劉藝唐，丁孜涵，程文青，蔡哲旸，沈琳杰，郭衛(wèi)，2

溫州醫(yī)科大學，浙江 溫州 325035，1.眼視光學院（生物醫(yī)學工程學院）；2.眼視光學和視覺科學國家重點實驗室分子神經藥理學實驗室和眼-腦研究中心

外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1 （ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1, ENPP1）是最早發(fā)現(xiàn)的外核苷酸-焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員，又稱磷酸二酯酶1（phosphodiesterase 1）或CD203a。早期的研究發(fā)現(xiàn)，該酶在細胞外腺苷代謝過程中發(fā)揮重要作用。作為重要信號分子的腺苷，其細胞外的代謝受到嚴格的調控（見圖1）：除了經典的CD39-CD73腺苷代謝通路之外，尚存在CD38-ENPP1-CD73代謝途徑，前者CD39可將胞外的ATP轉化成AMP，而后AMP被CD73轉化為腺苷，后者由CD38將胞外NAD+轉化為ADPR，然后在ENPP1作用下轉化為AMP，而后AMP被CD73轉化為腺苷[1]。腺苷通過結合腺苷受體在睡眠、認知、運動、心血管、腫瘤、炎癥等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[2]。因此，腺苷代謝系統(tǒng)已成為重要的藥物研發(fā)靶點[3]，但針對ENPP1的藥物研發(fā)進展較少。近些年的研究表明ENPP1是胞外環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶（cyclic guanosine monophosphateadenosine monophosphate, cGAMP）最主要的水解 酶[4]，在腫瘤浸潤等過程中發(fā)揮至關重要的作用。因此，其作為藥物治療靶點的價值值得重視。

圖1 ENPP1參與胞外腺苷和cGAMP代謝的示意圖

本文將在簡要回顧ENPP1結構的基礎上，重點介紹其在生物礦化、腫瘤、心臟損傷等生理病理過程中的作用，以及針對ENPP1靶點在酶替代療法和小分子藥物方面的研發(fā)進展。

1 ENPP1結構特點

在還原和非還原條件下，ENPP1分別為115 kDa和230 kDa蛋白[6]。2012年，KATO等[7]報道了ENPP1的晶體結構。ENPP1是一種多結構域蛋白（見圖2），且為II型膜蛋白[8]，主要包括兩個N端生長素樣結構域、一個磷酸二酯酶結構域和一個核酸酶樣結構域。ENPP1通過不同的結構域參與不同的生物學過程：如催化和核酸酶樣結構域參與礦化，生長素樣結構域參與胰島素信號轉導。ENPP1有三個糖基化位點，它們增強了結構域間的相互作用[7]。新近的研究[9]發(fā)現(xiàn)單個組氨酸位點（H362）對于ENPP1底物選擇性至關重要：該位點的突變可破壞2’-3’-cGAMP降解活性，但完好保持了該酶對其他底物的活性。值得注意的是，這個組氨酸位點活性在整個進化史中幾乎是100%保守的。

圖2 ENPP1蛋白結構示意圖

2 ENPP1的生理病理功能

2.1 ENPP1與生物礦化 生物礦化是指由生物體通過生物大分子的調控生成無機礦物的過程，是骨骼、牙齒等發(fā)育過程中重要的環(huán)節(jié)。生物礦化由礦化底物無機磷（Pi）和礦化抑制物無機焦磷（PPi）的胞外濃度之間的平衡進行調節(jié)，該過程受到甲狀旁腺激素、維生素D、維生素K、成纖維細胞生長因子23和磷酸酶等的調控[10]。ENPP1通過水解胞外核苷酸三磷酸鹽（nucleotide triphosphates, NTPs）產生PPi負向調節(jié)骨礦化，而組織非特異性堿性磷酸酶通過水解NTPs和PPi產生Pi正向調節(jié)礦化。因此，ENPP1是哺乳動物中骨和軟骨發(fā)育過程中至關重要的調控因子。目前發(fā)現(xiàn)多種遺傳性礦化、鈣處理或鈣化相關疾病與ENPP1的功能突變有關，包括常染色體隱性低磷佝僂病2型[11]、脊柱后縱韌帶骨化、嬰兒期全身性動脈鈣化[12-14]、鈣化性冠狀動脈病變[15]、CD73缺乏引起的動脈鈣化和彈性假性黃瘤[16]等。值得注意的是，幾乎所有ENPP1的疾病相關突變都存在于催化結構域或核酸酶樣結構域內，影響ENPP1蛋白的穩(wěn)定性，但不影響金屬結合位點或糖基化位點[8]。

2.2 ENPP1與腫瘤 在人類癌癥中，ENPP1的表達異常免疫細胞浸潤減少、轉移增加以及程序性細胞死亡蛋白1或程序性細胞死亡配體1單抗治療的抵抗有關。通過分析多種不同組織來源的腫瘤（包括乳腺癌、肝癌、甲狀腺癌、黏膜黑色素瘤等）的ENPP1 mRNA和蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在轉移性腫瘤樣本中ENPP1表達顯著增加，在免疫細胞豐富的微環(huán)境中，癌細胞群顯示較高的ENPP1表達。有研究發(fā)現(xiàn)，ENPP1可以兩種不同的方式影響癌癥，除腺苷代謝系統(tǒng)外，還可通過影響環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）-STING（stimulator of interferon genes）[17]警報系統(tǒng)發(fā)揮作用。

在正常生理條件下，細胞外腺苷濃度會維持在較低的水平（＜1 μmoL/L）。但在腫瘤微環(huán)境中，低pH、低氧環(huán)境會限制細胞的能量來源，導致胞外腺苷濃度高達100 μmoL/L，進而嚴重抑制免疫細胞的功能。此外，由于腫瘤細胞的高度更新特性，導致CD73和CD39表達上調并下調腺苷激酶，最終導致腺苷的生成增加而分解減少，使腫瘤中的腺苷水平遠高于正常組織[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的胞外cGAMP代謝路徑會導致胞外腺苷的產生（見圖1）：在細胞外環(huán)境中，cGAMP被ENPP1水解后產生AMP和GMP，同時ATP被CD39去磷酸化產生AMP，兩條途徑來源的AMP可被CD73快速去磷酸化，形成腺苷[6，19]。 盡管ATP水解可能是原發(fā)腫瘤細胞胞外腺苷的主要來源，但ENPP1水解cGAMP作為腺苷來源的占比由于轉移的進展而增加[20]。ENPP1缺陷小鼠表現(xiàn)出抵抗癌變或轉移的能力，進一步提示在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中ENPP1介導腺苷產生的重要性[21]。

cGAS是一種胞質DNA感受器，感知病原DNA后激活cGAS-STING通路。該通路不僅介導天然免疫應答以抵抗多種含DNA的病原微生物感染，還能感知腫瘤來源的DNA而產生抗腫瘤免疫應答。隨著癌細胞的分裂，DNA片段甚至整個染色體都可能會重復、突變或完全缺失，這就是所謂的染色體不穩(wěn)定性。當癌細胞染色體的DNA進入細胞質，cGAS就會與其結合形成cGAMP。cGAMP作為警報信號可發(fā)揮雙重作用：在細胞內，cGAMP激活名為STING的免疫反應；大部分的cGAMP被轉運到細胞外，作為鄰近免疫細胞的警告信號，從而激活STING通路并啟動免疫反應。新近的研究發(fā)現(xiàn)ENPP1會水解cGAMP，使腫瘤激活cGAS產生的促炎信號轉化為免疫抑制[20]：通過對乳腺癌、肺癌和結直腸癌小鼠進行一系列實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)激活ENPP1可抑制免疫反應并增加癌癥轉移，而抑制ENPP1則會促進宿主的免疫反應并減少轉移；分析人類癌癥樣本發(fā)現(xiàn)，ENPP1的表達異常與癌癥轉移的增加及對免疫療法耐受性的增加直接相關。

新近的研究[22]利用改進的小鼠乳腺癌模型確定ENPP1與局部區(qū)域復發(fā)密切相關：循環(huán)中的腫瘤細胞高表達ENPP1可通過自我接種機制促進腫瘤復發(fā)；基因敲除小鼠和利用藥理學阻斷ENPP1可延長無復發(fā)生存期；機制研究發(fā)現(xiàn)ENPP1產生的腺苷代謝物可增強結合珠蛋白（haptoglobin, HP）的表達，從而誘導髓樣細胞浸潤并促進網狀結構形成；在復發(fā)的人乳腺癌腫瘤中檢測到ENPP1顯著增加進一步提示兩者之間的關系?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)揭示了ENPP1/HP信號通路在腫瘤局部復發(fā)中的全新作用。

2.3 ENPP1與心臟缺血性損傷后修復 缺血性損傷后的心臟創(chuàng)傷愈合過程是多種細胞相互作用的精準的時空調控過程[23]。目前免疫細胞、內皮細胞和成纖維細胞相互作用的研究較多，但對于心臟成肌細胞在此過程中的作用尚不明確。近期的研究[24]發(fā)現(xiàn)，心臟損傷可誘導非成肌細胞（單細胞測序發(fā)現(xiàn)主要是成纖維細胞）上ENPP1異常高表達，ENPP1水解細胞外ATP形成AMP。在AMP作用下，心臟成肌細胞釋放腺嘌呤和特定核糖核苷，這些分子可在乳清苷一磷酸步驟中斷嘧啶生物合成，并誘導基因毒性應激和p53介導的循環(huán)型非成肌細胞的細胞死亡；通過尿嘧啶或通過ENPP1/AMP途徑的基因靶向治療可拯救在心臟修復中發(fā)揮重要作用的非成肌細胞內的嘧啶生物合成途徑，并增強心臟損傷后的修復；研究者還篩選鑒定了小分子的ENPP1抑制劑，在心臟損傷后通過全身給藥可挽救非成肌細胞中的嘧啶生物合成，并增強心臟修復和梗死后心臟功能。這些觀察表明心肌細胞通過調節(jié)非成肌細胞的核苷酸代謝和嘧啶生物合成在心臟修復中發(fā)揮關鍵作用。

3 ENPP1相關藥物研發(fā)

腺苷代謝系統(tǒng)已成為藥物研發(fā)的熱門靶點。早在2008年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準腺苷A2A受體激動劑瑞加德松用于心肌再灌注成像。2019年，A2A受體拮抗劑伊曲茶堿獲批用于帕金森病的治療[25]。2015年底，F(xiàn)DA批準強生公司靶向CD38的抗體藥物達拉木單抗上市，成為全球首個獲批治療多發(fā)性骨髓瘤的CD38單克隆抗體藥物[26]。目前，針對CD73和CD39靶點的藥物研發(fā)也取得了令人興奮的進展[21]，多款靶向A2A受體可用于腫瘤治療的小分子化合物藥物處于臨床試驗中[19，27]。然而，目前靶向ENPP1的藥物進展緩慢。考慮到ENPP1的功能，針對異常ENPP1的酶替代療法是先前研究的重點，但隨著ENPP1在cGAS-STING通路中的調節(jié)作用被發(fā)現(xiàn)，其作為藥物靶點的價值目前得到越來越多的重視。

3.1 ENPP1酶替代療法 自二十世紀九十年代以來，酶替代療法在治療多種遺傳罕見疾病的有效性和安全性已得到廣泛證實，既挽救新生兒生命又改善患者生活質量[28-29]。酶替代療法用于治療ENPP1突變導致的功能缺失已成為重要的治療策略。嬰兒期全身性動脈鈣化是一種威脅兒童早期生命的罕見疾病，主要由ENPP1基因的等位致病基因突變或ABCC6基因的突變引起。2015年ALBRIGHT等[30]開發(fā)了可溶性重組蛋白ENPP1-Fc，將ENPP1蛋白胞外域與免疫球蛋白IgG1的Fc蛋白域融合在一起，旨在恢復ENPP1或ABCC6缺失導致的生物礦化通路缺陷。近年來通過蛋白工程和糖基化修飾改造可將ENPP1-Fc的半衰期延長10倍以上[31]，這促進了其未來的臨床應用。在ENPP1缺乏的小鼠模型中，ENPP1-Fc可防止小鼠的死亡和血管鈣化[30]，并改善血壓和心功能，可預防低磷血癥性軟骨病引起的內膜增生和骨骼并發(fā)癥[32]。目前ENPP1-Fc用于治療ENPP1缺乏癥或ABCC6缺乏癥已獲得孤兒藥資格，臨床試驗正在開展中。

3.2 ENPP1小分子抑制劑 激活STING可促進腫瘤免疫，但由于STING也有促進腫瘤的作用以及非選擇性的系統(tǒng)性激活STING可能導致細胞因子風暴等安全性問題，目前STING激動劑的臨床療效不佳。正常情況下DNA分布在細胞核和線粒體中，僅在病原體入侵、腫瘤等病理情況才會進入胞質中。2’3’-cGAMP是胞質DNA經酶催化生成，正常細胞不含2’3’-cGAMP，此時，STING信號通路沒有活性，也不能通過對ENPP1的抑制激活STING信號通路。ENPP1是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠水解2’3’-cGAMP的酶，而ENPP1抑制劑能夠選擇性地激活腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中其他細胞的STING信號通路實現(xiàn)其高選擇性，因此通過抑制ENPP1進而促進STING激活的策略受到重視。

目前，ENPP1的核苷酸類抑制劑大多是底物類似物，即腺嘌呤核苷酸類似物和衍生物。由于以核苷酸為基礎的抑制劑具有與天然底物相似的結構[6]， 因此它們的開發(fā)相對簡單。但是目前的抑制劑也存在諸多問題：效力中等；對ENPP1和其他胞外核苷酸酶的選擇性還沒有得到充分的研究；自身的高酸度限制了口服生物利用度；且它們的化學和代謝穩(wěn)定性不高[33]。

目前針對ENPP1的非核苷酸抑制劑也在研發(fā)中，但多數(shù)還處于較早期的階段。根據(jù)結構的不同，非核苷酸抑制劑大致可分為四類：多磺酸鹽、多糖、多金屬化合物、各種小雜環(huán)化合物。多磺酸鹽類以活性藍2和蘇拉明為代表，它們在不同底物的作用下對ENPP1的抑制強弱有所不同[34-36]，但兩者的選擇性都不高。肝素是最早報道的多糖類抑制劑[37]，但其主要和凝血酶結合發(fā)揮作用，對ENPP1沒有選擇性[38]。多金屬氧酸鹽是以鎢、鉬或釩等重金屬離子為中心原子，被氧原子包圍的帶負電荷的無機簇合物[39]，其中多氧鎢酸鹽[TiW11CoO40]8-（PSBPOM141）被認為是迄今對ENPP1最有效的抑制劑[40]，但由于PSB-POM141的負電荷和高相對分子質量，其口服應用受到限制[40]。多種雜環(huán)化合物也可作為ENPP1的抑制劑，其中噻唑苯并咪唑酮類化合物為代表，此類化合物對ENPP1表現(xiàn)出高選擇性，但其水解性仍有待提高[41]。

4 總結和展望

ENPP1的結構特點決定了其功能的多樣性，表現(xiàn)為：①該酶催化活性的多樣性。原來關注較多的是在腺苷產生中的作用，近期發(fā)現(xiàn)其作為cGAMP水解酶的作用大大拓展了對于該酶功能的認知。②該酶發(fā)揮作用也可依靠非酶催化，例如在2型糖尿病中。ENPP1在胰島素抵抗患者的骨骼肌、脂肪組織以及培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞和培養(yǎng)的哺乳動物上皮細胞中過表達，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，ENPP1直接與胰島素受體的α亞基相互作用，通過降低受體的β亞基自磷酸化能力而抑制后續(xù)信號傳導[42]。

雖然近些年來對于ENPP1結構和功能的理解取得了較多的進展，但是該領域仍然存在諸多問題有待深入研究：①除了本文提及的功能研究，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)ENPP1基因突變與多種疾?。ㄈ缭星俺?重[43]、自閉癥譜系障礙[44]）的發(fā)生相關聯(lián)，但是具體的機制還有待深入研究。功能研究的進步得益于研究手段的發(fā)展，基因編輯等技術的飛速發(fā)展將有助于將點突變小鼠和條件性敲除小鼠用于ENPP1功能的研究。②目前對于ENPP1表達異常的調控研究和蛋白翻譯后修飾水平的研究還較少，這些問題的理解將有助于深入認知該酶在病理生理過程中的作用。③考慮到酶替代療法的局限性和腫瘤治療的巨大需求，相信未來針對ENPP1的藥物，將涌現(xiàn)出更多的開發(fā)策略。