周蓓蓓，王凌波，張秀彩，陳櫟江，王忠永，周鐵麗

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 浙江省檢驗(yàn)診斷及轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310052

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種能引起多部位感染的人類(lèi)常見(jiàn)機(jī)會(huì)致病菌，可以導(dǎo)致肺部、尿路、燒傷創(chuàng)面和糖尿病足等多種感染[1]。研究顯示，由銅綠假單胞菌導(dǎo)致的感染在院內(nèi)感染中呈不斷上升的趨勢(shì)，且多重耐藥銅綠假單胞菌日益增加，限制了抗菌藥物的治療選擇[2-3]。 銅綠假單胞菌具有多種促進(jìn)感染發(fā)生發(fā)展的毒力因素，其中分泌系統(tǒng)是重要的毒力因素之一，細(xì)菌可以通過(guò)分泌系統(tǒng)獲取營(yíng)養(yǎng)成分，向外界環(huán)境分泌毒素蛋白，或者直接作用于真核生物的作用靶點(diǎn)發(fā)揮致病性[4]。較多研究表明[5-6]，III型分泌系統(tǒng)（type III secretion system, T3SS）在臨床上常與嚴(yán)重感染相關(guān)，銅綠假單胞菌可通過(guò)T3SS將分泌蛋白注入宿主細(xì)胞；VI型分泌系統(tǒng)（type VI secretion system, T6SS）是銅綠假單胞菌的另一分泌系統(tǒng)，可編碼3個(gè)T6SS分泌系統(tǒng)（H1-、H2-和H3-T6SS）[7]。目前有較多國(guó)內(nèi)外報(bào)道對(duì)臨床菌株T3SS毒力因子的流行和作用進(jìn)行探究，但T6SS毒力因子的流行情況及特性仍未完全明確，并且最近發(fā)現(xiàn)的T6SS效應(yīng)蛋白PldA、PldB具有較強(qiáng)的毒力效應(yīng)，不僅可以競(jìng)爭(zhēng)殺菌還可內(nèi)化至非吞噬細(xì)胞[8]，因此對(duì)于T6SS相關(guān)因子攜帶率的檢測(cè)和探究極為重要。另外BOULANT等[9]發(fā)現(xiàn)T3SS及T6SS相關(guān)因子在引起人類(lèi)不同感染的銅綠假單胞菌中的攜帶具有一定的差異，而呼吸道和血液作為銅綠假單胞菌分離的兩大標(biāo)本來(lái)源，探究T3SS和T6SS效應(yīng)基因與不同標(biāo)本來(lái)源菌株之間的關(guān)系具有一定的臨床意義。

細(xì)菌耐藥性和毒力特征是影響銅綠假單胞菌感染臨床預(yù)后的關(guān)鍵因素，隨著多重耐藥銅綠假單胞菌在臨床中的快速出現(xiàn)，迫切需要新的方法來(lái)治療由銅綠假單胞菌引起的各種嚴(yán)重感染。毒力抑制策略是一種有潛力的策略，而了解臨床菌株中編碼毒力因子基因的分布情況是關(guān)鍵。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)痰液及血液來(lái)源標(biāo)本中T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白相關(guān)基因的分布特性，并分析其與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系，為臨床控制銅綠假單胞菌所致感染以及藥物靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2016年至2018年間分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者痰液和血液標(biāo)本的銅綠假單胞菌共92株（剔除同一患者相同來(lái)源的重復(fù)菌株），其中來(lái)源于痰液標(biāo)本61株，血液標(biāo)本31株。菌株分離：將血液樣本接種至血培養(yǎng)瓶中，血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后接種于血平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h 后觀察菌落形態(tài)；將痰液標(biāo)本接種于血平板、嗜血平板及科瑪嘉平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)；將疑似菌落由基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，確定為銅綠假單胞菌，菌株保存在30%甘油肉湯保菌管中，并存于-80 ℃超低溫冰箱中。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：KY2022-R139）。

1.2 儀器和試劑 VITEK MS質(zhì)譜鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃公司，VITEK MS PLUS）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo公司，VertiTMDx 96 Well Thermal Cycler）。Muller-Hintom（MH）瓊脂（英國(guó)OXOID有限公司）；細(xì)菌基因組提取試劑盒（北京BioFlux公司）；引物合成（上海華大生物科技有限公司）；PCR反應(yīng)試劑（大連Takara公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 VITEK MS質(zhì)譜鑒定儀菌株鑒定 將待測(cè)微生物與基質(zhì)液進(jìn)行混合加在靶板上，待干后形成樣本基質(zhì)結(jié)晶體，經(jīng)激光輻射使樣本的蛋白進(jìn)入飛行時(shí)間檢測(cè)器，檢測(cè)器通過(guò)檢測(cè)蛋白飛行時(shí)間的不同來(lái)建立微生物蛋白質(zhì)量指紋圖，進(jìn)而與數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息比對(duì)來(lái)對(duì)微生物種或菌株進(jìn)行區(qū)分和鑒定。大腸埃希菌ATCC 8739作為實(shí)驗(yàn)的校準(zhǔn)菌株，鑒定可信度達(dá)到99.9%則證明鑒定正確。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取基因組模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列參照文獻(xiàn)[6-7]合成，引物序列見(jiàn)表1。在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 1 min；退火30 s（溫度視基因而不同，見(jiàn)表1）；延伸72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色后于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。所有PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物均送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

表1 T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白基因引物序列

1.5 藥物敏感性試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法檢測(cè)菌株對(duì)常用抗菌藥物亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、阿米卡星的敏感性，結(jié)果判讀參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Labortory Standards Institute, CLSI）2020年標(biāo)準(zhǔn)判斷[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，利用Spearman相關(guān)系數(shù)分析部分菌株中T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同來(lái)源T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白基因檢測(cè)結(jié)果 92株臨床分離銅綠假單胞菌中T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因exoT及T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因tssB1、tse2、tssB2、pldB均高達(dá)90%以上；其中痰液標(biāo)本來(lái)源菌株T3SS效應(yīng)蛋白基因exoU的攜帶率顯著高于血液來(lái)源菌株（P＜0.05），而T3SS及T6SS其他相關(guān)效應(yīng)蛋白基因的攜帶率在兩種不同的標(biāo)本來(lái)源的菌株中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同來(lái)源銅綠假單胞菌T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白基因攜帶率比較［株（%）］

2.2 不同來(lái)源的銅綠假單胞菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率 痰液及血液來(lái)源菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶以及阿米卡星的耐藥情況比較結(jié)果顯示，痰液來(lái)源菌株對(duì)亞胺培南的耐藥率顯著高于血液來(lái)源菌株（49.2%vs.25.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同來(lái)源銅綠假單胞菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率［株（%）］

2.3 T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因的相關(guān)性分析exoU為T(mén)3SS的發(fā)揮致病作用的主要毒力因子，有文獻(xiàn)報(bào)道T6SS蛋白編碼基因pldA和T3SS蛋白編碼基因exoU的攜帶與非囊性纖維化患者預(yù)后惡化有一定的關(guān)聯(lián)[11]，為了檢測(cè)T6SS蛋白編碼基因是否與T3SS蛋白編碼基因的攜帶具有相關(guān)性，我們對(duì)毒力基因exoU和pldA進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示pldA和exoU之間呈正相關(guān)（r=0.474，P＜0.01）。

2.4 T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因與菌株耐藥性的關(guān)系 攜帶不同T3SS及T6SS基因的銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、阿米卡星的耐藥性分析結(jié)果顯示，與其他種類(lèi)的抗菌藥物相比，攜帶T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因的菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物亞胺培南具有較高的耐藥率；但攜帶不同T3SS及T6SS效應(yīng)編碼基因的菌株對(duì)同類(lèi)抗菌藥物的耐藥性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、表5。

表4 攜帶T3SS基因銅綠假單胞菌對(duì)常用抗菌藥物耐藥率比較［株（%）］

表5 攜帶T6SS基因銅綠假單胞菌對(duì)常用抗菌藥物耐藥率比較［株（%）］

3 討論

銅綠假單胞菌是一種引起社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的臨床常見(jiàn)條件致病菌[12-14]。銅綠假單胞菌可通過(guò)分泌系統(tǒng)分泌多種效應(yīng)蛋白發(fā)揮毒性作用，其中T3SS是銅綠假單胞菌與外界環(huán)境交流的重要途徑之一[5-6]。張秀彩等[15]的研究顯示銅綠假單胞菌T3SS毒力基因exoT和exoY的攜帶率較高，毒力基因與銅綠假單胞菌耐藥性相關(guān)。T6SS是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng)，銅綠假單胞菌可通過(guò)T6SS向鄰近的病原體傳遞毒素和蛋白效應(yīng)因子從而發(fā)揮其生存優(yōu)勢(shì)，同時(shí)T6SS作為銅綠假單胞菌的毒力因子，還能促進(jìn)其生物被膜的形成，對(duì)銅綠假單胞菌的致病性及耐藥性發(fā)揮重要作用[16]。了解T6SS各毒力因子編碼基因的流行分布特性，將有助于銅綠假單胞所致感染的控制。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)評(píng)估T6SS多個(gè)蛋白編碼基因流行率的相關(guān)報(bào)道。由痰液分離銅綠假單胞菌所引起的呼吸道感染常持續(xù)時(shí)間久較難清除，同樣由銅綠假單胞菌所引起血流感染的患者的治療具有一定的挑戰(zhàn)性，因此了解T3SS和T6SS效應(yīng)基因與不同標(biāo)本來(lái)源菌株之間的關(guān)系值得進(jìn)一步探究。

本研究對(duì)92株銅綠假單胞菌臨床分離株中T3SS基因及T6SS基因的流行分布情況進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因exoT以及T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因tssB1、tse2、tssB2、pldB的檢出率高達(dá)90%以上，表明這些基因在銅綠假單胞菌中具有普遍性，這與已有的研究報(bào)道[9，12]基本一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)痰液標(biāo)本來(lái)源菌株exoU的攜帶率顯著高于血液來(lái)源菌株（P＜0.05）。HORNA等[17]的研究指出T3SS效應(yīng)蛋白編碼基因exoU是導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡的高度細(xì)胞毒性表型，攜帶exoU的菌株被認(rèn)為具有較強(qiáng)的毒力且常與嚴(yán)重感染有關(guān)。而銅綠假單胞菌是引起呼吸道感染的重要原因，痰液是銅綠假單胞菌感染的主要標(biāo)本分離來(lái)源，有研究報(bào)道[18]毒力強(qiáng)的銅綠假單胞菌更易引起呼吸道感染，這與本研究結(jié)果一致。可能與銅綠假單胞菌所引起的呼吸道感染持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、預(yù)后較差有關(guān)。我們對(duì)2016至2018年不同標(biāo)本來(lái)源銅綠假單胞菌的藥敏分析顯示痰液來(lái)源菌株對(duì)亞胺培南的耐藥率顯著高于血液來(lái)源菌株（P＜0.05），這可能因?yàn)楹粑婪蛛x的銅綠假單胞菌的大部分患者常合并有肺部基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致對(duì)吸入微生物的清除延遲，治療周期長(zhǎng)、易誘導(dǎo)和篩選出耐藥菌[19]。同時(shí)這提示我們?cè)谂R床用藥時(shí)要關(guān)注呼吸道來(lái)源銅綠假單胞菌的碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥水平，選擇合適藥物治療。另一方面有研究報(bào)道[8]銅綠假單胞菌中還存在3種進(jìn)化上完全不同的T6SS基因群（分別為H1-T6SS、H2-T6SS和H3-T6SS），表達(dá)tse1、tse2、tse3、pldA、pldB等相關(guān)基因。其中由pldA基因編碼的磷脂酶A（PldA）是銅綠假單胞菌H2-T6SS的效應(yīng)蛋白，可向宿主細(xì)胞傳遞毒素。本研究結(jié)果顯示包括pldA在內(nèi)的T6SS相關(guān)效應(yīng)蛋白編碼基因在痰液標(biāo)本和血液標(biāo)本來(lái)源的菌株中不存在顯著性差異。有研究報(bào)道指出黏液性銅綠假單胞菌中pldA和exoU的存在與非囊性纖維化患者惡化的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[11]，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示pldA和exoU表達(dá)之間呈正相關(guān)性（r=0.474，P＜0.01），這提示我們可對(duì)pldA在嚴(yán)重感染疾病中的致病作用開(kāi)展進(jìn)一步研究。關(guān)于T3SS和T6SS效應(yīng)蛋白編碼基因與耐藥相關(guān)性的探究，之前有研究報(bào)道攜帶exoU基因的菌株耐藥性更強(qiáng)[20]。TAKATA等[21]的研究指出碳青霉烯類(lèi)以及氟喹諾酮類(lèi)耐藥菌株中exoU基因的攜帶率較高；另外BOULANT等[9]的研究也表明pldA基因在耐藥菌株中有較高的攜帶率。本研究結(jié)果顯示攜帶不同T3SS和T6SS基因銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物亞胺培南的耐藥率較高，但不同的基因之間不具有顯著性差異（P＞0.05）。關(guān)于攜帶高毒力基因exoU或pldA或其他T3SS及T6SS相關(guān)基因菌株是否在介導(dǎo)抗菌藥物耐藥性方面起著相關(guān)作用仍需要在未來(lái)進(jìn)行更加廣泛且深入的研究。

綜上所述，銅綠假單胞菌對(duì)T3SS和T6SS大部分效應(yīng)蛋白編碼基因的攜帶情況具有一定普遍性，但個(gè)別毒力較高的分泌系統(tǒng)編碼基因的攜帶需要引起我們的關(guān)注。本研究提示T6SS或可作為治療銅綠假單胞菌感染性疾病的新靶標(biāo)，從而針對(duì)性地控制T6SS相關(guān)效應(yīng)蛋白編碼基因攜帶可能引起的銅綠假單胞菌相關(guān)感染疾病，另外在臨床治療中要及時(shí)關(guān)注痰液來(lái)源菌株的毒力特性及耐藥性，合理安排用藥方案。