劉 靜，田桂艷，曹文燕，郝培霞，李 慧，白曉玲，張 會

保定蒙牛飲料有限公司，河北保定 072450

0 引言

隨著人們生活水平的提高，對營養(yǎng)的需求更加多元化，乳制品的種類也越來越豐富，發(fā)酵型酸奶以其優(yōu)良的口感和更容易被吸收的特性深受人們喜愛[1]。通過檢驗、更快地篩選出適合發(fā)酵的牛奶以縮短牛奶在廠生產(chǎn)時間，對于乳品企業(yè)具有重要意義。

目前酸奶的發(fā)酵是使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌株[2]，共同分解代謝牛奶中的乳糖。兩種菌株對乳糖的代謝方式均為同型乳酸發(fā)酵[3]，但在不同發(fā)酵時期表現(xiàn)不同的代謝特性，在混合培養(yǎng)初期，嗜熱鏈球菌以其產(chǎn)酸快、生長快的特點[4]，成為主要的發(fā)酵菌株，經(jīng)糖酵解途徑代謝乳糖產(chǎn)酸使發(fā)酵pH值下降[5]，營造出適合保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸性環(huán)境，當pH值降至5.5時，嗜熱鏈球菌的生長速率減慢，而保加利亞乳桿菌的生長速率加快，成為主要的產(chǎn)酸菌株，在發(fā)酵后期及貯藏期發(fā)揮主要產(chǎn)生粘度和酸度的能力。

溴甲酚紫指示劑[6]的變色范圍是6.8（紫）～5.2（黃）（溴甲酚紫pH值在6.8以上為紫色，6.8～5.2為藍色，5.2以下為黃色），生乳發(fā)酵的pH值的變化范圍為6.7～4.6，在試驗條件下，2 h的發(fā)酵能使樣液的pH值從6.7降低至5.0，此時嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸過程完成，保加利亞菌株產(chǎn)生粘度和酸度也發(fā)揮了作用。所以添加溴甲酚紫指示劑的變色范圍能監(jiān)控到兩種菌株主要的發(fā)酵過程，能發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程異常，對比目前在用的發(fā)酵方法，可提前觀察發(fā)酵情況，更早對異常情況進行分析處理，在實際試驗中可以輔助使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

溴甲酚紫溶液（0.1 g/L），分析純，福晨（天津）化學試劑有限公司；菌種（200 U/包），丹麥科漢森有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

超凈工作臺（SW-CJ-2F），蘇州安泰空氣技術有限公司；pH計（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；粘度計（DV2TLVTJ0），美國BROOKFIELD公司。

1.2 方法

1.2.1 母菌種的配制和驗證

母菌種的配制：在超凈工作臺中將1.5 g粉末發(fā)酵劑加入250 mL的12%復原乳（12%復原乳的配制要求：使用溫度為（45～60 ℃）的三級水將無抗生素脫脂乳粉[7]溶解并定容至250 mL）中，在（55±1） ℃水浴鍋中水合1 h后沸水水浴10 min，然后冷卻至42 ℃左右。

母菌種的驗證：使用曾檢測發(fā)酵合格的生乳留樣進行驗證，將生乳樣品加熱煮沸殺菌[8]5～10 s后，轉(zhuǎn)移200 mL至滅菌后的300 mL三角瓶中，冷卻至45 ℃左右，加入母菌種4～5 mL，然后加入1 mL 0.1 g/L的溴甲酚紫溶液，加塞后搖勻，此時樣液為藍色（生乳的pH值一般在6.7左右），置于（45±1） ℃水浴鍋中溫育2.5 h，在溫育過程中不得搖晃三角瓶。培養(yǎng)2 h進行顏色判定，在2.5 h進行感官、粘度、pH值的檢測，符合標準要求，母菌種方可使用。

1.2.2 發(fā)酵過程

將生乳樣品加熱煮沸殺菌5～10 s后，轉(zhuǎn)移200 mL至滅菌后的300 mL三角瓶中，冷卻至45 ℃左右，加入母菌種4～5 mL，然后加入1 mL 0.1 g/L的溴甲酚紫溶液，加塞后搖勻，此時樣液為藍色（生乳的pH值一般在6.7左右），置于（45±1） ℃水浴鍋中溫育2.5 h，在溫育過程中不得搖晃三角瓶[9]。

培養(yǎng)2 h進行顏色判定，在2.5 h進行感官、粘度、pH值的檢測。見表1。

表1 觀察順序和判斷標準

1.3 判定結(jié)果

1. 3.1顏色判定

發(fā)酵2 h時，觀察顏色變化，樣液的顏色從藍色變?yōu)辄S色，生乳產(chǎn)酸進程正常。如果沒有變色，說明生乳發(fā)酵異常，可進行異常分析。

1.3.2 感官指標

繼續(xù)培養(yǎng)至2.5 h，輕輕取出樣品瓶，觀察樣品狀態(tài)。

1.3.3 理化指標

感官合格后的樣品可以進行理化指標的檢測，合格指標如下：粘度指標：＞500 cp，pH指標：4.6～5.0。

2 方法可行性論證

分別從酸奶發(fā)酵過程、添加溴甲酚紫指示劑與常用法酸奶發(fā)酵過程對比、添加溴甲酚紫結(jié)果觀察與常用法檢測酸度和粘度指標對比、添加溴甲酚紫與日常檢測不同點等方面闡述該方法的可行性。

2.1 酸奶發(fā)酵pH值變化圖

結(jié)合發(fā)酵過程中菌種的作用，初期生乳pH值在6.7左右，溶液呈現(xiàn)藍色，隨著嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸的進程加快，pH逐漸降低，降到5.5時，保加利亞乳桿菌的生長速率提升，直至pH4.6完成發(fā)酵。

在試驗設定的條件下，菌種正常的發(fā)酵進程：生乳的pH值普遍在6.6～6.7左右分布，隨著發(fā)酵作用，pH值1 h降低到5.9左右，2 h降低到5.1左右，3 h達到4.6左右，完成發(fā)酵（圖1）。

圖1 生乳發(fā)酵pH值變化圖

2.2 添加溴甲酚紫與不添加溴甲酚紫酸奶的pH值對比數(shù)據(jù)

在同一個樣品中添加了溴甲酚紫指示劑的發(fā)酵進程與未添加溴甲酚紫指示劑的日常發(fā)酵方法的發(fā)酵進程趨勢是一致的，而且它們在每個發(fā)酵時間點的pH值相差＜0.07，說明添加溴甲酚紫指示劑后只改變了樣液的顏色，并未影響酸奶的發(fā)酵進程，所以添加溴甲酚紫的發(fā)酵方法可以使用（表2）。

表2 兩種方法pH值對比數(shù)據(jù)

2.3 添加溴甲酚紫與不添加溴甲酚紫酸奶檢測各項指標對比

通過表3數(shù)據(jù)可以看出，溴甲酚紫法在2 h通過顏色的判定結(jié)論和2.5 h觀察感官結(jié)果一致，粘度均合格都大于500 cp且數(shù)值相差不大，使用溴甲酚紫方法通過pH計測量得出酸度結(jié)果，相對比常規(guī)法使用的酸度滴定法檢測酸度更加快速，而且和酸奶的發(fā)酵終點pH 4.6的判定方式一致，更容易判定出發(fā)酵的進程。

表3 兩種方法結(jié)果對比

2.4 添加溴甲酚紫與日常檢測不同點對比分析

溴甲酚紫法在發(fā)酵到2 h的時候就能直觀的通過觀察樣液的顏色判斷發(fā)酵的進程是否正常，而常規(guī)發(fā)酵法需要等到2.5 h取出樣品后才能發(fā)現(xiàn)樣品異常，所以添加了溴甲酚紫的方法能更早的發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程的異常，盡快分析采取驗證措施，縮短驗證時間（圖2）。

圖2 兩種方法流程對比圖

3 結(jié)論

通過對添加溴甲酚紫發(fā)酵方法的可行性論證可以看出：添加了溴甲酚紫的發(fā)酵方法，不影響酸奶發(fā)酵的發(fā)酵進程，且它能在2 h時就發(fā)現(xiàn)樣品發(fā)酵的異常，更快的分析采取驗證措施，且使用pH計檢測酸度結(jié)果，比日常的檢測使用的酸度滴定方法更快。在實際試驗中可以輔助使用。溴甲酚紫的添加對觀察生乳酸奶發(fā)酵進程具有重要意義。