孔鴻儒，俞浩輝，陳格爾，陳咨苗，戴勝杰，孫學成，金約朋，楊文軍，孫洪偉

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院（信息與工程學院），浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 內分泌科，浙江 溫州 325015；4.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 消化內科，浙江 溫州 325015

盡管近年來重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）的療效有所提高，但病死率高、住院時間長、并發(fā)癥多、醫(yī)療費用高昂等治療現狀仍未見顯著改觀[1]。作為一種非惡性腫瘤性疾病，10%～20%的病死率仍難以接受。SAP患者的臨床表現一般為系統(tǒng)性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory reaction syndrom, SIRS），而SIRS產生的炎癥因子會攻擊富血供的靶器官，隨之產生多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），而MODS是SAP最主要的直接死 因[2]。單核-巨噬細胞是參與SAP病理生理過程中的主要炎癥細胞之一[3]，急性胰腺炎炎癥反應初期，單核-巨噬細胞和中性粒細胞在黏附分子作用下，從血液遷移至胰腺間質，單核細胞趨化因子蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inammatory protein 1α, MIP-1α）、CC類趨化因子-5（CC chemokine ligand-5, CCL5）參與活化單核細胞，隨之這些浸潤細胞參與產生不同的細胞因子和炎癥介質，產生級聯(lián)反應，致使胰腺局部炎癥加重，而炎癥因子進入血液影響其他器官如肺、肝臟、脾等。因此，抑制巨噬細胞活性，可以從SAP-SIRS發(fā)生的源頭上阻斷此炎癥級聯(lián)反應，對治療急性胰腺炎具有 重要的價值。顆粒酶（granzyme）是一種絲氨酸蛋白酶，存在于細胞毒淋巴細胞和自然殺傷細胞的胞漿內。凋亡過程中，顆粒酶和穿孔素（pore-forming protein, PFP）釋放到靶細胞附近，在PFP作用下顆粒酶進入靶器官，誘導含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase8）活化，激活RIP1參與的細胞凋亡[5]。基于顆粒酶B（granzyme B, GRB）有效的凋亡誘導作用，本研究旨在探索GRB-PFP是否能有效影響巨噬細胞活性，減輕胰腺炎模型的炎癥反應。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人單核巨噬細胞系（TPH-1）購于中國科學院上海細胞所。DMEM購自美國Hyclone公司；FBS購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8和凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒和Bestar SYBR GreenRT-PCR Master Mix購自日本Toyobo公司；RQ1 Dnase購自美國普洛麥格（北京）生物技術有限公司；TruSeq鏈總RNA LT樣品制備試劑盒購自美國Illumina公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、PFP和GRB購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 篩選TNF-α和TNF-α+PFP+GRB的最適濃度：鑒于在急性炎癥早期，TNF-α是參與炎癥的主要炎性細胞因子之一，故采用TNF-α刺激巨噬細胞，模擬急性胰腺炎時巨噬細胞炎癥反應。設置濃度梯度并開展細胞增殖實驗進行篩選，濃度梯度和作用時間具體為：0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 mg/L GRB 10 μL；0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 μg/mL GRB 5 μL； 0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 μg/mL GRB 2.5 μL； 20 ng/mL TNF-α 10 μL；20 ng/mL TNF-α 10 μL+ 0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 mg/L GRB 10 μL；20 ng/mL TNF-α 10 μL+0.1 mg/L PFP 25 μL+0.1 mg/L GRB 5 μL；20 ng/mL TNF-α 10 μL+0.1 mg/L PFP 25 μL+ 0.1 mg/L GRB 2.5 μL。接種1 000個細胞至96孔板，每孔加100 μL培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相應量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育0.5 h，用酶標儀在450 nm測定吸光度。

1.2.2 細胞凋亡實驗：將細胞分為NC組、TNF-α組、PFP+GRB組、TNF-α+PFP+GRB組4組，采用Annexin V異硫氰酸熒光素（FITC）凋亡檢測試劑盒通過流式細胞術檢測細胞凋亡。在37 ℃下處理48 h后，收獲細胞（2×105），用PBS洗滌2次，并與Annexin V FITC和碘化丙啶在室溫黑暗中孵育10 min。 然后使用MoFLO XDP流式細胞儀和Cell Quest 3.3軟件檢測和分析染色細胞。

1.2.3 RNA提取及文庫制備：細胞樣本分為3組：正常細胞組（NC組）、TNF-α刺激組（Treat1組）和TNF-α+PFP+GRB 10 μL刺激組（Treat2組），每組實驗重復3次。使用TruSeq鏈總RNA LT樣品制備試劑盒得到純化的mRNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈，經過QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA再進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理，然后經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作。構建好的文庫用Illumina平臺進行測序，測序策略為PE150。

1.2.4 轉錄組學分析：樣本間相關性分析：以每個樣本中所有基因的表達量為變量，用Pearson相關系數計算每個樣本之間的相關性。差異基因分析：采用R軟件包DESeq2對各組細胞進行差異基因分析。顯著差異基因的篩選閾值為FDR＜0.01且fold change＞2；富集分析：將分析所得的差異基因進行GO分析和KEGG分析功能富集。

1.2.5 qRT-PCR：使用ReverTra Ace qPCR RT Kit進行反轉錄反應。通過qRT-PCR檢測部分基因的表達水平，設計的引物見表1。qRT-PCR在Bio-Rad S1000上使用Bestar SYBR GreenRT-PCR Master Mix進行。PCR條件包括：95 ℃變性1 min，95 ℃變性15 s，40個循環(huán)，然后60 ℃退火和延伸30 s。使用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達，并將參考基因Actin歸一化。每個樣品進行3個重復的PCR擴增。

表1 驗證基因PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS.21軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 確定TNF-α、PFP、GRB的最適濃度 根據設置的濃度梯度并開展細胞增殖實驗，結果顯示各組細胞活性沒有明顯差異（見圖1），由此確定20 ng/mL TNF-α，0.1 mg/L PFP 25 μL，0.1 mg/L GRB 10 μL作為最適濃度并開展后續(xù)實驗。

圖1 CCK8 48 h各濃度梯度下細胞活性變化

2.2 細胞凋亡比例比較 流式細胞實驗結果顯示，TNF-α+PFP+GRB組細胞的凋亡比例與NC組、TNF-α組、PFP+GRB組相比顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 4組細胞凋亡比例比較

2.3 轉錄組數據樣本間相關性分析 每組組內3次重復實驗結果的相關性都非常高（r＞0.90），尤其是Treat組（r≥0.99）），說明本研究重復性較好。NC組與Treat組的相關性相對較低，而Treat1組和Treat2組間的相關性較高，見圖3。說明NC與Treat組在轉錄組整體水平上存在差別。

圖3 樣本聚類圖

2.4 差異基因分析 從差異基因的數目可以看出：NC組與Treat1組、Treat2組的差異比較大，顯著差異基因較多，而Treat1組與Treat2組的顯著差異基因較少，表明Treat1組與Treat2組之間轉錄表達水平的差異不明顯，見圖4。

圖4 差異基因分析圖

另外將Treat1組、Treat2組與NC組比較的差異基因上下調分別做Venn圖，結果顯示，Treat1組與Treat2組相對于NC組的上調基因絕大部分都是相同的（見圖5）。而下調基因中Treat2組有更多的特異性下調基因。總體可以判斷，相比于Treat1組和NC組的變化，Treat2組相對于NC組的變化更大。

圖5 Treat1組、Treat2組與NC組比較的差異基因的Venn圖

2.5 富集分析 GO分析和KEGG分析功能富集，結果表明，從Treat2組與Treat1組分別相對于NC組的差異基因富集KEGG通路來看，富集到的顯著KEGG通路都非常相似，最顯著富集的通路均為“Cytokinecytokine receptor interaction”（見圖6、圖7）。

圖6 Treat1相對于NC組差異基因的GO富集結果柱狀圖及KEGG富集結果柱狀圖

圖7 Treat2相對于NC組差異基因的GO富集結果柱狀圖及KEGG富集結果柱狀圖

2.6 炎癥相關基因網絡圖 我們將“Cytokinecytokine receptor interaction”通路在Treat1vs.NC與Treat2vs.NC中的顯著差異基因提取出來，取交集，得到45個顯著差異基因，為了更進一步研究這些基因的互作關系，將這些基因用String數據庫分析得到以下的互作網絡圖（見圖8）。

圖8 差異基因互作網絡圖

2.7 qRT-PCR驗證轉錄組學分析結果的準確性 從45個差異基因中挑選7個差異基因（RAB37、GPA33、USH1C、SYTL1、MSRB3、GPER1和CD1B）進行qRT-PCR實驗，其結果和轉錄組學結果一致（見圖9）。

圖9 差異基因實時熒光PCR表達結果

3 討論

在胰腺炎發(fā)生初期，胰腺腺泡細胞損傷，從而釋放炎癥因子，巨噬細胞是最早產生應答的免疫細胞之一[6]。巨噬細胞激活后分泌產生細胞因子又進一步激活免疫細胞，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，而產生的大量炎癥因子隨循環(huán)系統(tǒng)攻擊如肺、腎、腸之類的遠處器官，引起SIRS和MODS，嚴重時可引起多臟器功能衰竭。SHIFRIN等[7]建立的胰腺炎模型，采用藥物消耗巨噬細胞，胰腺炎小鼠的存活率明顯升高，說明了巨噬細胞參與了胰腺炎時炎癥加重的環(huán)節(jié)。此外，傳統(tǒng)觀點認為胰腺炎的發(fā)生是由于胰腺腺泡細胞內的胰蛋白酶原異常激活[8]，但有研究表明，在胰腺炎產生免疫應答過程中，有一部分胰蛋白酶原在巨噬細胞內激活[9]，從而進一步加重急性胰腺炎病情[10]。這也進一步說明了巨噬細胞在胰腺炎病理生理過程中的作用。

Caspase是一類半含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細胞凋亡的過程中起著關鍵性作用[11]。Caspase-8是該家族的成員之一，可以作為凋亡始動子參與細胞凋亡過程，Procaspase-8可以自我活化，也可以在GRB的剪切作用下活化。GRB可活化各種Procaspase（如Pro-caspase-3、Pro-caspase-7、Pro-caspase-8、Pro-caspase-9、Pro-caspase-10），從而促進凋亡的發(fā)生[12]。

本研究顯示，相比于其他各組，在TNF-α+PFP+ GRB的共同作用下，巨噬細胞活性明顯降低，細胞凋亡比例明顯升高，提示在TNF-α的誘導下，PFP+GRB可以誘導巨噬細胞凋亡，而并非PFP+GRB自身的藥物作用。發(fā)生急性胰腺炎后，胰蛋白酶原激活，胰腺局部發(fā)生強烈的炎癥反應，一旦細胞發(fā)生壞死，細胞內炎癥因子釋放而激活全身炎癥系統(tǒng)，從而誘發(fā)SAP及SIRS。若細胞僅發(fā)生凋亡時，細胞體積變小但細胞膜完整，胞內成分不外擴，引起的胰腺炎病變較輕，也不會激活SIRS反應。BHATIA等[18]通過實驗證實，誘導細胞發(fā)生凋亡時細胞內成分釋放明顯減少，周圍炎癥反應明顯減輕。CAO等[19]也證實在胰腺炎發(fā)生初期，主動誘導胰腺腺泡細胞及炎癥細胞凋亡，能夠有效減輕急性胰腺炎的嚴重程度。ORABI等[20]發(fā)現，當腺泡細胞及炎癥細胞發(fā)生凋亡時，胰腺炎癥相對較輕，因此若誘導細胞凋亡，而非壞死，可能可以減輕急性胰腺炎的嚴重程度。

此外，通過高通量轉錄組測序技術，將NC組、Treat1組和Treat2組的表達基因進行對比，差異基因主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路。這個通路參與機體防御、細胞生長和分化、細胞死亡、血管生成以及維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)等[13]。細胞因子幾乎參與了機體所有的生理病理過程。本研究發(fā)現，從這個通路中我們可以看到實驗組對炎癥有顯著的應激反應，諸如，MsrB3對細胞增殖有重要作用，MsrB3缺乏會引起細胞通過p53和內質網應激途徑發(fā)生凋亡，而過表達會促進細胞的增殖[14-15]； RAB37是Ras小GTP酶家族成員，負責細胞內信號轉導和囊泡運輸[16]。近期研究發(fā)現，RAB37直接與自噬相關基因5結合，從而誘導自噬[17]。細胞因子及其受體是機體信號傳導的重要組成部分，急性胰腺炎時，胰腺腺泡細胞壞死，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子，加重胰腺局部和全身炎癥反 應[21-22]。因此，下調細胞因子表達，可以從源頭上遏止炎癥反應進一步加重，從而減輕全身炎癥反應綜合征。

本研究也有一些不足之處，并未對差異基因進行調控，進一步探究其潛在機制，從分子層面明確各細胞因子對炎癥反應的影響。另外，關于誘導巨噬細胞凋亡的類型，也有待進一步實驗研究。

綜上所述，GRB-PFP可選擇性誘導胰腺炎時巨噬細胞凋亡，并下調細胞因子及其受體。通過主動改變細胞死亡方式，減輕炎癥介質釋放，源頭及發(fā)展過程上打斷此炎癥級聯(lián)反應，為急性胰腺炎臨床治療上提供了新思路。