賈夢(mèng)楠，王 帥，2，李天嬌，2，包永睿，2，孟憲生，2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

荊芥穗為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，主產(chǎn)于江蘇、河北、浙江、江西等地。其性辛，微溫，歸肺、肝經(jīng)，具有解表散風(fēng)、透疹、消瘡的功效，炒炭可止血[1]。《本草圖經(jīng)》[2]和《滇南本草》[3]均記載其可治便血，治婦人血風(fēng)，止女子暴崩?，F(xiàn)代藥理研究表明，荊芥穗具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[4-6]。近年來(lái)，學(xué)界主要圍繞荊芥穗藥效部位含量測(cè)定、質(zhì)量控制等方面開展研究，但其治療結(jié)腸癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確。因此，本研究開展荊芥穗藥效部位治療結(jié)腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，探討其活性部位與抗腫瘤藥效之間的關(guān)聯(lián)性，明確荊芥穗抗腫瘤的藥效質(zhì)量標(biāo)志物，為荊芥穗藥效部位的研發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立不同產(chǎn)地荊芥穗藥材化學(xué)輪廓譜，采用人腸癌HT-29細(xì)胞體外模型開展不同產(chǎn)地荊芥穗抗腸腫瘤藥理藥效研究；運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)及偏最小二乘分析法，將化學(xué)輪廓譜與抗腫瘤活性進(jìn)行關(guān)聯(lián)，篩選荊芥穗抗腸腫瘤的潛在藥效質(zhì)量標(biāo)志物，可用于荊芥穗的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，為荊芥穗的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

1260 II型超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；SUNRISE酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)NUAIRE公司)；AE31型倒置相差顯微鏡(Motic公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國(guó)SENCO公司)。

1.2 試劑與藥物

胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)；McCoy’s 5A培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司)；青霉素/鏈霉素溶液(Meilunbio公司)；CCK-8增強(qiáng)型溶液細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Meilunbio公司)。HPD-400大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)；原兒茶醛(批號(hào)：19031002)、咖啡酸(批號(hào)：17122804)、對(duì)香豆酸(批號(hào)：20102301)、木犀草苷(批號(hào)：21032701)、橙皮苷(批號(hào)：19071201)、異綠原酸C(批號(hào)：200912)、木犀草素(批號(hào)：17120702)、香葉木素(批號(hào)：181101)；10批荊芥穗飲片(購(gòu)買信息見表1，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥植物教研室許亮教授植物鑒定為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗)。

表1 不同產(chǎn)地荊芥穗飲片的樣本信息

1.3 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29(賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)。

1.4 樣品制備

1.4.1 荊芥穗提取物制備 精密稱取不同產(chǎn)地荊芥穗藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)10.00 g，以15倍量的70%乙醇回流提取3次，放冷濾過(guò)，合并提取液，旋蒸濃縮至100 mL，采用HPD-400樹脂進(jìn)行純化，收集洗脫液，45 ℃真空旋蒸至濃稠，70 ℃水浴蒸干即得荊芥穗藥效部位純化物。

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱取荊芥穗藥效部位0.002 5 g，置于5 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，超聲(功率200 W，頻率40 kHz)1 min溶解，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.4.3 含藥培養(yǎng)液制備 精密稱定不同產(chǎn)地荊芥穗藥效部位，以含體積分?jǐn)?shù)為10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的McCoy’s 5A培養(yǎng)基為溶劑制成濃度為0.4 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學(xué)輪廓譜建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)- 乙腈(B)；梯度洗脫程序：(0～5 min，15%→18%B；5～7 min，18%→18%B；7～9 min，18%→20%B；9～13 min，20%→20%B；13～25 min，20%→26%B；25～35 min，26%→36%B；35～40 min，36%→50%B)；40～43 min，50%→70%B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量3 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.1.2 方法學(xué)考察 供試品各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)峰面積精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性RSD均小于4%。

2.1.3 化學(xué)輪廓譜建立 精密吸取10批供試品溶液各3 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，化學(xué)輪廓譜見圖1。

圖1 不同產(chǎn)地樣品乙醇提取物化學(xué)輪廓譜

根據(jù)荊芥穗藥效部位的化學(xué)輪廓譜，從中篩選出22個(gè)主要色譜峰，得出其保留時(shí)間與峰面積，用于下一步譜效分析。經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，1號(hào)峰為原兒茶醛，2號(hào)峰為咖啡酸，4號(hào)峰為對(duì)香豆酸，6號(hào)峰為木犀草苷，8號(hào)峰為橙皮苷，9號(hào)峰為異綠原酸C，14號(hào)峰為木犀草素，19號(hào)峰為香葉木素。見圖2。

2.2 荊芥穗藥效部位對(duì)人腸癌HT-29抑制作用

采用AO/EB(吖啶橙/溴化乙錠)染色法計(jì)算荊芥穗藥效部位對(duì)人腸癌HT-29抑制率。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人腸癌HT-29細(xì)胞，以每孔1.5×104個(gè)接種于48孔板中，給藥干預(yù)后，每孔避光加入200 μL的AO/EB染液，在實(shí)時(shí)熒光顯微鏡下觀察，活力細(xì)胞為綠色熒光。通過(guò)ImageJ 2.1.0軟件對(duì)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，可見相對(duì)空白組，各給藥組活力細(xì)胞數(shù)量均有不同程度的減少。見圖3。

圖2 混合對(duì)照品溶液及樣品溶液的HPLC

圖3 不同產(chǎn)地荊芥穗藥效部位對(duì)人腸癌HT-29細(xì)胞活力影響

荊芥穗藥效部位對(duì)人腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用以7 500 cell/孔的密度將HT-29細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，給藥干預(yù)后，避光加CCK-8溶液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 min后，用酶標(biāo)儀在450 nm處掃描，測(cè)定吸光值(OD)，與空白組比較，各給藥組HT-29細(xì)胞吸光度明顯升降低(P<0.05)。

AO/EB染色法、CCK-8法權(quán)重系數(shù)為各50%，計(jì)算得到的荊芥穗藥效部位作用于人腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率。見表2、圖4。

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析

根據(jù)不同產(chǎn)地荊芥穗藥效部位化學(xué)成分輪廓譜，共提取出22個(gè)特征峰。將影響整體行為的數(shù)據(jù)進(jìn)行分列，以反映系統(tǒng)藥效行為特征的數(shù)據(jù)序列(荊芥穗藥效部位作用于人腸癌HT-29細(xì)胞總抑制率)為參考數(shù)列，即母序列；以影響系統(tǒng)藥效行為的因素?cái)?shù)據(jù)序列(不同產(chǎn)地荊芥穗藥材的不同峰面積經(jīng)歸一化處理后)為比較數(shù)列，即子系列。采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件(Grey ModeLing V 3.0)進(jìn)行分析，得出不同產(chǎn)地藥材色譜峰與體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)。見表3。

表2 不同產(chǎn)地乙醇提取物對(duì)人腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率 (n=4)

圖4 荊芥穗藥效部位作用于人腸癌HT-29細(xì)胞總抑制率

由此可知，這22個(gè)主要色譜峰代表的化學(xué)成分對(duì)腸癌的抑制作用具有一定的差異性，其中相關(guān)系數(shù)大于0.85的色譜峰為1、2、4、5、6、8、9、14、16、17、19、21號(hào)峰。

表3 不同產(chǎn)地樣品乙醇提取物的色譜峰峰面積以及關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.4 偏最小二乘回歸分析

由于灰色關(guān)聯(lián)分析方法僅標(biāo)識(shí)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)，而不表示其正相關(guān)或是負(fù)相關(guān)，因此，在灰色關(guān)聯(lián)分析方法基礎(chǔ)上進(jìn)行偏最小二乘回歸分析方法可獲得正相關(guān)的藥效成分。本研究采用SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件，以灰色關(guān)聯(lián)度分析中相關(guān)系數(shù)>0.85的14個(gè)主要色譜峰為自變量(X)，藥效數(shù)據(jù)為因變量(Y)，對(duì)0.4 mg/mL給藥濃度時(shí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘回歸分析(PLSR)，所得擬合模型R2>0.9，Q2>0.8，說(shuō)明潛在因子的信息綜合解釋能力較好，并具有良好的預(yù)測(cè)性，結(jié)果見圖5。經(jīng)UVN標(biāo)準(zhǔn)化后，回歸方程為：Y=5.778 31+0.128 551X1+0.122 33X2+0.077 550 7X3-0.116 832X4+0.103 907X5+0.036 709 8X6+0.030 710 5X7+0.127 702X8-0.113 476X9-0.109 755X10+0.123 998X11-0.111 015X12。

其中，回歸系數(shù)的正、負(fù)代表各成分對(duì)抗腸腫瘤的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，可見1、2、4、6、8、9、14、19號(hào)共計(jì)8個(gè)色譜峰對(duì)藥效貢獻(xiàn)較大，起到正向促進(jìn)作用。

圖5 0.4 mg/mL給藥濃度標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)

3 討論與結(jié)論

由于HT-29細(xì)胞經(jīng)荊芥穗藥效部位處理后，可能出現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)不變，但代謝率降低，細(xì)胞呼吸減弱，使CCK-8法OD值稍有降低的現(xiàn)象。而AO/EB染色法可直接觀測(cè)活細(xì)胞數(shù)量。因此，本研究賦予AO/EB染色法與CCK-8法兩種方法權(quán)重系數(shù)各50%，得到不同產(chǎn)地荊芥穗藥效部位抗人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率。

本研究采用HPLC法構(gòu)建了10批荊芥穗樣品化學(xué)輪廓譜，獲得22個(gè)共有峰。采用灰色關(guān)聯(lián)分析獲得了荊芥穗抗腫瘤活性較強(qiáng)的12個(gè)色譜峰，采用偏最小二乘回歸方法對(duì)其進(jìn)行譜效相關(guān)分析，獲得了荊芥穗抗腫瘤活性較強(qiáng)且正相關(guān)的8個(gè)色譜峰。由于灰色關(guān)聯(lián)分析方法僅標(biāo)識(shí)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)，而不表示其正相關(guān)或是負(fù)相關(guān)，因此，本研究在灰色關(guān)聯(lián)分析方法基礎(chǔ)上進(jìn)行偏最小二乘回歸分析方法可獲得正相關(guān)的藥效成分。

本研究基于特征圖譜和藥效學(xué)研究，得到的8個(gè)成分與抗腸腫瘤作用密切相關(guān)。對(duì)香豆酸通過(guò)ros-線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[7]，木犀草素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用[8]，橙皮苷能有效促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬[9]，香葉木素可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)速度[10]，木犀草苷可通過(guò)改善腸道微生物進(jìn)而調(diào)理腸道健康[11]，原兒茶醛和異綠原酸C主要起抗炎作用[12-13]，咖啡酸具有良好的止血功效。因此，荊芥穗活性部位中的多種成分可能通過(guò)協(xié)同作用發(fā)揮抗炎、抗腸腫瘤作用，可初步推測(cè)其為荊芥穗的潛在的藥效質(zhì)量標(biāo)志物，可為荊芥穗的質(zhì)量控制提供參考。