周偉勇，吳 升

開平市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 開平 529300

支氣管哮喘是一種由呼吸道過敏引起的，以支氣管可逆性發(fā)作性痙攣為特征的慢性阻塞性炎性疾病。臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難、咳嗽、胸悶等癥狀。由于支氣管哮喘的病因復(fù)雜，有通過接觸灰塵和花粉等引起哮喘的過敏原，還有因為服用藥品引起的支氣管哮喘。支氣管哮喘的發(fā)作機制也十分復(fù)雜，臨床對于支氣管哮喘的診斷既沒有金標(biāo)準，也沒有實驗室檢查指標(biāo)能夠明確預(yù)測支氣管哮喘，故臨床對于支氣管哮喘的診斷依托于患者的主訴，查體和肺功能檢查。這種確診方式也有其局限性：一是肺功能檢查能否準確地反映患者氣道情況取決于患者的依從性，若患者為兒童，不能按要求正確進行檢查，會造成肺功能檢查結(jié)果不準確；若患者為老年人，隨著年齡增大，并且多種心血管疾病與呼吸疾病并存，常常會有呼吸困難的癥狀，這樣的情況進行肺功能檢查得到的結(jié)果不夠準確，不能夠正確反映患者的氣道情況。二是肺功能檢查結(jié)果只能反映呼吸道的氣流狀況，不能檢測呼吸道是否有炎癥，但在診斷哮喘時呼吸道炎癥的診斷是核心要素［1］。中性粒細胞是炎癥反應(yīng)時最早出現(xiàn)的細胞［2］，當(dāng)中性粒細胞受到刺激后，釋放到胞外的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)，故臨床可以通過檢驗中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平評價呼吸道的炎癥狀況。本研究旨在探究中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平聯(lián)合肺功能指標(biāo)對支氣管哮喘急性發(fā)作的預(yù)測價值，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年2—12月開平市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的90例主訴喘息、胸悶、氣短患者作為研究對象。納入標(biāo)準：（1）患者主訴反復(fù)的喘息、氣急，咳嗽，且發(fā)作時間常常夜間及晨間多發(fā)，在接觸到冷空氣或者各種呼吸道的刺激及運動后癥狀明顯。（2）有過以往支氣管哮喘發(fā)作史，并且使用相關(guān)藥物癥狀得到改善。（3）患者病程為急性發(fā)作期，聽診時雙肺可聽到彌漫性哮鳴音，呼氣相延長。患者符合上述（1）（3）癥狀，并且肺功能檢查任意一項為陽性患者歸為支氣管哮喘急性發(fā)作組?；颊哂猩鲜觯?）（2）癥狀，并且肺功能檢查任意一項為陽性列為支氣管哮喘非急性發(fā)作組。（4）患者具有良好的依從性。

支氣管哮喘急性發(fā)作組（45例），男性患者30例，女性患者15例；年齡15～67歲，平均年齡（43.04±12.77）歲。支氣管哮喘非急性發(fā)作組（45例），男性28例，女性17例；年齡12～71歲，平均年齡（46.07±13.65）歲。兩組患者一般資料具有可比性（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 肺功能檢查 （1）支氣管激發(fā)試驗：采用不同的刺激物去引發(fā)支氣管不正常的收縮，通過刺激物的量化及其相應(yīng)的反應(yīng)程度，去判斷氣道高反應(yīng)性的程度，只針對非急性期患者進行試驗。（2）支氣管舒張試驗：患者用力呼氣，記錄第一秒呼氣容積，吸入支氣管舒張劑后，再記錄第1 s用力呼氣容積，若第1 s用力呼氣容積增加＞12%，且第1 s用力呼氣容積增加絕對值＞200 mL，則支氣管舒張試驗陽性。（3）呼氣流量峰值（PEF）平均每日晝夜變異率：患者早上起床后使用肺功能檢查峰流量計測量呼氣流量峰值，保持站立位，患者快速深吸一口氣至肺總量位，迅速將咬口含入口腔，用嘴唇包緊，立即用最大力氣和最快速度將肺內(nèi)氣體呼出，檢查結(jié)束后峰流量計應(yīng)繼續(xù)保持水平位，讀取數(shù)值。至少檢查3次，若3次實測值之間差異過大，應(yīng)注意檢查方法是否正確。可重復(fù)多次，使最佳3次之間差異＜5%，取最高值記為呼氣流量峰值，晚上入睡前重復(fù)此步驟，連續(xù)監(jiān)測2周，將每天的變異率相加除以監(jiān)測天數(shù)（最少7 d）以計算呼氣流量峰值平均變異率，每日呼氣流量峰值晝夜變異率之和/7）＞10%，則為陽性；或以2周內(nèi)呼氣流量峰值最高值和最低值計算呼氣流量峰值周變異率，（2周內(nèi)最高PEF-最低PEF）/［（2周內(nèi)最高PEF+最低PEF）×1/2］×100%］＞20%［3］，則為陽性。

1.2.2 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平檢查 購買小牛胸腺DNA干粉（北京百奧萊博科技有限公司）后，用倍比稀釋方法稀釋后，加入PicoGreen工作液并混勻，用熒光酶標(biāo)儀于在485 nm波長處的發(fā)射熒光下快速檢測，以小牛胸腺DNA干粉對應(yīng)的熒光強度作為標(biāo)準曲線，抽取兩組患者的血液，將待測血液與PicoGreen熒光探針工作液進行混合，使用熒光酶標(biāo)儀于在485 nm波長處檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行分析。分別對各組資料進行統(tǒng)計學(xué)描述。其中計量資料符合正態(tài)分布且方差齊時采用t檢驗，不符合正態(tài)分布且方差不齊時采用秩和檢驗。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的肺功能指標(biāo)情況

急性發(fā)作組患者的肺功能檢查陽性率為100%，非急性發(fā)作組患者的肺功能檢查陽性率為40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=35.767 2，P＜0.01）。

2.2 兩組患者中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平情況

急性發(fā)作組患者的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平為（1 505.04±210.90），非急性發(fā)作組的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平為（1 015.71±247.76），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.088 7，P=0）。

2.3 支氣管哮喘急性發(fā)作期logistic回歸分析

2.3.1 影響患者支氣管哮喘急性發(fā)作的控制變量篩選 患者的性別對患者支氣管哮喘急性發(fā)作，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），患者的年齡對支氣管哮喘急性發(fā)作，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），患者的性別對支氣管哮喘發(fā)作的影響構(gòu)成混雜影響，見表1。相關(guān)因素賦值，見表2。

表1 患者支氣管哮喘急性發(fā)作的控制變量篩選 例

表2 相關(guān)因素賦值

經(jīng)霍斯默—萊梅肖檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.65 0，P=0.468），二元logistic回歸模型與真實數(shù)據(jù)擬合良好。性別對支氣管急性發(fā)作的影響（P=0.979），不是支氣管哮喘急性發(fā)作的獨立影響因素；肺功能指標(biāo)對支氣管急性發(fā)作的影響（P=0.998），故在支氣管哮喘急性發(fā)作與支氣管非急性發(fā)作中肺功能指標(biāo)不構(gòu)成影響因素；中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平對支氣管急性發(fā)作的影響，在支氣管哮喘急性發(fā)作與支氣管非急性發(fā)作中，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平差異明顯，可以顯著影響支氣管哮喘的急性發(fā)作，排除混雜因素的影響后，OR=1.009，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平每提高一個單位，患病風(fēng)險提高0.9%，見表3。

表3 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平和肺功能指標(biāo)對支氣管哮喘急性發(fā)作線性回歸分析結(jié)果

3 討論

支氣管哮喘是一種氣道高反應(yīng)性炎癥疾病，受到多種影響因素影響：一是由于個體基因遺傳導(dǎo)致的個體差異性大，使得有個體超敏體質(zhì)的患者更容易受到變應(yīng)原的影響，每個個體對變應(yīng)原的反應(yīng)都不同。二是環(huán)境中的變應(yīng)原多種多樣，空氣中的塵螨、花粉、動物皮毛都會引起氣道的炎癥形成與氣道高反應(yīng)性，甚至導(dǎo)致氣道重構(gòu)。變應(yīng)原刺激呼吸道誘導(dǎo)多種炎癥細胞聚集在呼吸道部位，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等。炎癥細胞聚集在呼吸道部位，氣道高反應(yīng)性是長期慢性氣道炎癥的結(jié)果，表現(xiàn)為患者接觸變應(yīng)原時氣道出現(xiàn)的過強或過早的收縮反應(yīng)。肺功能檢查是檢查患者的氣道反應(yīng)性的項目，可以反映出患者的氣道狀態(tài)，但是氣道反應(yīng)性是炎癥長期慢性作用的結(jié)果，肺功能檢查無法檢查出現(xiàn)在氣道的炎癥狀況，故臨床可以通過肺功能檢查聯(lián)合患者的主訴與體征對患者進行確診，但無法確定患者此時氣道的炎癥狀況。確定患者的炎癥狀況是支氣管哮喘診斷的核心，這將直接影響患者后續(xù)的治療方案。

中性粒細胞是炎癥細胞的一種，還包括嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞等，中性粒細胞可以吞噬病原體并在胞內(nèi)釋放顆粒內(nèi)容物和活性氧殺害病原體，發(fā)揮其天然免疫功能，中性粒細胞也可將顆粒內(nèi)容物和活性氧釋放到細胞外空間，破壞周圍的外來物［5］。中性粒細胞分泌的組蛋白、DNA和蛋白酶就會在細胞外形成交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［6］，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就是中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)。其在呼吸道部位是機體防御變應(yīng)原時形成的保護機制，但是同時中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)的形成也會介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，引起呼吸道部位的黏膜水腫，并且中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)也會損傷自身細胞，損傷氣道上皮細胞，誘導(dǎo)炎癥細胞分泌黏液，刺激患者的氣道出現(xiàn)高反應(yīng)性，導(dǎo)致氣道阻塞，患者呼吸困難與喘憋加重，加重哮喘癥狀［7］，并且中性粒細胞可以減少肺泡巨噬細胞降解中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)的能力，使得這種不良的循環(huán)持續(xù)存在，使支氣管哮喘持續(xù)發(fā)生［8］。

中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)是氣道炎癥反應(yīng)形式的一種，故中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)的檢測可以反映呼吸道的情況。支氣管哮喘根據(jù)發(fā)病情況可分為急性發(fā)作期，慢性持續(xù)期與緩解期。根據(jù)哮喘的分期不同采用不同的治療方案，與急性期不同，慢性持續(xù)期與緩解期，患者的氣道未處于痙攣的狀態(tài)，氣道的炎癥反應(yīng)也未處于炎癥風(fēng)暴，故對患者的藥物使用劑量，治療方案都要相互區(qū)別，臨床對急性期與非急性期的鑒別尤為重要。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)的檢測為急性期與非急性期的鑒別提供了一種臨床思路。

目前，對于中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平的檢測采用PicoGreen熒光染色法，中性粒細胞會釋放到胞外DNA，故臨床可以通過檢驗血液中DNA的水平來評價中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平。PicoGreen熒光染色法是一種使用Pico-Green熒光染料與樣品中雙鏈DNA的高度特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號，再使用Modlus熒光檢測儀定量檢測DNA含量的方法。傳統(tǒng)檢測DNA的方法是直接檢測在260 nm處的光吸收值，不僅雙鏈DNA，單鏈DNA，RNA和其他雜質(zhì)也會產(chǎn)生吸收值，這樣通過DNA水平去評價中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平不準確。通過PCR擴增后進行通過電泳檢測DNA，但是這種方法無法確定DNA是否來自中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)，還是來自組織的破裂，并且過程容易受到環(huán)境的污染［9］。PicoGreen是一種和DNA特異性絡(luò)合的分子探針，在485 nm波長處發(fā)射黃光，與RNA和單鏈DNA結(jié)合無熒光，并且發(fā)射熒光的強度與DNA的濃度成正比。可以實現(xiàn)定量檢測DNA來評價體內(nèi)中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平。

據(jù)相關(guān)研究表明，支氣管哮喘根據(jù)炎癥細胞浸潤的類型可以分為中性粒細胞表型、嗜酸性粒細胞表型、嗜堿性粒細胞表型。根據(jù)支氣管哮喘急性發(fā)作期的治療方案，給予患者β2受體激動劑擴張支氣管，聯(lián)合糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎作用。有研究［10］表明，對支氣管哮喘患者使用糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎作用時，糖皮質(zhì)激素對有些中性粒細胞表型患者無效，反而加重病程，這是因為糖皮質(zhì)激素對嗜酸性粒細胞型支氣管哮喘具有良好的治療作用，但是對一些哮喘患者來說，肺部灌洗液中中性粒細胞和中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平的數(shù)量遠遠超過肺內(nèi)嗜酸性粒細胞的數(shù)量。故急性發(fā)作期患者的用藥方案根據(jù)中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平將更具有針對性，重組人DNase與糖皮質(zhì)激素結(jié)合使用治療哮喘對中性粒細胞型支氣管哮喘更有效［11］。

本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作組患者的肺功能檢查陽性率顯著高于非急性發(fā)作組，急性發(fā)作組患者的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平顯著高于非急性發(fā)作組，在本研究中性別不是支氣管急性發(fā)作的獨立影響因素。肺功能指標(biāo)在支氣管哮喘急性發(fā)作與支氣管非急性發(fā)作中不構(gòu)成獨立影響因素，故臨床通過肺功能指標(biāo)可以區(qū)分支氣管哮喘與非哮喘，但是無法準確區(qū)分急性發(fā)作期與非急性發(fā)作期。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平對支氣管急性發(fā)作的影響明顯，可以顯著影響支氣管哮喘的急性發(fā)作，排除混雜因素的影響后，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平每提高一個單位，患病風(fēng)險提高0.9%，故臨床通過檢測中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)水平聯(lián)合肺功能指標(biāo)檢查對支氣管哮喘急性發(fā)作有預(yù)測作用。