孔鴻儒，俞浩輝，陳格爾，陳咨苗，戴勝杰，孫學(xué)成，金約朋，楊文軍，孫洪偉

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院（信息與工程學(xué)院），浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325015

盡管近年來(lái)重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）的療效有所提高，但病死率高、住院時(shí)間長(zhǎng)、并發(fā)癥多、醫(yī)療費(fèi)用高昂等治療現(xiàn)狀仍未見(jiàn)顯著改觀[1]。作為一種非惡性腫瘤性疾病，10%～20%的病死率仍難以接受。SAP患者的臨床表現(xiàn)一般為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory reaction syndrom, SIRS），而SIRS產(chǎn)生的炎癥因子會(huì)攻擊富血供的靶器官，隨之產(chǎn)生多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），而MODS是SAP最主要的直接死 因[2]。單核-巨噬細(xì)胞是參與SAP病理生理過(guò)程中的主要炎癥細(xì)胞之一[3]，急性胰腺炎炎癥反應(yīng)初期，單核-巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在黏附分子作用下，從血液遷移至胰腺間質(zhì)，單核細(xì)胞趨化因子蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inammatory protein 1α, MIP-1α）、CC類(lèi)趨化因子-5（CC chemokine ligand-5, CCL5）參與活化單核細(xì)胞，隨之這些浸潤(rùn)細(xì)胞參與產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使胰腺局部炎癥加重，而炎癥因子進(jìn)入血液影響其他器官如肺、肝臟、脾等。因此，抑制巨噬細(xì)胞活性，可以從SAP-SIRS發(fā)生的源頭上阻斷此炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)治療急性胰腺炎具有 重要的價(jià)值。顆粒酶（granzyme）是一種絲氨酸蛋白酶，存在于細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的胞漿內(nèi)。凋亡過(guò)程中，顆粒酶和穿孔素（pore-forming protein, PFP）釋放到靶細(xì)胞附近，在PFP作用下顆粒酶進(jìn)入靶器官，誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase8）活化，激活RIP1參與的細(xì)胞凋亡[5]?；陬w粒酶B（granzyme B, GRB）有效的凋亡誘導(dǎo)作用，本研究旨在探索GRB-PFP是否能有效影響巨噬細(xì)胞活性，減輕胰腺炎模型的炎癥反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人單核巨噬細(xì)胞系（TPH-1）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Cell Counting Kit-8和凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Bestar SYBR GreenRT-PCR Master Mix購(gòu)自日本Toyobo公司；RQ1 Dnase購(gòu)自美國(guó)普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；TruSeq鏈總RNA LT樣品制備試劑盒購(gòu)自美國(guó)Illumina公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、PFP和GRB購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 篩選TNF-α和TNF-α+PFP+GRB的最適濃度：鑒于在急性炎癥早期，TNF-α是參與炎癥的主要炎性細(xì)胞因子之一，故采用TNF-α刺激巨噬細(xì)胞，模擬急性胰腺炎時(shí)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。設(shè)置濃度梯度并開(kāi)展細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，濃度梯度和作用時(shí)間具體為：0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 mg/L GRB 10 μL；0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 μg/mL GRB 5 μL； 0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 μg/mL GRB 2.5 μL； 20 ng/mL TNF-α 10 μL；20 ng/mL TNF-α 10 μL+ 0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 mg/L GRB 10 μL；20 ng/mL TNF-α 10 μL+0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 mg/L GRB 5 μL；20 ng/mL TNF-α 10 μL+0.1 mg/L PFP 25 μL+ 0.1 mg/L GRB 2.5 μL。接種1 000個(gè)細(xì)胞至96孔板，每孔加100 μL培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 h，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度。

1.2.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞分為NC組、TNF-α組、PFP+GRB組、TNF-α+PFP+GRB組4組，采用Annexin V異硫氰酸熒光素（FITC）凋亡檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在37 ℃下處理48 h后，收獲細(xì)胞（2×105），用PBS洗滌2次，并與Annexin V FITC和碘化丙啶在室溫黑暗中孵育10 min。 然后使用MoFLO XDP流式細(xì)胞儀和Cell Quest 3.3軟件檢測(cè)和分析染色細(xì)胞。

1.2.3 RNA提取及文庫(kù)制備：細(xì)胞樣本分為3組：正常細(xì)胞組（NC組）、TNF-α刺激組（Treat1組）和TNF-α+PFP+GRB 10 μL刺激組（Treat2組），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用TruSeq鏈總RNA LT樣品制備試劑盒得到純化的mRNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過(guò)QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序策略為PE150。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：樣本間相關(guān)性分析：以每個(gè)樣本中所有基因的表達(dá)量為變量，用Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算每個(gè)樣本之間的相關(guān)性。差異基因分析：采用R軟件包DESeq2對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行差異基因分析。顯著差異基因的篩選閾值為FDR＜0.01且fold change＞2；富集分析：將分析所得的差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析功能富集。

1.2.5 qRT-PCR：使用ReverTra Ace qPCR RT Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)部分基因的表達(dá)水平，設(shè)計(jì)的引物見(jiàn)表1。qRT-PCR在Bio-Rad S1000上使用Bestar SYBR GreenRT-PCR Master Mix進(jìn)行。PCR條件包括：95 ℃變性1 min，95 ℃變性15 s，40個(gè)循環(huán)，然后60 ℃退火和延伸30 s。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)，并將參考基因Actin歸一化。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的PCR擴(kuò)增。

表1 驗(yàn)證基因PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS.21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定TNF-α、PFP、GRB的最適濃度 根據(jù)設(shè)置的濃度梯度并開(kāi)展細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示各組細(xì)胞活性沒(méi)有明顯差異（見(jiàn)圖1），由此確定20 ng/mL TNF-α，0.1 mg/L PFP 25 μL，0.1 mg/L GRB 10 μL作為最適濃度并開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 CCK8 48 h各濃度梯度下細(xì)胞活性變化

2.2 細(xì)胞凋亡比例比較 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α+PFP+GRB組細(xì)胞的凋亡比例與NC組、TNF-α組、PFP+GRB組相比顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 4組細(xì)胞凋亡比例比較

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本間相關(guān)性分析 每組組內(nèi)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性都非常高（r＞0.90），尤其是Treat組（r≥0.99）），說(shuō)明本研究重復(fù)性較好。NC組與Treat組的相關(guān)性相對(duì)較低，而Treat1組和Treat2組間的相關(guān)性較高，見(jiàn)圖3。說(shuō)明NC與Treat組在轉(zhuǎn)錄組整體水平上存在差別。

圖3 樣本聚類(lèi)圖

2.4 差異基因分析 從差異基因的數(shù)目可以看出：NC組與Treat1組、Treat2組的差異比較大，顯著差異基因較多，而Treat1組與Treat2組的顯著差異基因較少，表明Treat1組與Treat2組之間轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的差異不明顯，見(jiàn)圖4。

圖4 差異基因分析圖

另外將Treat1組、Treat2組與NC組比較的差異基因上下調(diào)分別做Venn圖，結(jié)果顯示，Treat1組與Treat2組相對(duì)于NC組的上調(diào)基因絕大部分都是相同的（見(jiàn)圖5）。而下調(diào)基因中Treat2組有更多的特異性下調(diào)基因。總體可以判斷，相比于Treat1組和NC組的變化，Treat2組相對(duì)于NC組的變化更大。

圖5 Treat1組、Treat2組與NC組比較的差異基因的Venn圖

2.5 富集分析 GO分析和KEGG分析功能富集，結(jié)果表明，從Treat2組與Treat1組分別相對(duì)于NC組的差異基因富集KEGG通路來(lái)看，富集到的顯著KEGG通路都非常相似，最顯著富集的通路均為“Cytokinecytokine receptor interaction”（見(jiàn)圖6、圖7）。

圖6 Treat1相對(duì)于NC組差異基因的GO富集結(jié)果柱狀圖及KEGG富集結(jié)果柱狀圖

圖7 Treat2相對(duì)于NC組差異基因的GO富集結(jié)果柱狀圖及KEGG富集結(jié)果柱狀圖

2.6 炎癥相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)圖 我們將“Cytokinecytokine receptor interaction”通路在Treat1vs.NC與Treat2vs.NC中的顯著差異基因提取出來(lái)，取交集，得到45個(gè)顯著差異基因，為了更進(jìn)一步研究這些基因的互作關(guān)系，將這些基因用String數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到以下的互作網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖8）。

圖8 差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性 從45個(gè)差異基因中挑選7個(gè)差異基因（RAB37、GPA33、USH1C、SYTL1、MSRB3、GPER1和CD1B）進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致（見(jiàn)圖9）。

圖9 差異基因?qū)崟r(shí)熒光PCR表達(dá)結(jié)果

3 討論

在胰腺炎發(fā)生初期，胰腺腺泡細(xì)胞損傷，從而釋放炎癥因子，巨噬細(xì)胞是最早產(chǎn)生應(yīng)答的免疫細(xì)胞之一[6]。巨噬細(xì)胞激活后分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子又進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞，觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而產(chǎn)生的大量炎癥因子隨循環(huán)系統(tǒng)攻擊如肺、腎、腸之類(lèi)的遠(yuǎn)處器官，引起SIRS和MODS，嚴(yán)重時(shí)可引起多臟器功能衰竭。SHIFRIN等[7]建立的胰腺炎模型，采用藥物消耗巨噬細(xì)胞，胰腺炎小鼠的存活率明顯升高，說(shuō)明了巨噬細(xì)胞參與了胰腺炎時(shí)炎癥加重的環(huán)節(jié)。此外，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為胰腺炎的發(fā)生是由于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的胰蛋白酶原異常激活[8]，但有研究表明，在胰腺炎產(chǎn)生免疫應(yīng)答過(guò)程中，有一部分胰蛋白酶原在巨噬細(xì)胞內(nèi)激活[9]，從而進(jìn)一步加重急性胰腺炎病情[10]。這也進(jìn)一步說(shuō)明了巨噬細(xì)胞在胰腺炎病理生理過(guò)程中的作用。

Caspase是一類(lèi)半含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用[11]。Caspase-8是該家族的成員之一，可以作為凋亡始動(dòng)子參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，Procaspase-8可以自我活化，也可以在GRB的剪切作用下活化。GRB可活化各種Procaspase（如Pro-caspase-3、Pro-caspase-7、Pro-caspase-8、Pro-caspase-9、Pro-caspase-10），從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生[12]。

本研究顯示，相比于其他各組，在TNF-α+PFP+ GRB的共同作用下，巨噬細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡比例明顯升高，提示在TNF-α的誘導(dǎo)下，PFP+GRB可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，而并非PFP+GRB自身的藥物作用。發(fā)生急性胰腺炎后，胰蛋白酶原激活，胰腺局部發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，一旦細(xì)胞發(fā)生壞死，細(xì)胞內(nèi)炎癥因子釋放而激活全身炎癥系統(tǒng)，從而誘發(fā)SAP及SIRS。若細(xì)胞僅發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞體積變小但細(xì)胞膜完整，胞內(nèi)成分不外擴(kuò)，引起的胰腺炎病變較輕，也不會(huì)激活SIRS反應(yīng)。BHATIA等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞內(nèi)成分釋放明顯減少，周?chē)装Y反應(yīng)明顯減輕。CAO等[19]也證實(shí)在胰腺炎發(fā)生初期，主動(dòng)誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞及炎癥細(xì)胞凋亡，能夠有效減輕急性胰腺炎的嚴(yán)重程度。ORABI等[20]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腺泡細(xì)胞及炎癥細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，胰腺炎癥相對(duì)較輕，因此若誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而非壞死，可能可以減輕急性胰腺炎的嚴(yán)重程度。

此外，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，將NC組、Treat1組和Treat2組的表達(dá)基因進(jìn)行對(duì)比，差異基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路。這個(gè)通路參與機(jī)體防御、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞死亡、血管生成以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等[13]。細(xì)胞因子幾乎參與了機(jī)體所有的生理病理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，從這個(gè)通路中我們可以看到實(shí)驗(yàn)組對(duì)炎癥有顯著的應(yīng)激反應(yīng)，諸如，MsrB3對(duì)細(xì)胞增殖有重要作用，MsrB3缺乏會(huì)引起細(xì)胞通過(guò)p53和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)生凋亡，而過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖[14-15]； RAB37是Ras小GTP酶家族成員，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和囊泡運(yùn)輸[16]。近期研究發(fā)現(xiàn)，RAB37直接與自噬相關(guān)基因5結(jié)合，從而誘導(dǎo)自噬[17]。細(xì)胞因子及其受體是機(jī)體信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分，急性胰腺炎時(shí)，胰腺腺泡細(xì)胞壞死，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子，加重胰腺局部和全身炎癥反 應(yīng)[21-22]。因此，下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，可以從源頭上遏止炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，從而減輕全身炎癥反應(yīng)綜合征。

本研究也有一些不足之處，并未對(duì)差異基因進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步探究其潛在機(jī)制，從分子層面明確各細(xì)胞因子對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。另外，關(guān)于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的類(lèi)型，也有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，GRB-PFP可選擇性誘導(dǎo)胰腺炎時(shí)巨噬細(xì)胞凋亡，并下調(diào)細(xì)胞因子及其受體。通過(guò)主動(dòng)改變細(xì)胞死亡方式，減輕炎癥介質(zhì)釋放，源頭及發(fā)展過(guò)程上打斷此炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為急性胰腺炎臨床治療上提供了新思路。