祁 傲，胡慧敏 綜述,陳世平 審校

1.中國(guó)藥科大學(xué)綜合門診部，江蘇南京 210000； 2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院微生物室，江蘇南京 210000 ；3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇南京 210000

隱球菌是擔(dān)子菌酵母類真菌，廣泛分布于自然界，在鴿糞中大量存在，也可存在于人體表面、口腔和腸道中。隱球菌屬包括17個(gè)種和8個(gè)變種，其中對(duì)人致病最主要的是新型隱球菌及其變種[1]。隱球菌病是由新型隱球菌引起的深部真菌病，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺，常發(fā)生于惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤或應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素或化療等免疫功能低下的患者[2]。2015年，F(xiàn)ANG等[3]報(bào)道了我國(guó)免疫功能正常人群發(fā)生隱球菌感染的病例。隱球菌的毒力因子包括莢膜、黑色素、脲酶、磷脂酶、降解酶等。常見抗新型隱球菌感染的藥物包括多烯類、唑類、核酸抑制劑類。近年來，隱球菌耐藥問題日漸突出，成為其感染治療失敗的一個(gè)重要原因。氟康唑治療過程中出現(xiàn)耐藥可能與藥物劑量不達(dá)標(biāo)或治療缺乏依從性有關(guān)[4]。臨床上耐藥菌株的產(chǎn)生通常是多種因素共同作用的結(jié)果[5]。本文對(duì)隱球菌耐藥機(jī)制綜述如下。

1 隱球菌的耐藥機(jī)制

1.1生物膜的形成 生物膜是菌體適應(yīng)外部環(huán)境、抵抗外界傷害所做出的反應(yīng)，它是一種由融合的芽生孢子層、菌絲成分和細(xì)胞外多聚基質(zhì)組成的二維結(jié)構(gòu)[6]。形成生物膜的能力是新型隱球菌抗性的表現(xiàn)，膜內(nèi)菌對(duì)藥物、高溫、寒冷、紫外線等更具抵抗性，生物膜形成可導(dǎo)致患者出現(xiàn)臨床耐藥并反復(fù)感染[6]。通常，新型隱球菌可在各種組織上形成生物膜并將自身包裹，阻止或延緩抗真菌藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這些組織可以是活組織，也可以是無活力組織。細(xì)胞外多聚基質(zhì)形成的生物屏障是菌株出現(xiàn)多重耐藥的主要原因。有研究證實(shí)，有生物膜的菌株比浮游菌株對(duì)各種抗真菌藥物有不同程度的抗藥性，尤其是對(duì)唑類具有完全抗藥性[7-8]。生物膜除了作為生物屏障防止藥物進(jìn)入菌體外，還可以通過限制營(yíng)養(yǎng)的方式減緩菌體生長(zhǎng)，從而避免因菌體活性過高被藥物殺傷[9]。ROBERTSON等[10]研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)分泌的乙二胺四乙酸能阻止生物膜形成，這種阻止可以在加入二價(jià)陽離子(如鎂、鈣)后逆轉(zhuǎn)，提示缺乏二價(jià)陽離子可抑制生物膜形成。這一發(fā)現(xiàn)可能成為隱球菌耐藥病例治療新的突破口。

1.2麥角固醇合成酶基因(ERG11)改變 麥角固醇由真菌合成，是真菌細(xì)胞膜的主要組分，也是唑類抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)。14-α-去甲氧基酶是合成麥角固醇的關(guān)鍵酶，該酶由ERG11編碼。唑類藥物通過黏附作用限制14-α-去甲氧基酶的活性，影響細(xì)胞膜形成而發(fā)揮抗真菌作用。ERG11改變包括基因高表達(dá)和基因突變，高表達(dá)意味著合成更多的14-α-去甲氧基酶，且需要更高的藥物濃度來抑制該酶；基因突變導(dǎo)致藥物對(duì)該酶的親和力降低[11-12]，從而使耐藥性增加。有學(xué)者通過分析某些耐藥菌株ERG11的基因序列，發(fā)現(xiàn)一位點(diǎn)上甘氨酸484被絲氨酸替代，此為氟康唑耐藥的突變位點(diǎn)，與氟康唑最低抑菌濃度提高密切相關(guān)[13]。

1.3藥物外排增加 藥物外排增加使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少，從而產(chǎn)生對(duì)抗真菌藥物的耐藥性。藥物外排增加可由菌株內(nèi)多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)來實(shí)現(xiàn)。多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，前者在新型隱球菌中發(fā)揮主要作用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有三大家族參與藥物外排，分別是多藥耐藥家族、多藥耐藥相關(guān)蛋白家族、多效性耐藥家族[14]。新型隱球菌中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由抗真菌藥物耐藥基因1(AFR1)編碼，在耐唑類藥物菌株中呈高表達(dá)[14]，提示AFR1上調(diào)與新型隱球菌的唑類抗性密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、棘白菌素的靈敏度無明顯作用[15]。

1.4基因組的可塑性 染色體重排、異染色體形成、非整倍體或二倍體形成均是基因組可塑性的體現(xiàn)，可以影響藥物作用靶點(diǎn)或外排泵的表達(dá)，從而產(chǎn)生耐藥。新型隱球菌分為A、B、C、D和AD 5個(gè)血清型[16]，SIONOV等[17]在血清型A和D的菌株中發(fā)現(xiàn)了染色體二倍體，這是新型隱球菌為了適應(yīng)氟康唑而形成的。染色體二倍體數(shù)量越多，菌株耐受氟康唑的濃度越高，一旦停止用藥后，二倍體數(shù)量減少，可使原本耐藥菌株重新回到敏感水平。抗真菌藥物可通過隱球菌凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)誘發(fā)新型隱球菌類似細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡，新型隱球菌可通過下調(diào)AIF表達(dá)而減少細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，剔除AIF可促進(jìn)染色體多倍體形成，從而對(duì)氟康唑產(chǎn)生耐藥[18-19]。新型隱球菌耐藥主要體現(xiàn)在1號(hào)染色體上，1號(hào)染色體的重塑與ERG11和AFR1 2個(gè)基因關(guān)系甚密，這種適應(yīng)機(jī)制最終導(dǎo)致氟康唑治療隱球菌病失敗或者在維持治療過程中復(fù)發(fā)。

1.5異質(zhì)性耐藥 異質(zhì)性耐藥的特點(diǎn)是在敏感菌株的單個(gè)菌落內(nèi)出現(xiàn)高耐藥水平的較小亞群，是真菌耐藥的一種特殊類型。MONDON等[20]報(bào)道了新型隱球菌對(duì)氟康唑的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，新型隱球菌對(duì)唑類的異質(zhì)性耐藥廣泛存在，這種耐藥是固有的，且與菌株的毒力有關(guān)，但耐藥水平與其毒力水平不一定呈正相關(guān)[7]。新型隱球菌異質(zhì)性耐藥的出現(xiàn)通常與患者長(zhǎng)期應(yīng)用某種藥物有關(guān)。藥物長(zhǎng)期作用導(dǎo)致新型隱球菌的染色體發(fā)生變異，從而引起其表型變化，體現(xiàn)在隱球菌生長(zhǎng)模式、形態(tài)和毒力等方面，這可能是隱球菌病在治療過程中即使抗真菌藥物沒有停用，疾病也會(huì)加重或復(fù)發(fā)的原因。當(dāng)藥物壓力作用消失，這種耐藥性也會(huì)隨之消失，菌株可以恢復(fù)到原來的敏感水平[21]。有研究表明，異質(zhì)性耐藥主要出現(xiàn)在唑類單藥治療過程中，聯(lián)合治療可有效避免異質(zhì)性耐藥產(chǎn)生，如氟康唑聯(lián)合5-氟胞嘧啶治療可有效抑制體內(nèi)耐藥亞群擴(kuò)增[22-23]，研究其異質(zhì)性耐藥水平有助于在長(zhǎng)期維持治療過程中合理使用氟康唑。

1.6真菌耐藥性的表觀遺傳機(jī)制 表觀遺傳不是通過改變DNA序列或蛋白質(zhì)編碼，而是由DNA序列修飾以外的因素介導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)[24]，這一作用是瞬間影響，主要有基于RNA和基于染色質(zhì)修飾兩種機(jī)制，與隱球菌密切相關(guān)的為基于染色質(zhì)修飾。染色質(zhì)修飾主要有兩種：結(jié)構(gòu)修飾和化學(xué)修飾。結(jié)構(gòu)修飾指DNA-DNA相互作用和染色質(zhì)重塑，化學(xué)修飾指烷基化、磷酸化、泛素化等。目前已知新型隱球菌中HDAC基因參與了染色質(zhì)的去乙?；^程，它被證實(shí)是可以調(diào)節(jié)菌株毒力和適應(yīng)外界壓力所需的基因[24]，一旦該基因缺失，將導(dǎo)致菌株毒力下降及對(duì)外界壓力敏感[25]。

1.7應(yīng)激反應(yīng)通路的調(diào)節(jié) 微生物具有對(duì)抗外界各種壓力刺激的能力，其中抗菌藥物就是重要的外界壓力刺激，這種能力通過復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)通路實(shí)現(xiàn)。分子伴侶蛋白熱休克蛋白90(HSP90)能維持各種酶的穩(wěn)定性，是真菌對(duì)抗真菌藥物應(yīng)激反應(yīng)通路中必不可少的關(guān)鍵蛋白，它通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶控制應(yīng)激反應(yīng)，包括耐藥性。有研究顯示，HSP90可以增加新型隱球菌對(duì)唑類和棘白菌素的抗性，抑制其表達(dá)能有效降低新型隱球菌的耐藥性[26]。

1.8其他耐藥基因的表達(dá)

1.8.1同源基因(PKH) 新型隱球菌PKH在其生物活動(dòng)及隱球菌病發(fā)病機(jī)制信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。PKH又稱磷酸肌醇激酶1，有PKH1、PKH2、PKH3 3種，PKH1和PKH2主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生命功能，包括細(xì)胞RNA的新陳代謝、維持細(xì)胞壁的完整性及鞘脂生物合成等；PKH3主要參與新型隱球菌的抗性形成，包括其毒力、氧化應(yīng)激及抗真菌藥物[27]，尤其是對(duì)氟康唑和兩性霉素B的耐藥。此外，PKH2還與新型隱球菌抑制腫瘤壞死因子及產(chǎn)生氧自由基有關(guān)?？傊?，PKH參與調(diào)節(jié)了新型隱球菌的抗性。

1.8.2Kar2 Kar2是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)通路下游重要的分子伴侶，參與UPR信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的各種活動(dòng)。JUNG等[28]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Kar2的新型隱球菌因不能耐受應(yīng)激、高熱、抗真菌藥物等外界壓力而易出現(xiàn)死亡；相反，Kar2超表達(dá)則可有效解決錯(cuò)誤蛋白質(zhì)折疊，使毒性蛋白降解，維持細(xì)胞生存。由此可見，Kar2基因與新型隱球菌的適應(yīng)性和抗性形成密不可分，在其生長(zhǎng)過程中不可或缺。

2 小 結(jié)

隱球菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，可以是一種也可以是多種機(jī)制并存。井然等[29]研究顯示，我國(guó)目前新型隱球菌對(duì)伏立康唑全部敏感，但從2013開始就分離出了對(duì)氟康唑耐藥的新型隱球菌菌株，且至今其耐藥率逐年緩慢增加，由此提示全面認(rèn)識(shí)隱球菌的耐藥機(jī)制已刻不容緩。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及研究的進(jìn)一步深入，將會(huì)有新的耐藥機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，了解這些耐藥機(jī)制可以幫助臨床醫(yī)生從分子生物學(xué)角度更好地識(shí)別隱球菌，從而選擇有效的抗真菌藥物造福廣大患者。