張艷茹 杜娟 高文怡 李采霞

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院生殖中心，江蘇無(wú)錫 214000

胚胎冷凍在輔助生殖中發(fā)揮十分重要的作用，它不僅可提高累計(jì)妊娠率和單個(gè)周期胚胎利用率，還可降低卵巢過度刺激及多胎妊娠的發(fā)生率[1]。玻璃化冷凍又稱無(wú)冰晶技術(shù)，在高濃度冷凍保護(hù)劑中發(fā)生急速冷卻，液態(tài)變固態(tài)的過程中不形成冰晶從而起到保護(hù)作用[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，胚胎短期玻璃化冷凍、解凍移植后對(duì)臨床結(jié)局沒有影響[3]。胚胎玻璃化冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育潛力及臨床結(jié)局有無(wú)影響目前報(bào)道較少。不同級(jí)別胚胎的玻璃化冷凍時(shí)長(zhǎng)對(duì)妊娠結(jié)局是否產(chǎn)生影響以及在冷凍保存中該如何調(diào)整是目前臨床關(guān)注的重點(diǎn)。本文針對(duì)解凍復(fù)蘇不同級(jí)別胚胎和冷凍時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行分類，分析不同級(jí)別胚胎的冷凍時(shí)長(zhǎng)對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016 年1 月至2021 年12 月于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院生殖中心行凍融胚胎移植病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≤37 歲；②移植周期≤3 個(gè)；③移植相同級(jí)別胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①解凍后無(wú)可移植胚胎者；②接受遺傳學(xué)診斷/胚胎植入前遺傳學(xué)篩查者。

1.2 胚胎冷凍與復(fù)蘇

1.2.1 胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 卵裂期胚胎采用美國(guó)輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)（SART）胚胎評(píng)分系統(tǒng)：根據(jù)胚胎的整體外觀情況，即細(xì)胞數(shù)量、碎片比例、對(duì)稱性三個(gè)指標(biāo)。卵裂期胚胎劃分為4 級(jí)：1 級(jí)胚胎是指卵裂球?qū)ΨQ，胞質(zhì)正常，沒有碎片；2 級(jí)胚胎是指卵裂球?qū)ΨQ或不對(duì)稱，胞質(zhì)正常，碎片比例<10%；3 級(jí)胚胎是指卵裂球?qū)ΨQ或不對(duì)稱，碎片比例11%～25%；4 級(jí)胚胎是指卵裂球?qū)ΨQ或不對(duì)稱，碎片比例>25%。選擇4 個(gè)細(xì)胞以上的1～3 級(jí)可利用胚胎進(jìn)行冷凍[4]。卵裂期中1 級(jí)和2 級(jí)為優(yōu)質(zhì)胚胎。囊胚采用Gardner 評(píng)分系統(tǒng)[5]。根據(jù)囊胚腔的大小和孵化情況分為6 期：1 期早期囊胚有腔室，腔體積<總體積的1/2；2 期囊胚腔體積≥胚胎總體積的1/2；3 期完全擴(kuò)張囊胚，腔體積占據(jù)胚胎的總體積；4 期擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5 期正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶逸出；6 期孵出的囊胚全部從透明帶中逸出。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）評(píng)分：A.細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密；B.細(xì)胞數(shù)目偏少，結(jié)合尚緊密；C.細(xì)胞數(shù)目很少，結(jié)合松散。滋養(yǎng)外胚層TE 評(píng)分：A.上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B.上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C.上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成，選擇3BC以上囊胚進(jìn)行冷凍移植。本文中胚胎級(jí)別的劃分是指胚胎解凍后移植前的評(píng)分。

1.2.2 胚胎冷凍復(fù)蘇方法 采用日本KITAZATO 試劑在常溫下進(jìn)行玻璃化冷凍。冷凍液在室溫下平衡30min，將胚胎吸取放入平衡液10min，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中平衡，90s 內(nèi)將胚胎移至冷凍載桿上并迅速放入液氮中保存。囊胚冷凍前進(jìn)行激光皺縮。胚胎復(fù)蘇采用日本KITAZATO 試劑進(jìn)行玻璃化解凍。將玻璃化解凍液1 放入37°培養(yǎng)箱中平衡30min，玻璃化解凍液2、3、4 在室溫下平衡30min。胚胎復(fù)蘇時(shí)，將有胚胎的Cryotop 載桿前段迅速浸入預(yù)溫的解凍液1 中1min，解凍液2 中3min，解凍液3 中5min，解凍液4 中1min，最后放入事先預(yù)溫好的BM（10%血清濃度）液中。直接冷凍D3 胚胎或繼續(xù)培養(yǎng)2～4d囊胚。卵裂期胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn)每管≤2 枚，囊胚期每管1 枚。卵裂期胚胎復(fù)蘇后0.5h 進(jìn)行移植，囊胚期胚胎復(fù)蘇后至少1h 后進(jìn)行移植。

1.3 內(nèi)膜準(zhǔn)備方案

①自然周期：適用于月經(jīng)規(guī)律、排卵正常且內(nèi)膜形態(tài)較好的患者；②激素替代周期：適用于月經(jīng)不調(diào)、無(wú)排卵、多囊卵巢綜合征患者；③刺激周期：適用于月經(jīng)周期長(zhǎng)、排卵障礙、子宮內(nèi)膜厚或有雌激素禁忌證患者。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8mm 時(shí)，雌激素（estradiol，E2）>750pmol/L 時(shí)，肌肉注射黃體酮，移植后繼續(xù)進(jìn)行黃體支持。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組患者的臨床基本資料比較

共納入2210 個(gè)凍融周期，根據(jù)患者胚胎冷凍時(shí)間分為五組。第1 組：凍存時(shí)間≤180d；第2 組：凍存時(shí)間180～<360d；第3 組：凍存時(shí)間360～<720d；第4 組：凍存時(shí)間720～<1080d；第5 組：凍存時(shí)間≥1080d。5 組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、內(nèi)膜厚度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；不孕年限和周期數(shù)受凍存時(shí)間的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 5 組患者的臨床基本資料比較（ ）

2.2 卵裂期1 級(jí)胚胎不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較

不同凍存時(shí)間解凍周期中1 級(jí)胚胎的妊娠率和種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中第1 組的妊娠率、種植率明顯高于其他4 組，流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 卵裂期1 級(jí)胚胎不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較[%（n/n）]

2.3 卵裂期2 級(jí)胚胎不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較

不同凍存時(shí)間解凍周期中2 級(jí)胚胎的妊娠率、種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中第1、4、5 組的妊娠率、種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 卵裂期1 級(jí)胚胎不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較[%（n/n）]

2.4 卵裂期3 級(jí)胚胎不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較

不同凍存時(shí)間解凍周期中3 級(jí)胚胎的妊娠率和種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中第5 組的妊娠率、種植率明顯高于其他4 組；流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 卵裂期3 級(jí)胚胎不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較[%（n/n）]

2.5 囊胚不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較

不同凍存時(shí)間解凍周期囊胚的妊娠率和種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中第1 組的妊娠率、種植率高于其他4 組；流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表5。

表5 囊胚不同凍存時(shí)間組的臨床妊娠結(jié)局比較[%（n/n）]

3 討論

自1983 年人類首例凍融胚胎移植成功妊娠并活產(chǎn)[4]，胚胎冷凍技術(shù)的發(fā)展日趨成熟，現(xiàn)已廣泛用于臨床，在輔助生殖技術(shù)中不可或缺。玻璃化冷凍技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，可減少對(duì)胚胎的機(jī)械損傷，有利于保存胚胎的發(fā)育潛力，從而提高存活率而被廣泛使用[5]。細(xì)胞在液氮中酶活力受到抑制，代謝處于停滯狀態(tài)，理論上可無(wú)限期保存[6]。近年來(lái)，有學(xué)者指出胚胎的冷凍保存可能會(huì)影響基因的穩(wěn)定性。二甲基亞砜作為玻璃化冷凍的保護(hù)劑，與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆結(jié)合，可能會(huì)對(duì)胚胎有一定毒性[8]。因此，胚胎冷凍保存的安全性、冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)胚胎質(zhì)量及妊娠率的影響一直是本領(lǐng)域持續(xù)關(guān)注的問題。

本研究對(duì)凍胚移植的2210 個(gè)周期，按照胚胎級(jí)別進(jìn)行分類劃分研究，比較不同凍存時(shí)間胚胎的臨床妊娠率、種植率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率。本研究結(jié)果顯示，冷凍時(shí)間≤180d 組卵裂期1 級(jí)、2 級(jí)胚胎和囊胚期胚胎妊娠率、種植率最高（P<0.05），且優(yōu)質(zhì)胚胎種植率、妊娠率較高。有研究表明，胚胎短期保存（≤6 個(gè)月）可獲得較高的復(fù)蘇率及臨床妊娠率[9,10]，與本研究觀點(diǎn)一致。有文獻(xiàn)指出，冷凍胚胎保存時(shí)間1～2 個(gè)月內(nèi)解凍移植有助于提高妊娠率，長(zhǎng)期在液氮中保存會(huì)降低胚胎存活率[11]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道提示，胚胎冷凍保存時(shí)間長(zhǎng)短不影響胚胎復(fù)蘇后妊娠率、種植率、活產(chǎn)率。2010 年Zech等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎冷凍保存時(shí)間的長(zhǎng)短并不影響胚胎的妊娠率、種植率、活產(chǎn)率。2016 年Kasai等[13]研究分析了786 個(gè)卵裂期胚胎凍融周期，發(fā)現(xiàn)低溫下凍存時(shí)間不影響臨床妊娠率和活產(chǎn)率。2020 年Testart等[14]分析囊胚的凍融周期，凍存時(shí)間的長(zhǎng)短并不會(huì)影響胚胎的復(fù)蘇率。2021 年Riggs等[15]研究認(rèn)為，延長(zhǎng)玻璃化冷凍胚胎保存時(shí)長(zhǎng)，不會(huì)對(duì)復(fù)蘇后移植的臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局帶來(lái)負(fù)面影響[15]。本研究中2 級(jí)胚胎第1 組的妊娠率、種植率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而第4、5 組的妊娠率、種植率也高于其他組，此外3 級(jí)胚胎中第5 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明凍存時(shí)間對(duì)妊娠率和種植率沒有影響。

綜上所述，優(yōu)質(zhì)胚胎的短期保存（<6 個(gè)月）可提高臨床妊娠率。凍存時(shí)間可能影響胚胎的種植率、妊娠率，在身體符合移植條件的情況下，鼓勵(lì)在取卵后半年內(nèi)進(jìn)行擇優(yōu)移植，有利于提高臨床妊娠率。