◎ 蔡海華，梁培榮，姚澤平，林騰奕

（廣東省食品檢驗(yàn)所（廣東省酒類檢測中心），廣東 廣州 510435）

黃曲霉毒素是人們生活中常見的食品污染物之一，結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘臨酮，具有極強(qiáng)的致癌、致畸及肝毒性[1]，是已知的化學(xué)物質(zhì)中最具致癌性的一種，極大地危害了人體健康。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織癌癥研究總署劃定為Ⅰ類致癌物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高溫高壓也很難破壞，日常烹飪幾乎無損其毒性。黃曲霉毒素是花生油中最常見的污染物之一，其中尤以黃曲霉毒素B1（AFB1）污染最為普遍。花生油是我國大部分居民的主要食用油，因此花生油的質(zhì)量安全與人們的身體健康息息相關(guān)。我國南方盛產(chǎn)花生，但是氣候潮濕溫暖，這為黃曲霉的產(chǎn)毒菌株?duì)I造了一個(gè)非常有利的生長和繁殖環(huán)境。在監(jiān)督抽檢過程中發(fā)現(xiàn)，許多小作坊生產(chǎn)的花生油AFB1嚴(yán)重超標(biāo)[2]。因此需要研究出一種準(zhǔn)確快速簡便的AFB1含量檢測方法用于批量檢測樣品。

為提升本實(shí)驗(yàn)室的檢測能力，2022年本實(shí)驗(yàn)室參加了中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心實(shí)施的花生油中的黃曲霉毒素B1測定能力驗(yàn)證計(jì)劃（ACASPT1499（2022））。以中檢院所發(fā)樣品為考核樣品，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）中的第三法[3]，采用筆者優(yōu)化過后的前處理方法對考核樣品進(jìn)行檢測，通過加標(biāo)的手段測定回收率來評價(jià)方法的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

花生油（22-N213、22-O509），來自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心；2.04 μg·mL-1黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（ROMER）。

1.1.2 試劑與耗材

甲醇（色譜級，默克化工技術(shù)（上海）有限公司）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（ROMER）。

1.1.3 儀器

電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；漩渦混合器（IKA）；冷凍離心機(jī)（Thermo）；高效液相色譜儀（日本島津公司）；C18色譜柱（Thermo）；光化學(xué)衍生器（華安麥科）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

將放至室溫的樣品搖勻，準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.000 1 g）至離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 70%甲醇水溶液，置于渦旋振蕩器中振蕩20 min，取出，在8 000 r·min-1下離心5 min，準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入25 mL超純水，混勻。

1.2.2 樣品純化

使混勻樣液以3.0 mL·min-1的速度通過免疫親和柱，用10 mL水淋洗親和柱，并以真空泵抽干，后準(zhǔn)確加入2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液定容至2 mL。另一組樣品則按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）第三法，用2 mL甲醇淋洗免疫親和柱，收集洗脫液，50 ℃氮吹至干，用1 mL流動相復(fù)溶，樣液過0.2 μm濾膜，待測[4]。

1.2.3 加標(biāo)樣品的處理

稱取樣品1 g（精確至0.000 1 g），準(zhǔn)確加入0.050 mL 0.100 μg·mL-1的黃曲霉毒素 B1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，后同樣品一起進(jìn)行前處理操作，上機(jī)檢測計(jì)算回收率。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制成100 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用甲醇將其稀釋成0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.4 液相色譜條件

流動相為甲醇水溶液（35+65），激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)品選擇合適的線性系列，使待測濃度盡可能分布于曲線的中間位置，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將曲線范圍選擇在0.1～20.0 ng·mL-1，線性方程為y=3 806.1x-310.03，R2=0.999 9，說明線性良好，見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果

由表1和表2可知，能力驗(yàn)證樣品按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測得樣品22-N213和樣品22-O509的結(jié)果分別為 5.26 μg·kg-1和 8.26 μg·kg-1，與測試評價(jià)中心的指定值比較，Z比分?jǐn)?shù)為-0.6和0.1；按照筆者優(yōu)化后的方法檢測得出結(jié)果分別為 5.89 μg·kg-1和 8.15 μg·kg-1，與測試評價(jià)中心的指定值比較，Z比分?jǐn)?shù)為0.4和0，結(jié)果均滿意。

表1 按照國標(biāo)前處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)果表

表2 按照優(yōu)化后的前處理方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)果表

3 實(shí)驗(yàn)分析

3.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.35—2016）第三法可知，其以甲醇乙腈水溶液為有機(jī)相。經(jīng)方法驗(yàn)證，用水和甲醇按65∶35的比例作為流動相，也可以較好地分離 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG1。故從低毒性以及經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，筆者采用甲醇水溶液作為有機(jī)相。又因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶劑的選擇應(yīng)盡可能與流動相一致，以達(dá)到降低溶劑效應(yīng)的目的，故在配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線過程中，將稀釋溶劑改成甲醇。在進(jìn)行前處理優(yōu)化后，黃曲霉毒素B1的檢測過程可以完全去除乙腈，避免實(shí)驗(yàn)員接觸乙腈，降低了實(shí)驗(yàn)過程的毒性風(fēng)險(xiǎn)。

在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.35—2016）第三法中，純化過程使用2 mL甲醇淋洗免疫親和柱并收集洗脫液，在50 ℃下氮吹近干，后用1 mL流動相復(fù)溶。筆者將流動相改成甲醇水溶液后，純化步驟改為直接用2 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并定容至2 mL。做此調(diào)整，可省去氮吹步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，又因流動相換成甲醇水溶液，故用甲醇復(fù)溶也達(dá)到降低溶劑效應(yīng)的目的，見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上濃度點(diǎn)為2 μg·mL-1的色譜圖

3.2 實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證情況

關(guān)于本次實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證的完成情況見表1和表2，能力驗(yàn)證以Z比分?jǐn)?shù)評價(jià)該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Z比分?jǐn)?shù)為負(fù)代表測定結(jié)果與中位值相比偏小，Z比分?jǐn)?shù)為正則代表測定結(jié)果與中位值相比偏大，當(dāng)|Z|≤2時(shí)，表示結(jié)果滿意[5]。由表1和表2可知，兩個(gè)樣品用兩種不同凈化方式得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果|Z|均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2，表明該次能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了筆者優(yōu)化的前處理方法，提高了實(shí)驗(yàn)室檢測黃曲霉毒素B1的檢測效率。

3.3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

黃曲霉毒素B1對紫外光敏感，因此在進(jìn)行前處理的過程中，應(yīng)盡量避光，配制工作曲線時(shí)應(yīng)使用棕色玻璃器皿，避免環(huán)境因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，次氯酸、檸檬酸、高氯酸等強(qiáng)酸、強(qiáng)堿對黃曲霉毒素B1有明顯的破壞作用[4]，所以在檢測過程中應(yīng)遠(yuǎn)離上述試劑。黃曲霉毒素B1作為一種極強(qiáng)的致癌、致畸性毒素，在實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)員切記要做好防護(hù)措施。在實(shí)驗(yàn)完畢以后，所有實(shí)驗(yàn)用過的器皿均應(yīng)該使用5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min以上，使黃曲霉毒素B1分解成無毒的鹽，避免造成二次污染。

4 結(jié)論

對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.35—2016）第三法的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，選擇甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。選擇2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，并收集洗脫液直接定容到2 mL，過0.2 μm濾膜上機(jī)待測，得到加標(biāo)回收率為99.3%、105.2%。并將該優(yōu)化方法應(yīng)用到2022年花生油中黃曲霉毒素B1測定能力驗(yàn)證，得出兩個(gè)樣品的測定結(jié)果值|Z|遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2。由此可得，該方法準(zhǔn)確、簡便快捷，能夠明顯縮短檢測時(shí)間，可應(yīng)用到植物油中黃曲霉毒素B1的批量檢測中。