郭帥 呂艷 張偉 張靜 謝毅 趙媛媛 周麗云 于學(xué)燕

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,肺結(jié)核也是傳統(tǒng)的高發(fā)病、多發(fā)病［1-3］。近年來肺部結(jié)節(jié)的檢出率急劇增多,如何盡快定性是胸科領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)之一。研究表明,miRNA、趨化因子在腫瘤和結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［4,5］,但通過提取血清外泌體中的miRNA 系統(tǒng)規(guī)范對(duì)肺癌診治的標(biāo)準(zhǔn)化方案尚未確立,MCP-1 在結(jié)核結(jié)節(jié)形成并持續(xù)的作用機(jī)制尚不清楚。miRNA 屬于內(nèi)源性非編碼小分子RNA,可參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程,其在多種組織中均有表達(dá),且具有較好的組織特異度。外泌體可介導(dǎo)miRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)使其穩(wěn)定存在于循環(huán)系統(tǒng)中,故血清外泌體miRNA 具備了成為腫瘤生物標(biāo)志物的條件。本研究旨在通過檢測(cè)血清外泌體miRNA-21 和血清MCP-1 在不同屬性肺結(jié)節(jié)患者中的表達(dá)情況,評(píng)價(jià)其在以孤立性肺結(jié)節(jié)為主的肺癌和肺結(jié)核中的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月～2022 年1 月山東省公共衛(wèi)生臨床中心(山東省胸科醫(yī)院)60 例肺癌患者作為肺癌組,60 例肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組,另選取同期60 例健康體檢者(成年人)作為對(duì)照組。肺癌組：男36 例,女24 例；年齡36～84 歲,平均年齡(53.7± 12.4)歲；腺癌31 例,鱗癌20 例,腺鱗癌1 例,小細(xì)胞癌6 例,大細(xì)胞癌2 例。肺結(jié)核組男32 例,女28 例；年齡23～79 歲,平均年齡(50.9±10.2)歲；菌陰肺結(jié)核53 例,菌陽肺結(jié)核7 例；其中伴發(fā)胸腔積液9 例。健康對(duì)照組男38 例,女22 例；年齡26～77 歲,平均年齡(52.4±9.8)歲。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 肺癌組和肺結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：肺部影像學(xué)表現(xiàn)類圓形密度增高的陰影,可分為孤立性肺結(jié)節(jié)或彌漫性肺結(jié)節(jié)；既往無腫瘤病史；術(shù)前影像學(xué)檢查無胸腔積液且縱隔淋巴結(jié)腫大≤1 cm；術(shù)前檢查無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：3 個(gè)月內(nèi)服用免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)藥物者；患有嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟、脾臟疾病者；患有腫瘤、肺真菌病、精神疾病、癲癇、免疫過敏疾??；有家族性基因疾??；人類免疫缺陷病毒、人類皰疹病毒、肝炎病毒等感染患者；長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用激素史,有器官移植病史或其他可能導(dǎo)致免疫功能不全的疾病。所有病例均經(jīng)胸部CT 證實(shí)為肺內(nèi)結(jié)節(jié),最大結(jié)節(jié)直徑≤3 cm,均未行放療、化療及抗結(jié)核治療。所有患者經(jīng)手術(shù)或CT 引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺術(shù)或經(jīng)電子氣管鏡Lungpro 導(dǎo)航定位穿刺活檢后明確組織學(xué)病理診斷。肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南非小細(xì)胞肺癌(2018 年第6 版)和小細(xì)胞肺癌 (2018 年第2 版),肺結(jié)核診斷根據(jù)《WS288-2017 肺結(jié)核診斷》。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法 采取三組研究對(duì)象靜脈血5 ml 置于EDTA抗凝管中,4℃條件下24 h 內(nèi)予以離心處理3000 r/min,離心15 min,吸取上層血清置于-80℃的冰箱中保存待檢,整個(gè)過程避免溶血。

1.3.1 儀器與試劑 超低溫冰箱為美國(guó)Thermo 賽默飛產(chǎn)品,高速離心機(jī)為美國(guó) ThermoST16R 產(chǎn)品,電泳儀為ENDURO Gel XL 電泳系統(tǒng)(型號(hào) E0160-230V)；微量分光光度計(jì)為美國(guó)NanoDrop One 產(chǎn)品,TaqManmiRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Applied Biosystems 7300 PULAS 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國(guó)AB 公司。酶標(biāo)儀為美國(guó)Biol-Tiok 公司(Bio-RADModel 550)。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司),兔抗人CD63 一抗和二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體)為美國(guó)System Biosciences 產(chǎn)品；透射電鏡為日產(chǎn)JEOL-1400Flash。

1.3.2 血清外泌體的提取及鑒定 ①提取方法：采用Exo Quick-TM 試劑提取,按照試劑說明進(jìn)行操作,加入1.8 ml 沉淀劑(5∶1),混勻后4℃條件下靜置過夜；將孵育好的樣品4℃條件下以3000 r/min 離心30 min,棄上清,獲得的沉淀即為外泌體,將其以200 μl 分裝,置于-80℃保存?zhèn)錂z。②形態(tài)觀察：提取的外泌體懸液30 μl 滴加于帕拉膠上,覆蓋銅網(wǎng)表面,室溫靜置 45 min,用PBS 清洗銅網(wǎng)3 次,3%戊二醛固定10 min,蒸餾水清洗,2%乙酸鈾酰對(duì)比,用透射電鏡觀察其形態(tài)。③蛋白定量：根據(jù)BCA 試劑盒說明書將稀釋后濃度為0.5 mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl 順序加到96 孔板中,各孔加入PBS 補(bǔ)充到20 μl；外泌體蛋白樣品取1 μl 加到96 孔板中,加PBS到20 μl；各孔加入200 μl BCA 工作液,混勻,37℃孵育45 min 后放入酶標(biāo)儀,于585 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。④凝膠電泳：將20 μl 樣品加入5 μl 5×蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min,上樣,濃縮膠80 V 電泳30 min,分離膠 100 V 電泳90 min,使用0.25%考馬斯藍(lán)染液染色 2 h,脫色液脫色至條帶明顯,使用Biorad 成像儀拍照。⑤檢測(cè)鑒定：使用Western Blot 法,將分離后的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉的TBS-T 封閉1 h 后,按1∶400 稀釋一抗(兔抗人CD63 抗體),與膜共置反應(yīng),4℃過夜；TBS-T 緩沖液洗膜3 次,15 min/次,加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體),室溫孵育2 h,洗膜3 次,15 min/次,顯色觀察。

1.3.3 miRNA-21 的檢測(cè)利用Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA 為模版,在7300 PULAS PCR 儀利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)對(duì)miRNA-21 進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明書,反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃10 min、95℃15 s、60℃ 1 min,擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。所有樣品均做3 個(gè)平行孔,循環(huán)數(shù)取其均數(shù)。以U6B 為內(nèi)參,miRNA-21 的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示,ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct 管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct 目的基因-Ct 管家基因)對(duì)照組均數(shù)。

1.3.4 MCP-1 的檢測(cè) 采用ELISA 方法,預(yù)先向 96 孔板中加入稀釋液100 μl,向各反應(yīng)孔中各加100 μl血清樣品及標(biāo)準(zhǔn)品,封閉板孔,每孔加入MCP-1 結(jié)合物各200 μl,封板,并于室溫下孵育2 h。應(yīng)用PBS 緩沖液沖洗孔板,依次加入底物溶液200 μl,于室溫下避光孵育30 min,加入中止液反應(yīng)30 min,并將樣品置于酶標(biāo)儀A450 中測(cè)定,計(jì)算各指標(biāo)濃度。ELISA 測(cè)定方法及步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo) 比較三組血清外泌體miRNA-2、MCP-1 水平,分析血清外泌體miRNA-21 對(duì)肺癌及血清MCP-1 對(duì)肺結(jié)核的診斷效能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示,采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；采用ROC 曲線分析血清外泌體miRNA-21 和MCP-1在肺癌及肺結(jié)核診斷中的價(jià)值。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清外泌體miRNA-21 水平比較 肺癌組、肺結(jié)核組血清外泌體miRNA-21 水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肺癌組血清外泌體miRNA-21 水平高于肺結(jié)核組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 三組血清外泌體miRNA-21 水平比較(±s,pg/ml)

表1 三組血清外泌體miRNA-21 水平比較(±s,pg/ml)

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05；與肺結(jié)核組比較,bP＜0.05

2.2 三組血清MCP-1 水平比較 肺癌組、肺結(jié)核組血清MCP-1 水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肺結(jié)核組血清MCP-1 水平高于肺癌組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 三組血清MCP-1 水平比較(±s,pg/ml)

表2 三組血清MCP-1 水平比較(±s,pg/ml)

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05；與肺癌組比較,bP＜0.05

2.3 血清外泌體miRNA-21 對(duì)肺癌及血清MCP-1 對(duì)肺結(jié)核的診斷效能分析 對(duì)血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平行ROC 曲線分析,結(jié)果表明,血清外泌體miRNA-21 對(duì)肺癌的診斷敏感性為96.58%,特異性為72.42%,曲線下面積為0.910［95%CI=(0.870,0.949)］。對(duì)血清MCP-1 表達(dá)水平行ROC 曲線分析,結(jié)果表明,血清MCP-1 對(duì)肺結(jié)核的診斷敏感性為95.18%,特異性為 75.23%,曲線下面積為0.898［95%CI=(0.855,0.940)］。見圖1。

圖1 血清外泌體miRNA-21 對(duì)肺癌及MCP-1 對(duì) 肺結(jié)核診斷的ROC 曲線圖

3 討論

肺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤,已成為當(dāng)今對(duì)人民健康危害最大的惡性腫瘤之一［2］。2020 年全世界新發(fā)結(jié)核病患者987 萬,我國(guó)結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為 84.2 萬(2019 年83.3 萬),我國(guó)仍然屬于結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家［3］。所以,肺癌與肺結(jié)核是最需要鑒別的兩種疾病。典型的肺結(jié)核通過胸部X 片及CT 檢查基本能做出準(zhǔn)確診斷,但當(dāng)結(jié)核病灶表現(xiàn)不典型時(shí)影像學(xué)診斷比較困難。隨著人工智能、大數(shù)據(jù)等深度學(xué)習(xí)的興起,提高肺癌患者生存率成為了現(xiàn)實(shí)。國(guó)情的特殊性,患者的依從性、身體條件、結(jié)節(jié)位置和大小等諸多因素限制了穿刺或手術(shù),目前腫瘤標(biāo)志物的特異性和敏感性欠佳,而CT篩查的精準(zhǔn)度往往也需要依賴設(shè)備好壞、影像診斷團(tuán)隊(duì)水平,有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)不同醫(yī)院CT 結(jié)果差別迥異的情況,諸多原因疊加,致使患者心理負(fù)擔(dān)沉重、精神壓力巨大［4］,給早期診斷帶來了困擾。

外泌體是細(xì)胞“內(nèi)吞-融合-外排”過程中分泌的直徑30～200 nm 的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊 泡［5］,1980 年由Trams 最先發(fā)現(xiàn),其廣泛存在于血清、唾液、乳汁、腦脊液、尿液和精液等體液中,含有多種蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA［6,7］。外泌體miRNA 生化性能穩(wěn)定,不易被核糖核酸酶消化以及血液溫度、酸堿度等不利因素的干擾,可通過無創(chuàng)方式獲得,易于保存,使得血清外泌體miRNA 成為液體活檢的技術(shù)之一［8-10］,具備了成為腫瘤診斷生物標(biāo)志物的條件。國(guó)外有研究miRNAs 對(duì)無癥狀的高危人群進(jìn)行檢測(cè),推薦miR-Test 用于肺癌一線篩查。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中含有大量表達(dá)miRNA-21,較正常人表達(dá)明顯上調(diào),上調(diào)倍數(shù)為3.06 倍［11-13］,其作用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路相關(guān)基因、TCF21-KISS1 基因和p53 等靶基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,抵抗細(xì)胞分化和凋亡［14,15］。Meta 分析顯示,血清外泌體miRNA-21是一種將肺癌患者與健康者和良性肺疾病患者區(qū)分開的相對(duì)有前途和有效的生物標(biāo)志物［4］。本研究結(jié)果顯示,肺癌組、肺結(jié)核組血清外泌體miRNA-21 水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肺癌組血清外泌體miRNA-21 水平高于肺結(jié)核組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。上述結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。利用ROC 曲線評(píng)價(jià)miRNA-21 的臨床診斷能力,ROC 曲線結(jié)果顯示,血清外泌體miRNA-21 對(duì)肺癌的診斷敏感性為96.58%,特異性為72.42%,曲線下面積為0.910。但是miRNA-21 并不是肺癌的特有標(biāo)志,其作為肺癌的早期診斷方法仍需要結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志和臨床資料。

結(jié)核病遺傳易感基因研究發(fā)現(xiàn)MCP-1 及其受體在結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用,參與細(xì)胞遷徙、抗原遞呈和吞噬,能激活并趨化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等向感染部位聚集,以吞噬并殺滅結(jié)核分枝桿菌,如果MCP-1缺失,可能導(dǎo)致感染擴(kuò)散、病情加重甚至死亡［16］。研究發(fā)現(xiàn),MCP-1 參與誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集到感染部位形成結(jié)核結(jié)節(jié)并持續(xù)存在［17］。本研究結(jié)果顯示,肺癌組、肺結(jié)核組血清MCP-1 水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肺結(jié)核組血清MCP-1 水平高于肺癌組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ROC 曲線結(jié)果顯示,血清MCP-1 對(duì)肺結(jié)核的診斷敏感性為95.18%,特異性為75.23%,曲線下面積為0.898。由此表明MCP-1 除了參與肺結(jié)核免疫調(diào)節(jié)及炎性因子生成外,還可與相應(yīng)受體或配體結(jié)合促進(jìn)癌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤血管生成及影響癌細(xì)胞本身生物學(xué)行為。

綜上所述,對(duì)以孤立結(jié)節(jié)為主的肺癌和肺結(jié)核的鑒別診斷中,通過檢測(cè)血清外泌體miRNA-21 及MCP-1 表達(dá)水平有積極的臨床價(jià)值,作為一種無創(chuàng)、特異的早期肺癌診斷標(biāo)志物可以提高肺癌和不典型肺結(jié)核的診斷效能,值得臨床推廣。本研究中對(duì)于外泌體的提取過程復(fù)雜、設(shè)備試劑較昂貴也需要改變,尋找一種提取的新思路、新途徑和新方法對(duì)于推動(dòng)外泌體與腫瘤相關(guān)研究的發(fā)展具有重要的價(jià)值。鑒于本研究樣本量有限,仍存在誤差的可能,其敏感性、特異度還需在大樣本的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。