劉藝唐，丁孜涵，程文青，蔡哲旸，沈琳杰，郭衛(wèi)，2

溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.眼視光學(xué)院（生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院）；2.眼視光學(xué)和視覺(jué)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子神經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室和眼-腦研究中心

外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1 （ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1, ENPP1）是最早發(fā)現(xiàn)的外核苷酸-焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員，又稱磷酸二酯酶1（phosphodiesterase 1）或CD203a。早期的研究發(fā)現(xiàn)，該酶在細(xì)胞外腺苷代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。作為重要信號(hào)分子的腺苷，其細(xì)胞外的代謝受到嚴(yán)格的調(diào)控（見(jiàn)圖1）：除了經(jīng)典的CD39-CD73腺苷代謝通路之外，尚存在CD38-ENPP1-CD73代謝途徑，前者CD39可將胞外的ATP轉(zhuǎn)化成AMP，而后AMP被CD73轉(zhuǎn)化為腺苷，后者由CD38將胞外NAD+轉(zhuǎn)化為ADPR，然后在ENPP1作用下轉(zhuǎn)化為AMP，而后AMP被CD73轉(zhuǎn)化為腺苷[1]。腺苷通過(guò)結(jié)合腺苷受體在睡眠、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)、心血管、腫瘤、炎癥等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。因此，腺苷代謝系統(tǒng)已成為重要的藥物研發(fā)靶點(diǎn)[3]，但針對(duì)ENPP1的藥物研發(fā)進(jìn)展較少。近些年的研究表明ENPP1是胞外環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷合成酶（cyclic guanosine monophosphateadenosine monophosphate, cGAMP）最主要的水解 酶[4]，在腫瘤浸潤(rùn)等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，其作為藥物治療靶點(diǎn)的價(jià)值值得重視。

圖1 ENPP1參與胞外腺苷和cGAMP代謝的示意圖

本文將在簡(jiǎn)要回顧ENPP1結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)介紹其在生物礦化、腫瘤、心臟損傷等生理病理過(guò)程中的作用，以及針對(duì)ENPP1靶點(diǎn)在酶替代療法和小分子藥物方面的研發(fā)進(jìn)展。

1 ENPP1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在還原和非還原條件下，ENPP1分別為115 kDa和230 kDa蛋白[6]。2012年，KATO等[7]報(bào)道了ENPP1的晶體結(jié)構(gòu)。ENPP1是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白（見(jiàn)圖2），且為II型膜蛋白[8]，主要包括兩個(gè)N端生長(zhǎng)素樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)磷酸二酯酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核酸酶樣結(jié)構(gòu)域。ENPP1通過(guò)不同的結(jié)構(gòu)域參與不同的生物學(xué)過(guò)程：如催化和核酸酶樣結(jié)構(gòu)域參與礦化，生長(zhǎng)素樣結(jié)構(gòu)域參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。ENPP1有三個(gè)糖基化位點(diǎn)，它們?cè)鰪?qiáng)了結(jié)構(gòu)域間的相互作用[7]。新近的研究[9]發(fā)現(xiàn)單個(gè)組氨酸位點(diǎn)（H362）對(duì)于ENPP1底物選擇性至關(guān)重要：該位點(diǎn)的突變可破壞2’-3’-cGAMP降解活性，但完好保持了該酶對(duì)其他底物的活性。值得注意的是，這個(gè)組氨酸位點(diǎn)活性在整個(gè)進(jìn)化史中幾乎是100%保守的。

圖2 ENPP1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

2 ENPP1的生理病理功能

2.1 ENPP1與生物礦化 生物礦化是指由生物體通過(guò)生物大分子的調(diào)控生成無(wú)機(jī)礦物的過(guò)程，是骨骼、牙齒等發(fā)育過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)。生物礦化由礦化底物無(wú)機(jī)磷（Pi）和礦化抑制物無(wú)機(jī)焦磷（PPi）的胞外濃度之間的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)，該過(guò)程受到甲狀旁腺激素、維生素D、維生素K、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23和磷酸酶等的調(diào)控[10]。ENPP1通過(guò)水解胞外核苷酸三磷酸鹽（nucleotide triphosphates, NTPs）產(chǎn)生PPi負(fù)向調(diào)節(jié)骨礦化，而組織非特異性堿性磷酸酶通過(guò)水解NTPs和PPi產(chǎn)生Pi正向調(diào)節(jié)礦化。因此，ENPP1是哺乳動(dòng)物中骨和軟骨發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要的調(diào)控因子。目前發(fā)現(xiàn)多種遺傳性礦化、鈣處理或鈣化相關(guān)疾病與ENPP1的功能突變有關(guān)，包括常染色體隱性低磷佝僂病2型[11]、脊柱后縱韌帶骨化、嬰兒期全身性動(dòng)脈鈣化[12-14]、鈣化性冠狀動(dòng)脈病變[15]、CD73缺乏引起的動(dòng)脈鈣化和彈性假性黃瘤[16]等。值得注意的是，幾乎所有ENPP1的疾病相關(guān)突變都存在于催化結(jié)構(gòu)域或核酸酶樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)，影響ENPP1蛋白的穩(wěn)定性，但不影響金屬結(jié)合位點(diǎn)或糖基化位點(diǎn)[8]。

2.2 ENPP1與腫瘤 在人類癌癥中，ENPP1的表達(dá)異常免疫細(xì)胞浸潤(rùn)減少、轉(zhuǎn)移增加以及程序性細(xì)胞死亡蛋白1或程序性細(xì)胞死亡配體1單抗治療的抵抗有關(guān)。通過(guò)分析多種不同組織來(lái)源的腫瘤（包括乳腺癌、肝癌、甲狀腺癌、黏膜黑色素瘤等）的ENPP1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性腫瘤樣本中ENPP1表達(dá)顯著增加，在免疫細(xì)胞豐富的微環(huán)境中，癌細(xì)胞群顯示較高的ENPP1表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，ENPP1可以兩種不同的方式影響癌癥，除腺苷代謝系統(tǒng)外，還可通過(guò)影響環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷合成酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）-STING（stimulator of interferon genes）[17]警報(bào)系統(tǒng)發(fā)揮作用。

在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞外腺苷濃度會(huì)維持在較低的水平（＜1 μmoL/L）。但在腫瘤微環(huán)境中，低pH、低氧環(huán)境會(huì)限制細(xì)胞的能量來(lái)源，導(dǎo)致胞外腺苷濃度高達(dá)100 μmoL/L，進(jìn)而嚴(yán)重抑制免疫細(xì)胞的功能。此外，由于腫瘤細(xì)胞的高度更新特性，導(dǎo)致CD73和CD39表達(dá)上調(diào)并下調(diào)腺苷激酶，最終導(dǎo)致腺苷的生成增加而分解減少，使腫瘤中的腺苷水平遠(yuǎn)高于正常組織[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來(lái)源的胞外cGAMP代謝路徑會(huì)導(dǎo)致胞外腺苷的產(chǎn)生（見(jiàn)圖1）：在細(xì)胞外環(huán)境中，cGAMP被ENPP1水解后產(chǎn)生AMP和GMP，同時(shí)ATP被CD39去磷酸化產(chǎn)生AMP，兩條途徑來(lái)源的AMP可被CD73快速去磷酸化，形成腺苷[6，19]。 盡管ATP水解可能是原發(fā)腫瘤細(xì)胞胞外腺苷的主要來(lái)源，但ENPP1水解cGAMP作為腺苷來(lái)源的占比由于轉(zhuǎn)移的進(jìn)展而增加[20]。ENPP1缺陷小鼠表現(xiàn)出抵抗癌變或轉(zhuǎn)移的能力，進(jìn)一步提示在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中ENPP1介導(dǎo)腺苷產(chǎn)生的重要性[21]。

cGAS是一種胞質(zhì)DNA感受器，感知病原DNA后激活cGAS-STING通路。該通路不僅介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答以抵抗多種含DNA的病原微生物感染，還能感知腫瘤來(lái)源的DNA而產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。隨著癌細(xì)胞的分裂，DNA片段甚至整個(gè)染色體都可能會(huì)重復(fù)、突變或完全缺失，這就是所謂的染色體不穩(wěn)定性。當(dāng)癌細(xì)胞染色體的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，cGAS就會(huì)與其結(jié)合形成cGAMP。cGAMP作為警報(bào)信號(hào)可發(fā)揮雙重作用：在細(xì)胞內(nèi)，cGAMP激活名為STING的免疫反應(yīng)；大部分的cGAMP被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，作為鄰近免疫細(xì)胞的警告信號(hào)，從而激活STING通路并啟動(dòng)免疫反應(yīng)。新近的研究發(fā)現(xiàn)ENPP1會(huì)水解cGAMP，使腫瘤激活cGAS產(chǎn)生的促炎信號(hào)轉(zhuǎn)化為免疫抑制[20]：通過(guò)對(duì)乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌小鼠進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)激活ENPP1可抑制免疫反應(yīng)并增加癌癥轉(zhuǎn)移，而抑制ENPP1則會(huì)促進(jìn)宿主的免疫反應(yīng)并減少轉(zhuǎn)移；分析人類癌癥樣本發(fā)現(xiàn)，ENPP1的表達(dá)異常與癌癥轉(zhuǎn)移的增加及對(duì)免疫療法耐受性的增加直接相關(guān)。

新近的研究[22]利用改進(jìn)的小鼠乳腺癌模型確定ENPP1與局部區(qū)域復(fù)發(fā)密切相關(guān)：循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)ENPP1可通過(guò)自我接種機(jī)制促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)；基因敲除小鼠和利用藥理學(xué)阻斷ENPP1可延長(zhǎng)無(wú)復(fù)發(fā)生存期；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ENPP1產(chǎn)生的腺苷代謝物可增強(qiáng)結(jié)合珠蛋白（haptoglobin, HP）的表達(dá)，從而誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞浸潤(rùn)并促進(jìn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成；在復(fù)發(fā)的人乳腺癌腫瘤中檢測(cè)到ENPP1顯著增加進(jìn)一步提示兩者之間的關(guān)系?？傊@些發(fā)現(xiàn)揭示了ENPP1/HP信號(hào)通路在腫瘤局部復(fù)發(fā)中的全新作用。

2.3 ENPP1與心臟缺血性損傷后修復(fù) 缺血性損傷后的心臟創(chuàng)傷愈合過(guò)程是多種細(xì)胞相互作用的精準(zhǔn)的時(shí)空調(diào)控過(guò)程[23]。目前免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互作用的研究較多，但對(duì)于心臟成肌細(xì)胞在此過(guò)程中的作用尚不明確。近期的研究[24]發(fā)現(xiàn)，心臟損傷可誘導(dǎo)非成肌細(xì)胞（單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)主要是成纖維細(xì)胞）上ENPP1異常高表達(dá)，ENPP1水解細(xì)胞外ATP形成AMP。在AMP作用下，心臟成肌細(xì)胞釋放腺嘌呤和特定核糖核苷，這些分子可在乳清苷一磷酸步驟中斷嘧啶生物合成，并誘導(dǎo)基因毒性應(yīng)激和p53介導(dǎo)的循環(huán)型非成肌細(xì)胞的細(xì)胞死亡；通過(guò)尿嘧啶或通過(guò)ENPP1/AMP途徑的基因靶向治療可拯救在心臟修復(fù)中發(fā)揮重要作用的非成肌細(xì)胞內(nèi)的嘧啶生物合成途徑，并增強(qiáng)心臟損傷后的修復(fù)；研究者還篩選鑒定了小分子的ENPP1抑制劑，在心臟損傷后通過(guò)全身給藥可挽救非成肌細(xì)胞中的嘧啶生物合成，并增強(qiáng)心臟修復(fù)和梗死后心臟功能。這些觀察表明心肌細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)非成肌細(xì)胞的核苷酸代謝和嘧啶生物合成在心臟修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3 ENPP1相關(guān)藥物研發(fā)

腺苷代謝系統(tǒng)已成為藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)。早在2008年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)腺苷A2A受體激動(dòng)劑瑞加德松用于心肌再灌注成像。2019年，A2A受體拮抗劑伊曲茶堿獲批用于帕金森病的治療[25]。2015年底，F(xiàn)DA批準(zhǔn)強(qiáng)生公司靶向CD38的抗體藥物達(dá)拉木單抗上市，成為全球首個(gè)獲批治療多發(fā)性骨髓瘤的CD38單克隆抗體藥物[26]。目前，針對(duì)CD73和CD39靶點(diǎn)的藥物研發(fā)也取得了令人興奮的進(jìn)展[21]，多款靶向A2A受體可用于腫瘤治療的小分子化合物藥物處于臨床試驗(yàn)中[19，27]。然而，目前靶向ENPP1的藥物進(jìn)展緩慢。考慮到ENPP1的功能，針對(duì)異常ENPP1的酶替代療法是先前研究的重點(diǎn)，但隨著ENPP1在cGAS-STING通路中的調(diào)節(jié)作用被發(fā)現(xiàn)，其作為藥物靶點(diǎn)的價(jià)值目前得到越來(lái)越多的重視。

3.1 ENPP1酶替代療法 自二十世紀(jì)九十年代以來(lái)，酶替代療法在治療多種遺傳罕見(jiàn)疾病的有效性和安全性已得到廣泛證實(shí)，既挽救新生兒生命又改善患者生活質(zhì)量[28-29]。酶替代療法用于治療ENPP1突變導(dǎo)致的功能缺失已成為重要的治療策略。嬰兒期全身性動(dòng)脈鈣化是一種威脅兒童早期生命的罕見(jiàn)疾病，主要由ENPP1基因的等位致病基因突變或ABCC6基因的突變引起。2015年ALBRIGHT等[30]開(kāi)發(fā)了可溶性重組蛋白ENPP1-Fc，將ENPP1蛋白胞外域與免疫球蛋白IgG1的Fc蛋白域融合在一起，旨在恢復(fù)ENPP1或ABCC6缺失導(dǎo)致的生物礦化通路缺陷。近年來(lái)通過(guò)蛋白工程和糖基化修飾改造可將ENPP1-Fc的半衰期延長(zhǎng)10倍以上[31]，這促進(jìn)了其未來(lái)的臨床應(yīng)用。在ENPP1缺乏的小鼠模型中，ENPP1-Fc可防止小鼠的死亡和血管鈣化[30]，并改善血壓和心功能，可預(yù)防低磷血癥性軟骨病引起的內(nèi)膜增生和骨骼并發(fā)癥[32]。目前ENPP1-Fc用于治療ENPP1缺乏癥或ABCC6缺乏癥已獲得孤兒藥資格，臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展中。

3.2 ENPP1小分子抑制劑 激活STING可促進(jìn)腫瘤免疫，但由于STING也有促進(jìn)腫瘤的作用以及非選擇性的系統(tǒng)性激活STING可能導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴等安全性問(wèn)題，目前STING激動(dòng)劑的臨床療效不佳。正常情況下DNA分布在細(xì)胞核和線粒體中，僅在病原體入侵、腫瘤等病理情況才會(huì)進(jìn)入胞質(zhì)中。2’3’-cGAMP是胞質(zhì)DNA經(jīng)酶催化生成，正常細(xì)胞不含2’3’-cGAMP，此時(shí)，STING信號(hào)通路沒(méi)有活性，也不能通過(guò)對(duì)ENPP1的抑制激活STING信號(hào)通路。ENPP1是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠水解2’3’-cGAMP的酶，而ENPP1抑制劑能夠選擇性地激活腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞的STING信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其高選擇性，因此通過(guò)抑制ENPP1進(jìn)而促進(jìn)STING激活的策略受到重視。

目前，ENPP1的核苷酸類抑制劑大多是底物類似物，即腺嘌呤核苷酸類似物和衍生物。由于以核苷酸為基礎(chǔ)的抑制劑具有與天然底物相似的結(jié)構(gòu)[6]， 因此它們的開(kāi)發(fā)相對(duì)簡(jiǎn)單。但是目前的抑制劑也存在諸多問(wèn)題：效力中等；對(duì)ENPP1和其他胞外核苷酸酶的選擇性還沒(méi)有得到充分的研究；自身的高酸度限制了口服生物利用度；且它們的化學(xué)和代謝穩(wěn)定性不高[33]。

目前針對(duì)ENPP1的非核苷酸抑制劑也在研發(fā)中，但多數(shù)還處于較早期的階段。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，非核苷酸抑制劑大致可分為四類：多磺酸鹽、多糖、多金屬化合物、各種小雜環(huán)化合物。多磺酸鹽類以活性藍(lán)2和蘇拉明為代表，它們?cè)诓煌孜锏淖饔孟聦?duì)ENPP1的抑制強(qiáng)弱有所不同[34-36]，但兩者的選擇性都不高。肝素是最早報(bào)道的多糖類抑制劑[37]，但其主要和凝血酶結(jié)合發(fā)揮作用，對(duì)ENPP1沒(méi)有選擇性[38]。多金屬氧酸鹽是以鎢、鉬或釩等重金屬離子為中心原子，被氧原子包圍的帶負(fù)電荷的無(wú)機(jī)簇合物[39]，其中多氧鎢酸鹽[TiW11CoO40]8-（PSBPOM141）被認(rèn)為是迄今對(duì)ENPP1最有效的抑制劑[40]，但由于PSB-POM141的負(fù)電荷和高相對(duì)分子質(zhì)量，其口服應(yīng)用受到限制[40]。多種雜環(huán)化合物也可作為ENPP1的抑制劑，其中噻唑苯并咪唑酮類化合物為代表，此類化合物對(duì)ENPP1表現(xiàn)出高選擇性，但其水解性仍有待提高[41]。

4 總結(jié)和展望

ENPP1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其功能的多樣性，表現(xiàn)為：①該酶催化活性的多樣性。原來(lái)關(guān)注較多的是在腺苷產(chǎn)生中的作用，近期發(fā)現(xiàn)其作為cGAMP水解酶的作用大大拓展了對(duì)于該酶功能的認(rèn)知。②該酶發(fā)揮作用也可依靠非酶催化，例如在2型糖尿病中。ENPP1在胰島素抵抗患者的骨骼肌、脂肪組織以及培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞和培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ENPP1直接與胰島素受體的α亞基相互作用，通過(guò)降低受體的β亞基自磷酸化能力而抑制后續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)[42]。

雖然近些年來(lái)對(duì)于ENPP1結(jié)構(gòu)和功能的理解取得了較多的進(jìn)展，但是該領(lǐng)域仍然存在諸多問(wèn)題有待深入研究：①除了本文提及的功能研究，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)ENPP1基因突變與多種疾病（如孕前超 重[43]、自閉癥譜系障礙[44]）的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，但是具體的機(jī)制還有待深入研究。功能研究的進(jìn)步得益于研究手段的發(fā)展，基因編輯等技術(shù)的飛速發(fā)展將有助于將點(diǎn)突變小鼠和條件性敲除小鼠用于ENPP1功能的研究。②目前對(duì)于ENPP1表達(dá)異常的調(diào)控研究和蛋白翻譯后修飾水平的研究還較少，這些問(wèn)題的理解將有助于深入認(rèn)知該酶在病理生理過(guò)程中的作用。③考慮到酶替代療法的局限性和腫瘤治療的巨大需求，相信未來(lái)針對(duì)ENPP1的藥物，將涌現(xiàn)出更多的開(kāi)發(fā)策略。