成障礙，使包括抑制補(bǔ)體溶細(xì)胞效應(yīng)的同源抑制因子(衰變加速因子/CD55、膜反應(yīng)性溶血抑制物/CD59)在內(nèi)的一組GPI錨連蛋白，在血細(xì)胞外膜表現(xiàn)為部分缺失或全部缺失。CD55、CD59缺失程度決定PNH紅細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體溶細(xì)胞效應(yīng)的靈敏度[5]，也是PNH紅細(xì)胞分為正常敏感的Ⅰ型、中度敏感的Ⅱ型及高度敏感的Ⅲ型的依據(jù)[6]。高度敏感的Ⅲ型紅細(xì)胞多寡是血管內(nèi)溶血嚴(yán)重與否的關(guān)鍵因素。

PIG-A基因突變的造血干細(xì)胞克隆大小存在差別、異?？寺≌急雀叩团c正常克隆并存等，使不同患者或是同一患者在疾病不同階段的表現(xiàn)各異，易致誤診、漏診。隨著發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入、實(shí)驗(yàn)室檢查多種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，PNH的診治得以進(jìn)一步完善。本文就PNH實(shí)驗(yàn)室檢查綜述如下。

1 初篩性實(shí)驗(yàn)室檢查

1.1外周血細(xì)胞及相關(guān)參數(shù)檢查 多數(shù)PNH患者有不同程度的貧血，可呈正色素性貧血或低色素性貧血(尿液丟失鐵過(guò)多時(shí))；常伴有白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)減低，網(wǎng)織紅細(xì)胞常增高，但骨髓增生減低時(shí)，網(wǎng)織紅細(xì)胞可減低。

1.2血管內(nèi)溶血檢查

1.2.1尿液檢查 尿含鐵血黃素檢查又稱Rous試驗(yàn)，用于定性篩查慢性血管內(nèi)溶血。血管內(nèi)溶血釋放的血紅蛋白通過(guò)腎臟濾過(guò)排出時(shí)，可被腎小管上皮細(xì)胞吸收、分解，并以含鐵血黃素形式沉積于腎小管內(nèi)，這種細(xì)胞經(jīng)普魯士藍(lán)反應(yīng)呈現(xiàn)即為Rous試驗(yàn)陽(yáng)性。有研究發(fā)現(xiàn)，Rous試驗(yàn)的靈敏度可達(dá)73%[7]。慢性溶血發(fā)病初期，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)含鐵血黃素低于檢測(cè)下限，或是含鐵血黃素上皮細(xì)胞未脫落至尿液排出，Rous試驗(yàn)皆可呈陰性。此外，血管內(nèi)溶血發(fā)作時(shí)，尿血紅蛋白及潛血為陽(yáng)性。因此，應(yīng)注意PNH患者陣發(fā)性血管內(nèi)溶血的特點(diǎn)，分時(shí)段多次采集尿標(biāo)本檢查其含鐵血黃素、血紅蛋白、潛血，以免漏檢。

1.2.2生化檢查 血管內(nèi)溶血發(fā)作期內(nèi)，外周血可出現(xiàn)游離血紅蛋白、血清乳酸脫氫酶、間接膽紅素水平等增高及結(jié)合珠蛋白水平降低。

1.3蔗糖溶血試驗(yàn) 依據(jù)PNH患者紅細(xì)胞在含補(bǔ)體、低離子強(qiáng)度的高滲蔗糖溶液中發(fā)生滲透性溶血而設(shè)定。靈敏度較高、陰性可排除PNH，但特異性不強(qiáng)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。部分自身免疫性溶血性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血等可有假陽(yáng)性[8]，陽(yáng)性者必須通過(guò)酸化血清溶血試驗(yàn)或檢測(cè)PNH克隆標(biāo)志加以確證。

2 確證性實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1特異性補(bǔ)體溶血試驗(yàn)

2.1.1酸化血清溶血試驗(yàn) 酸化血清溶血試驗(yàn)又稱Ham試驗(yàn)，基于PNH補(bǔ)體高敏感型紅細(xì)胞于酸性、補(bǔ)體環(huán)境中易遭破壞的原理，特異度較高，但陽(yáng)性率與PNH患者血液中Ⅲ型紅細(xì)胞存量有關(guān)，且易受輸注正常同型紅細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)前患者異常細(xì)胞破壞程度等的影響。何秋陽(yáng)等[9]采用Ham試驗(yàn)檢測(cè)40例PNH患者外周血的結(jié)果顯示，陽(yáng)性率為 65.0%，陰性率為35.0%；吳瓊等[10]對(duì)7例經(jīng)新型方法確證PNH患者的研究發(fā)現(xiàn)，2例為Ham試驗(yàn)陰性，應(yīng)用該試驗(yàn)診斷PNH時(shí)，需要多次重復(fù)或輔以其他方法來(lái)確證，某些自身免疫性溶血性貧血患者Ham試驗(yàn)也可為陽(yáng)性[8]。

2.1.2蛇毒因子溶血試驗(yàn) 蛇毒激活補(bǔ)體致PNH高度敏感的Ⅲ型紅細(xì)胞溶解破壞，陽(yáng)性率與Ham試驗(yàn)相近，也受輸血、標(biāo)本中異常細(xì)胞存量等的影響。

2.2新型確證試驗(yàn)

2.2.1CD55、CD59檢測(cè) CD55、CD59缺失是PNH細(xì)胞典型表現(xiàn)及PNH患者溶血的致病因素，故常將其作為PNH克隆的標(biāo)志。隨著流式細(xì)胞術(shù)和熒光標(biāo)記單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血細(xì)胞CD55、CD59缺失用于PNH診斷、預(yù)后判斷，成為目前臨床上可靠、常用的方法[11-13]。

PNH造血干細(xì)胞多向分化，使PIG-A基因突變，除紅細(xì)胞外還會(huì)累及粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等。外周血白細(xì)胞不受輸注正常紅細(xì)胞的影響，白細(xì)胞尤其是占比最高的粒細(xì)胞錨連蛋白檢測(cè)對(duì)于診斷PNH，比單獨(dú)檢測(cè)紅細(xì)胞更有價(jià)值[10，14-15]，但外周血粒細(xì)胞檢測(cè)CD55、CD59仍受骨髓衰竭致外周血細(xì)胞減少的影響。有研究指出，檢測(cè)骨髓紅系、粒系細(xì)胞的CD55、CD59比外周血更有意義[16]。PIG-A基因突變克隆的造血干細(xì)胞在骨髓中逐步分化發(fā)育，歷經(jīng)祖細(xì)胞、原始細(xì)胞、幼稚細(xì)胞、成熟細(xì)胞等及成熟階段釋放至外周血，不難看出，骨髓中出現(xiàn)血細(xì)胞CD55、CD59缺失早于外周血。故以CD55、CD59檢測(cè)診斷PNH時(shí)，除開(kāi)展外周血多種細(xì)胞組合檢測(cè)外，還可檢測(cè)骨髓紅系、粒系細(xì)胞，以供早期診斷及避免漏診，但目前仍缺乏檢測(cè)骨髓CD55、CD59用以診斷PNH的定量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2GPI錨連蛋白檢測(cè) (1)嗜水氣單胞菌毒素(HEC)溶血試驗(yàn)。嗜水氣單胞菌產(chǎn)生具有溶血、細(xì)胞毒性等生物活性的毒素，簡(jiǎn)稱HEC，能特異性結(jié)合GPI錨連蛋白并與之形成異源多聚物膜通道致正常紅細(xì)胞溶解破壞，留存GPI錨連蛋白缺失的PNH細(xì)胞，此研究為PNH確證試驗(yàn)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。有研究顯示，國(guó)內(nèi)學(xué)者應(yīng)用HEC溶血試驗(yàn)與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD59缺失細(xì)胞進(jìn)行比對(duì)，得出HEC溶血試驗(yàn)PNH細(xì)胞留存率與流式細(xì)胞術(shù)CD59缺失檢測(cè)率一致的結(jié)論[17-18]。HEC溶血試驗(yàn)多為手工法，不需昂貴儀器，但尚無(wú)統(tǒng)一的方法流程及標(biāo)準(zhǔn)，且難以進(jìn)行質(zhì)量控制。(2)熒光標(biāo)記氣溶素(FLAER)技術(shù)。綠色熒光染料Alexa-488標(biāo)記嗜水氣單胞菌溶素前體變異體簡(jiǎn)稱FLAER。FLAER能特異性標(biāo)記血細(xì)胞GPI錨連蛋白，但不致血細(xì)胞溶解破壞，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外用以佐證特異性補(bǔ)體溶血試驗(yàn)、CD59等缺失及診斷PNH的新技術(shù)。梁悅怡等[19]應(yīng)用FLAER多參數(shù)與 CD59缺失對(duì)比檢測(cè)9例PNH患者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LAER檢測(cè)結(jié)果明顯高于CD59缺失檢測(cè)，其中2例FLAER缺失率分別為88.1%、23.2%，而CD59缺失率僅分別為7.8%、5.5%。楊柯等[20]對(duì)22例PNH患者采用多參數(shù)流式細(xì)胞儀同時(shí)檢測(cè)外周血粒細(xì)胞CD55缺失、CD59缺失和FLAER陰性細(xì)胞比例，作為檢出PNH的克隆數(shù),結(jié)果顯示，F(xiàn)LAER技術(shù)檢測(cè)FLAER陰性細(xì)胞的檢出率及克隆數(shù)均依次高于CD55缺失、CD59缺失。FLAER技術(shù)比檢測(cè)CD55、CD59更敏感[21-22]，對(duì)一些無(wú)血紅蛋白尿、尿含鐵血黃素等溶血證據(jù)、特異性補(bǔ)體溶血陰性、不能檢出CD55及CD59缺失但臨床上高度懷疑的病例，可用FLAER技術(shù)佐證或排除。

3 PNH實(shí)驗(yàn)室檢查的建議

3.1鑒別 目前，實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷PNH的主要手段，基本流程為先初篩再確證。初篩性實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果并非PNH特有，應(yīng)注意加以鑒別：多數(shù)白血病、惡性組織細(xì)胞病、再生障礙性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血、脾功能亢進(jìn)、骨髓增生異常綜合征等可有外周血全血細(xì)胞(或一系、二系)減少的表現(xiàn)；內(nèi)在缺陷或外在因素導(dǎo)致的急、慢性血管內(nèi)溶血均有網(wǎng)織紅細(xì)胞升高(骨髓衰竭除外)及上述生化指標(biāo)異常、尿潛血陽(yáng)性；自身免疫、藥物等因素可引起慢性持續(xù)性血管內(nèi)溶血而致Rous試驗(yàn)陽(yáng)性。

3.2PNH確證方法的選擇 我國(guó)制定的PNH診斷標(biāo)準(zhǔn)顯示，血管內(nèi)溶血檢查如尿隱血、含鐵血黃素試驗(yàn)等，傳統(tǒng)特異性補(bǔ)體溶血試驗(yàn)如酸化血清溶血試驗(yàn)、蔗糖溶血試驗(yàn)、蛇毒因子溶血試驗(yàn)等，均是其診斷的重要方法[6]。PNH診斷標(biāo)準(zhǔn)還將外周血中性粒細(xì)胞或紅細(xì)胞CD55缺失或CD59缺失>10%(5%～10%為可疑)作為確證試驗(yàn)。因此，應(yīng)根據(jù)診斷需求、所在實(shí)驗(yàn)室的具體條件、相關(guān)試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇適宜的PNH確證方法。就基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室而言，不需要昂貴儀器和試劑，選擇特異度較高的補(bǔ)體溶血試驗(yàn)，仍不失為較理想的初診方法，需進(jìn)一步確證分型時(shí)可將標(biāo)本送至上級(jí)醫(yī)院或第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)；對(duì)于三甲以上醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室，則可在傳統(tǒng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用CD55缺失、CD59缺失檢測(cè)及FLAER技術(shù)，提高診斷的靈敏度。