于翰宗，田 蒙，姜 山，程 斐，孫朝暉

（青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山東 青島 266200）

維生素K是具有凝血作用的2-甲基-1，4-萘醌及其衍生物的一類物質(zhì)，包含有維生素K1、維生素K2、維生素K3、維生素K44種形式［1］。維生素K1是人體必需的健康營養(yǎng)素之一，對人體正常的生理機能運轉(zhuǎn)具有重要影響，主要的生理功能是凝血，同時是人體內(nèi)肝臟合成凝血酶原（凝血因子Ⅱ）、斯圖爾特因子（凝血因子X）、轉(zhuǎn)變加速因子前體（凝血因子Ⅶ）、血漿促凝血酶原激酶（凝血因子IX）所必需物質(zhì)，激活凝血因子是機體凝血功能正常發(fā)揮的必要條件［2］。缺乏維生素K1能引發(fā)凝血因子異常或合成障礙，導致出血現(xiàn)象并延長凝血酶原，影響人體健康。近來有文獻報道維生素K1還有預防癌癥、預防血管鈣化、參與骨代謝、抑制糖尿病性白內(nèi)障、治療毛細管支氣管炎、解毒等［3-7］生理功能。維生素K1存在廣泛，大部分來源于蔬菜，其中普通大白菜、西蘭花、甘藍等十字花科蔬菜含量均較高。

大白菜（Brassica rapaL.ssp.pekinensis）種植面積大，其產(chǎn)量在北方蔬菜中占較大比重。大白菜作為保健蔬菜，含有豐富的維生素和礦質(zhì)元素。但對白菜中維生素K1含量的研究鮮見報道。相關(guān)研究中，高效液相色譜法、熒光法、色譜質(zhì)譜串聯(lián)法是維生素K1的主流檢測方法［8-11］。通過高效液相色譜-熒光檢測技術(shù)對活性成分進行定性定量的分析是目前相對效率高、反應靈敏、精準可靠的檢測方式。維生素K1的傳統(tǒng)前處理方法主要有酶解法、液液萃取法、皂化法等［12-15］。目前，固相萃取技術(shù)在試樣分離、純化、濃縮過程中回收率較高，操作流程更加簡化，成為樣品前處理的主流技術(shù)。本研究參考GB 5009.158—2016《食品安全國家標準食品中維生素K1的測定》［16］，探究利用高效液相色譜-熒光檢測器檢測不同球葉顏色的大白菜維生素K1含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料13份白菜樣品采自青島農(nóng)業(yè)大學萊陽校區(qū)試驗基地。

1.1.2 試劑 異丙醇、甲醇均為色譜純，Thermofisher公司；正己烷為分析純，杭州石化有限公司；二氯甲烷為色譜純，天津市康科德科技有限公司；乙酸乙酯為色譜純，Aladdin生化科技股份有限公司；氯化鋅、無水乙酸鈉為分析純，廣州化學試劑公司；99%維生素K1標準品，Sigma公司。

1.1.3 儀器LC-20A型高效液相色譜儀、Shinpack GIST C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、AUW-220型電子分析天平，SHIMADZU；XHC旋渦混合器，常州儀器制造有限公司；DTC-27J型超聲波水浴鍋，中國湖北鼎泰生化技術(shù)設備制造有限公司；鋅粉還原柱（4.6 mm×50 mm，50～70 μm），上海安譜實驗科技股份有限公司；HITACHI CT6E型離心機，日本日立有限公司；N-EVAP 11203030138型氮氣吹干儀，美國Organomation公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取純度99%標準品維生素K1油狀液體20 mg于棕色容量瓶中，用色譜級甲醇分別溶解，定容至10 mL，混合均勻配制成2.0 mg/mL的單一標準儲備溶液。使用標準移液槍準確移取母液于棕色容量瓶中，加入色譜級甲醇進行逐級稀釋，配制成不同濃度（0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mg/mL）的單一標準品溶液，上機測定，記錄峰面積。

1.2.2 樣品制備、提取與測定 稱取已打成勻漿的新鮮樣品10 g（維生素K1含量不低于2 μg），加到具塞離心管中，加入40 mL異丙醇，蓋上塞子，渦旋混勻后超聲5 min，靜置1 min。加入10 mL正己烷，渦旋振蕩8 min，然后4 500 r/min離心5 min，用移液槍小心轉(zhuǎn)移上清液至50 mL具塞離心管中。再次加入10 mL正己烷提取操作1次，然后加入正己烷定容至25 mL棕色容量瓶。用氮氣吹干，正己烷定容至2.0 mL，待凈化。

中性氧化鋁柱經(jīng)5 mL正己烷活化后，將上述2.0 mL正己烷定容液以1.0 mL/min流速過柱，用5 mL正己烷以1.0 mL/min流速淋洗柱子，后用7 mL正己烷溶液再次洗脫至10 mL試管中，氮氣吹干后用1.0 mL甲醇復溶，經(jīng)0.22 μm有機態(tài)濾膜過濾至1.5 mL液相進樣小瓶中，待HPLC分析。

本研究根據(jù)實驗室數(shù)據(jù)積累經(jīng)驗，改進自國標檢測方法的流動相：使用甲醇900 mL、二氯甲烷100 mL、冰醋酸0.3 mL，混勻后，加入氯化鋅1.5 g、無水乙酸鈉0.5 g，經(jīng)過超聲溶解后，用0.22 μm有機系濾膜過濾。

1.2.3 精密度試驗 按照樣品溶液制備方法處理樣品，制作5份用于檢測樣品含量的平行樣品溶液，計算其峰面積的相對標準偏差（RSD）。

1.2.4 加標回收率試驗 根據(jù)樣品的實際測定數(shù)值，做加標試驗方法準確度圖表。準確稱取預先混勻的維生素K1溶液1.0 mg（精確到0.1 μg），按含量0.5、1.0、1.5倍向供試品中加入維生素K1標準溶液（2.00 μg/mL），按供試品溶液制備方法處理加標樣品，對每個測試品平行操作3份。

1.2.5 人為目測 將白菜從中間豎切，由視覺正常的4人分別獨立觀察白菜球葉顏色，將葉色按白色到黃色深淺分為5級。即：1，純白；3，白色；5，淺黃；7，黃色；9，深黃。綜合4人統(tǒng)計結(jié)果進行平行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖結(jié)果分析

利用高效液相色譜法檢測白菜維生素K1含量出峰時間較快，為6.7 min，樣品出峰時并不受其他雜質(zhì)峰的影響，可準確分離和定量（圖1）。

圖1 維生素K1標準品（a）和白菜樣品（b）色譜

2.2 可靠性

本研究層析柱的柱效比值為0.98；回收率為97.02%～109.1%；最小檢出限為4 μg/100 g。相對標準偏差分別為0.118%、0.736%?？勺C明高效液相色譜-熒光檢測法測定大白菜中維生素K1含量的結(jié)果準確。

維生素K1線性方程為Y=10.233x-1.813 3，R2=0.996 9，在濃度為0.229～6.197 μg/mL時，利用高效液相色譜-熒光檢測法測定維生素K1含量的線性關(guān)系明顯。

2.3 穩(wěn)定性

測定供試品溶液峰面積及保留時間，計算相對標準偏差，結(jié)果見表1。維生素K1面積的RSD為1.228%，保留時間的RSD為2.350%，由此可見，在24 h內(nèi)供試品溶液含量穩(wěn)定。

表1 峰面積和保留時間穩(wěn)定性結(jié)果

2.4 檢出限

檢出限及定量限分別以3倍和10倍信噪比（S/N）進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，當取樣量為1.5 g，總定容體積為500 mL時，維生素K1含量的檢出限為0.29 μg/100 g，定量限為0.95 μg/100 g。

2.5 加標回收率

測定樣品中維生素K1含量并計算其回收率。在3個加標水平下的回收率分別為97.5%、98.2%、101.8%，說明該方法測定K1含量可靠有效。

2.6 實際樣品檢測

取大白菜不同部位樣品的均勻制樣，共計13個品種，均來自萊陽試驗基地，按照高效液相色譜-熒光檢測法測定白菜中維生素K1含量，同時選取莖葉類、鮮葉類、菜花類、蔥蒜類、半野生類、根莖類（非淀粉）、茄果類、鮮豆類等日常生活中常見蔬菜進行檢測，并進行含量比較。結(jié)果顯示，不同類型蔬菜維生素K1含量差別很大，對比表2和表3數(shù)值發(fā)現(xiàn)，大白菜維生素K1含量處于較高水平。由表3可以看出，大白菜不同部位的維生素K1含量差別較大，其中外葉白幫含量最低。球葉顏色越黃，維生素K1含量越高；在外葉綠葉部分，外葉顏色越綠，維生素K1含量越高。

表2 不同類型蔬菜維生素K1含量

表3 不同品種大白菜中維生素K1含量

3 小結(jié)與討論

本研究建立了大白菜中維生素K1的分析檢測方法。采用異丙醇和正己烷試劑，對大白菜樣品去除葉綠素、類胡蘿卜素等雜質(zhì)干擾，能有效分離維生素K1，該方法出峰時間早、能有效分離雜峰、檢出限高，是對大白菜中維生素K1進行檢測的優(yōu)選方法。由于順式維生素K1幾乎沒有活性且蔬菜中維生素K1絕大部分為反式維生素K1，因此，本試驗定量分析維生素K1，即可代表大白菜中對人體有效維生素K1含量。

人為目測是直接根據(jù)大白菜球葉顏色差異對人視覺的刺激反應進行評判、分級的方法，通過多人評定排除環(huán)境飾變，從而減少受環(huán)境的不穩(wěn)定影響。人為目測雖然沒有儀器檢測精確，但也有較高準確性，并且易于操作，同時是當下大白菜育種中田間檢測葉色相關(guān)性狀初步選擇的最常用方法。

對日常生活中常見蔬菜維生素K1含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同類型蔬菜維生素K1含量差別較大，縱向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，蔬菜顏色越綠，維生素K1含量越高，同時大白菜維生素K1含量處于較高水平，尤其是外葉綠色部分含量最高，由此建議人們在日常生活中多食外葉綠色部分。

大白菜是人們普遍食用的蔬菜，中國營養(yǎng)學會建議中國居民維生素K1的適宜攝入量為120 μg/d［17］。本試驗中，桔紅65、27-1、ZC22-1、419-2、健美、喜諾6個黃心品種維生素K1含量均超過120 μg/100 g。大白菜中維生素K1含量豐富，尤其是綠色部分，同時結(jié)合徐超等［18］研究可以推斷顏色越綠的蔬菜，維生素K1含量越高。在球葉為黃心的大白菜品種中，維生素K1的含量隨著黃色程度加深而提高。這也為育種工作者選育黃色球葉大白菜提供了重要的品質(zhì)性狀參考。