阮妙華，胡思思，周曉軍，石佳旻，陳源，朱棉棉，王楸，王丹

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 兒科，浙江 溫州 325015

巨腦畸形-多小腦回-多指（趾）畸形-腦積水（megalencephaly-polymicrogyria-polydactylyhydrocephalus, MPPH）綜合征在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM）編號6603387，是一種罕見的常染色體顯性遺傳病[1]，分為MPPH I型、II型和III型，以腦積水、巨腦畸形、多小腦回、腦室擴大、軸后多指（趾）、癲癇發(fā)作、全面性發(fā)育遲緩伴極重度智力障礙等臨床表現(xiàn)為特點，胎兒期最常見的表現(xiàn)為腦積水，新生兒期以巨腦畸形為特點，總體臨床預后不良。MPPH由MIRAZAA等[1]在2004年首次提出，其中由PIK3R2基因突變引起的MPPH I型綜合征，截至2021年12月31日，世界范圍內(nèi)可檢索到16例完整臨床案例報 道[2-14]。目前國內(nèi)未見相關(guān)病例報道。本研究對1例智力運動發(fā)育相對落后，特殊面容和先天性腦積水的患兒進行了基因檢測，探討其遺傳學病因。

1 對象和方法

1.1 對象

1.1.1 一般情況：患兒，男，出生后不久因“頭圍增大”就診?；純合档?胎第2產(chǎn)，出生胎齡38+5周，出生體質(zhì)量3.43 kg。其母孕22周胎兒超聲提示腦積水，家屬拒絕行進一步產(chǎn)前檢查。入院查體發(fā)現(xiàn)特殊外貌，前額突出，眼距寬，耳位低，前囟 3.5 cm×4.5 cm，平坦，頭圍40 cm（＞3 SD），乳距寬，見圖1。父母表型均正常，系非近親結(jié)婚，家族中無類似患者。

圖1 先證者的臨床表型

1.1.2 隨訪：出生后第2天頭顱MRI示兩側(cè)腦室枕角少許積血伴幕上腦室輕度擴張，全腦對稱性兩側(cè)額顳枕葉多小腦回畸形；腦電圖檢查未見明顯異常。出生后19個月門診隨訪：頭圍53.4 cm（見圖1），前囟2 cm×2 cm，語言認知及運動發(fā)育相對落后，只會叫爸爸、媽媽；能獨走，不會跑跳，無癲癇發(fā)作。GESELL心理學檢查量表提示發(fā)育商77，提示邊緣狀態(tài)（76≤DQ≤85）。復查頭顱MRI提示輕度幕上腦積水，滲出腦室旁腦白質(zhì)髓鞘發(fā)育不良（見圖2）。

圖2 頭顱MRI檢查結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提?。涸谡鞯闷涓改钢橥夂?，采集先證者及其父母的外周靜脈血樣各5 mL，用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 全外顯子組測序和Sanger測序驗證：使用IDT公司xGen?Exome Research Panel v2.0捕獲探針，并用NovaSeq6000測序儀（美國Illumina公司）進行高通量測序（由北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心完成）。測序目標區(qū)域覆蓋度＞99%，20×覆蓋度達到98%，捕獲效率為0.89。最后根據(jù)二代測序的結(jié)果對候選變異位點進行Sanger測序驗證序，同時對其父母進行檢測。

1.2.3 生物信息學分析：用Mutation Taster （http://www.mutationtaster.org/）、SIFT（http://sift/bii/a-star.edu.sg/）、PolyPhen-2、PROVEAN、CADD（https://cadd.gs.washington.edu/）等軟件對變異位點的有害性進行預測。通過Clustal X-2.1將變異氨基酸與另外7個物種的氨基酸序列（來源：http://www.nci.nlm.nih.gov/homologene）進行比對，包括黑猩猩（Pan troglodytes）、家鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、狐貍（Propithecus coquereli）、駱駝（Camelus ferus）、豹（Pantherophis guttatus）、海龜（Dermochelys coriacea），以分析變異氨基酸的保守性。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）指南，評估變異的致病性。

1.2.4 蛋白模型分析：采用Swis-Pdb Viewer 4.0.1軟件構(gòu)建變異前后的蛋白空間模型，分析變異前后氨基酸相互作用力的變化（PDB，hppt://www.rscb.org/pdb/home/home.do，PDB ID:1AUT）。

2 結(jié)果

2.1 基因變異檢測結(jié)果 全外顯子檢測提示，先證者PIK3R2基因（NM-005027）存在c.1117G＞A雜合變異（見圖3A），造成PIK3R2蛋白第373位的甘氨酸替換為精氨酸。先證者父母均未檢測到相同變異（見圖3B、圖3C），提示其為新發(fā)（de novo）。該變異在國外有相關(guān)報道，但國內(nèi)尚無報道，本案例為國內(nèi)首例報道。

2.2 生物信息學分析結(jié)果 c.1117G＞A變異位于PIK3R2基因的第10號外顯子。該變異位于SH2區(qū)域（見圖4A）。PolyPhen-2軟件預測c.1117G＞A為可能致??；Mutation Taster、SIFT、CADD、PROVEAN軟件預測c.1117G＞A為致病。由PIK3R2編碼的P85β調(diào)節(jié)亞基，有4個重要的結(jié)構(gòu)域：一個Src同源3 （Sh3）結(jié)構(gòu)域和一個Rho-Gap同源區(qū)域和兩個Src同源2（Sh2）區(qū)域。c.1117G＞A變異導致的p.Gly373Arg變異位于SH2結(jié)合域（見圖4B）。用Clustal X軟件對7種同源物種（哺乳類）的氨基酸序列保守性進行比對，結(jié)果表明該位點在8個物種中高度保守（見圖5）。 根據(jù)ACMG指南，判斷該變異為致病性（PS2-Very_Strong+PS4+PM1+PM2+PP3）。

圖4 PIK3R2蛋白的結(jié)構(gòu)模型以及野生型和變異蛋白中變異位點的局部結(jié)構(gòu)

圖5 PIK3R2基因c.1117G＞A變異的進化保守性分析

2.3 蛋白模型分析 用Swiss-Pdb Viewer軟件構(gòu)建野生型與變異型蛋白的結(jié)構(gòu)模型。野生型PIK3R2蛋白Wild 373與Arg370形成一個氫鍵，維持了該區(qū)域的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，見圖4C。該位點發(fā)生變異后，Gly373Arg與PIK3CA（綠色）的370Asn之間又形成一個氫鍵，見圖4D，改變了蛋白結(jié)構(gòu)，影響PIK3R2蛋白三位結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而改變其功能和（或）活性。

3 討論

MPPH是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，國外已報道近16例由PIK3R2變異引起的MPPH I，但國內(nèi)目前未見報道；因此，含本例在內(nèi)目前共17例報道，其中最常見p.Gly373Arg變異15例；罕見變異包括p.Leu401Pro變異1例和p.Asp557His變異1例。MPPH患者臨床表現(xiàn)為巨腦畸形，多小腦回以及大腦皮層畸形，部分患者存在癲癇發(fā)作、全面發(fā)育遲緩以及智力障礙等并發(fā)癥。見表1。本例先證者因先天性腦積水就診，表現(xiàn)為特殊面容、巨腦、智力、運動及語言發(fā)育相對落后，上述表型與文獻報道相符[2-14]。 先證者PIK3R2基因存在c.1117（exon10）G＞A雜合變異，通過Mutation Taster等軟件預測為致病性。先證者父母表型正常，相應(yīng)位點未發(fā)現(xiàn)變異，符合常染色顯性遺傳的特點。

表1 包括本例在內(nèi)的17例MPPH I型患兒的臨床表型

MPPH的臨床表型和巨腦-毛細血管畸形-多小腦回綜合征（megalencephaly-capillary malformation-polymicrogyria syndrome, MCAP）非常相似。兩者是一組共同發(fā)育相關(guān)的腦發(fā)育異常綜合征[6，15]，前者主要表現(xiàn)為進行性大腦、多小腦回和多指（趾）畸形，后者主要表現(xiàn)為進行性巨腦、多小腦回、毛細血管畸形、并指和結(jié)締組織發(fā)育不良。MCAP和MPPH綜合征的大部分主要特征可分為5類：①早期過度生長；②血管異常；③遠端肢端異常；④大腦皮質(zhì)發(fā)育畸形；⑤結(jié)締組織發(fā)育不良。這兩種綜合征的巨腦畸形都相當顯著，頭部大小高達 10 SD。雖然這些綜合征的表型在很大程度上是重疊的，但可以根據(jù)軀體特征加以區(qū)分，因為與MCAP相比，MPPH缺乏皮膚血管形成、軀體過度生長、結(jié)締組織發(fā)育不良和并指等顯著軀體畸形。MCAP可與非對稱性腦過度生長（半巨腦）或身體過度生長（節(jié)段性過度生長或半肥大）有關(guān)，多數(shù)MPPH患者的大腦和身體受累呈對稱。僅報道的MPPH患者的軀體特征包括：約40%的患者出現(xiàn)軸后多指（趾）畸形，以及輕微的面部畸形特征，如突出的額頭和低鼻梁等，這些特征大多繼發(fā)于腦組織的增加。MCAP與許多出生時就出現(xiàn)的其他臨床表型有關(guān)，例如皮膚血管畸形，特別是面部和皮膚的毛細血管畸形；并指和多指；結(jié)締組織發(fā)育不良和局灶性或節(jié)段性身體過度生長；而MPPH除了軸后多指畸形（在報道的個體中約50%），目前報道的案例一致性軀體特征尚不多。由于MPPH的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性，目前沒有確定的臨床指南，診斷相對困難，因此有賴于基因檢測技術(shù)，如MPPH可能是由PIK3R2、AKT3和CCND2突變引起的；而MCAP與PIK3CA突變有關(guān)。本例患兒全外顯子檢測提示PIK3R2基因c.1117G＞A（p.Gly373Arg）錯義變異，可排除MCAP綜合征，且本案例為國內(nèi)首例報道。

PIK3R2基因位于19p13.11區(qū)，編碼由728個氨基酸組成的PIK3R2蛋白。對人、黑猩猩、牛、家屬、駱駝等多個哺乳動物物種的PIK3R2蛋白的氨基酸序列進行的比對提示，其第373位的甘氨酸高度保守。國外已有多例攜帶PIK3R2基因變異的家系報道，其常見的PIK3R2變異位點包括p.Asp557His、p.Gly373Arg和p.Leu401Pro。本例發(fā)現(xiàn)的變異位點c.1117G＞A（p.Gly373Arg）最為常見。

既往文獻報道，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-AKT-mTOR通路（mTOR-通路）[16-17]中的基因變異會導致廣泛的大腦和身體發(fā)育障礙。MPPH和MCAP的發(fā)病均與該通路的過度活化導致過度生長障礙有關(guān)，故兩者的臨床表現(xiàn)巨腦存在顯著的重疊。PIK3R2基因位于19號染色體，編碼IA類PI3K的P85β調(diào)節(jié)亞單位[18]，是mTOR途徑的上游組成部分[19]。PI3K是獨特且高度保守的細胞內(nèi)脂質(zhì)激酶家族的成員[20]， 可磷酸化磷脂酰肌醇和磷酸肌醇的3’-羥基，該反應(yīng)導致許多錯綜復雜的細胞內(nèi)信號通路的激活，包括PI3K-AKT-mTOR通路[21]，在細胞的增殖、生長、新陳代謝、遷移和分泌中起著重要作用。P85β調(diào)節(jié)亞基通過調(diào)節(jié)催化亞基的穩(wěn)定性、構(gòu)象和定位來調(diào)節(jié)PI3K的活性[22]。P85β調(diào)節(jié)亞基由一個Src同源3（Sh3）結(jié)構(gòu)域和一個Rho-Gap同源區(qū)域和兩個Src同源2（Sh2）區(qū)組成，這兩個區(qū)域通過一個稱為SH2間區(qū)（i-sh2）的螺旋線圈區(qū)域相連，以介導P85β調(diào)節(jié)亞基與催化亞基的結(jié)合[12，14，19]。其中Sh2結(jié)構(gòu)域是一個約100個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，作為細胞內(nèi)信號級聯(lián)的調(diào)節(jié)模塊，通過與含有磷酸酪氨酸的靶肽在序列特異性中的高親和力相互作用，識別磷酸化酪氨酸的3～6個殘基C末端，并嚴格依賴于磷酸化方式。有研究[11]成功建立了人類最常見的PIK3R2變異p.G373R（小鼠p.G367R）小鼠模型。這些小鼠中，顯示PI3K-AKT-mTOR通路被過度激活和腦過度生長，小鼠出現(xiàn)的巨腦和腦電變化都與人類表型重疊。證實了PI3K復合體的變異與廣泛的腦和器官過度生長綜合征有關(guān)，促進細胞生長可能是通過蛋白質(zhì)S6磷酸化增加介導的蛋白質(zhì)合成增加所致。PIK3R2變異誘導的mTOR-通路激活，導致大腦細胞增大，是臨床表型相關(guān)巨腦最可能的機制。本案例先證者的p.Gly373Arg變異位于SH2結(jié)構(gòu)域，導致帶中性電荷的甘氨酸被帶正電荷的精氨酸取代后，蛋白質(zhì)的局部理化性質(zhì)可能會發(fā)生變化。另外變異后形成新的氫鍵，結(jié)構(gòu)的改變可能會進一步導致蛋白質(zhì)功能的變化。同時該患兒存在語言認知發(fā)育及運動相對落后，但無癲癇發(fā)作，無軸后多指等畸形，與既往文獻報道表型存在異質(zhì)性，考慮如下：①不同的基因變異導致不同的表型，如本例PIK3R2致病變異位于SH2-1結(jié)構(gòu)域，而既往文獻報道的部分病例位于SH3結(jié)構(gòu)域附近。②基因的功能受到多種因素的影響，包括翻譯后修飾、基因-基因相互作用、環(huán)境等。③另外，目前該基因變異以國外報道為主，推測可能存在不同種族基因表型共分離。因此，同一基因的變異可能會導致不同個體的不同結(jié)果。綜上，PIK3R2基因第10外顯子c.1117G＞A（p.Gly373Arg）雜合變異可能是本例患者罹患MPPH的原因，其確切的致病機制仍需進一步的基因表達和功能實驗加以驗證。