邢益俊，何 瑛，林木娣，賴書瑩，曹學(xué)思，楊愛君，紀坤發(fā)

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510507

0 引言

牛奶富含多種營養(yǎng)成分，是理想的營養(yǎng)補充品。隨著生活水平的不斷提高，人們對牛奶的營養(yǎng)成分及安全性要求越來越高，食品安全問題日益受到廣大消費者的關(guān)注。微生物污染作為影響牛奶衛(wèi)生安全的主要原因，一直以來都是乳品企業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)預(yù)防和監(jiān)控的主要指標(biāo)之一。大腸菌群是微生物污染監(jiān)控最重要的一項[1]，乳品中大腸菌群含量超標(biāo)可能危害消費者腸道健康，引發(fā)食物中毒或其他食源性疾病[2]。大腸菌群是指需氧及兼性厭氧、在35～37 ℃培養(yǎng)條件下，48 h內(nèi)能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。目前，大腸菌群的檢測方法主要有平板計數(shù)法[3]、乳糖膽鹽多管發(fā)酵法[4]、LST多管發(fā)酵法[5]、紙片法[6]、PCR試劑盒法[7]、酶底物法[8]等。其中平板計數(shù)法、乳糖膽鹽多管發(fā)酵法和LST多管發(fā)酵法是常用的檢測方法。而傳統(tǒng)的微生物檢驗方法涉及的試驗過程較長，需要有大量人員參與，嚴重影響檢驗效率及工廠對產(chǎn)品的快速放行。巴氏殺菌乳殺菌強度低，對牛奶中天然活性成分的保留較多，但保質(zhì)期較短，大腸菌群快速檢測技術(shù)對于防止食源性疾病的危害及企業(yè)產(chǎn)品的快速放行具有重要意義。

本文應(yīng)用Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)對巴氏殺菌乳中大腸菌群進行快速檢測，通過與傳統(tǒng)國標(biāo)平板計數(shù)法《GB 4789.3—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》第二法進行對比，驗證該方法對牛奶大腸菌群檢測的可行性與準(zhǔn)確性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SolerisTM128微生物快速檢測系統(tǒng)，美國Neogen公司；培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；移液槍，德國Brand公司；漩渦振蕩器，廣州海太光電生物科技有限公司；電子天平，常州市衡正電子儀器有限公司。

1.2 試劑

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；NaOH（AR級別），廣州化學(xué)試劑廠；Soleris大腸菌群試劑瓶，美國Neogen公司；二級水（符合GB/T 6682—2008 分析試驗室用水）。

1 moL/L NaOH溶液：用小燒杯稱取NaOH4 g，加入40 mL二級水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，再用水反復(fù)沖洗小燒杯一并轉(zhuǎn)入到容量瓶中，最后定容到刻度。

1.3 材料

生牛乳，本公司本土自營牧場；評估大腸菌群為陰性的巴氏殺菌乳，本公司產(chǎn)品。

2 方法與分析

2.1 工作原理

Soleris大腸菌群檢測試劑瓶是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)理論與染色技術(shù)研發(fā)而成，在預(yù)制的試劑瓶中放置特異性的培養(yǎng)基和專用指示劑，在適宜的溫度條件下，當(dāng)微生物在培養(yǎng)瓶中繁殖時，會發(fā)生代謝產(chǎn)物改變培養(yǎng)基pH值或釋放CO2等生化反應(yīng)，從而引起試劑瓶底部的瓊脂栓顏色的變化。Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)利用光電檢測儀器，每隔6 min監(jiān)測試劑瓶底部瓊脂栓的顏色變化，將信號轉(zhuǎn)換成光度值，反映微生物的生長情況，通過實時監(jiān)測吸光值的變化，可快速實現(xiàn)對樣品中微生物的定性、半定量及定量的檢測（圖1）。

圖1 Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)檢測原理

2.2 試驗方法

2.2.1 陽性樣品制備

用VRBA培養(yǎng)基對生牛乳進行大腸菌群分離培養(yǎng)，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取典型菌落接種到BGLB管中36 ℃培養(yǎng)48 h，進行確認。把經(jīng)過確認的大腸菌群菌落接種到巴氏殺菌乳中，36 ℃培養(yǎng)過夜進行增菌，制備成大腸菌群陽性樣品，編號為樣品Y，放入冰箱冷藏備用。

2.2.2 Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法和平板計數(shù)法檢測結(jié)果的一致性驗證

為了更好地模擬巴氏殺菌乳在Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)中檢測，選擇經(jīng)檢驗確認大腸菌群為陰性的巴氏殺菌乳代替生理鹽水作為稀釋液。取5 mL陽性樣品Y加入到含有45 mL確認過大腸菌群為陰性的巴氏殺菌乳的帶蓋滅菌瓶中，用旋渦振蕩器將其充分混勻，用1 moL/L NaOH溶液調(diào)整其pH至6.7±0.3，編號為A1，依次稀釋樣品至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，對應(yīng)編號分別為A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8，再對A8進行1:1稀釋，編號為A8-2x。選擇進行梯度稀釋的樣品，移取1 mL，分別加入到Soleris大腸菌群試劑瓶中，上下顛倒2～3 次，混勻后將試劑瓶蓋回旋1/4，保持氣流交換，上機檢測，同時按照平板計數(shù)法進行對照試驗，每個樣品重復(fù)2次，以上稀釋過程全程不超過15 min。具體檢測結(jié)果見表1。

《GB 19645—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》對巴氏殺菌乳中大腸菌群的限量要求為：5 個樣品中不得有超過2 個樣品檢測結(jié)果大于5 CFU/mL。從表1可以看出，當(dāng)平板計數(shù)法檢測結(jié)果＞1 CFU/mL時，儀器均能檢出，而且含菌量越多，儀器檢出時間越短，兩種方法的檢測結(jié)果具有良好的一致性。此外，同稀釋梯度2 個平行樣品檢出時間的RSD值在0%～2.70%之間，重復(fù)性良好。

表1 Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法和平板計數(shù)法檢測結(jié)果

2.2.3 Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法的靈敏度驗證

基于風(fēng)險監(jiān)控的需求，企業(yè)對巴氏殺菌乳中大腸菌群的限量要求設(shè)定為＜1 CFU/mL。試驗選擇A8-2x稀釋梯度按照GB 4789.3-2016和Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法同步進行20 次重復(fù)試驗。由于稀釋倍數(shù)大，菌落可能無法被捕捉到，所以從中挑取10 個平板計數(shù)法菌落數(shù)檢出在1～2 CFU/mL之間的樣品對應(yīng)的儀器檢出時間，結(jié)果詳見表2。

表2 臨界樣品的重復(fù)性試驗結(jié)果

從表1、2可以看出，當(dāng)平板計數(shù)法檢出樣品中大腸菌群含量≥1 CFU/mL的監(jiān)控限值時，Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法均有檢出，沒有出現(xiàn)假陰性的情況。當(dāng)平板計數(shù)法檢出樣品中大腸菌群含量為1 CFU/mL時，Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法檢出時間為10.8～11.4 h，RSD值為1.62%。比起平板計數(shù)法培養(yǎng)需要18～24 h，該方法檢測時間顯著縮短，且靈敏度高，重復(fù)性良好。隨著樣品中大腸菌群污染越嚴重，Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)能越早地進行風(fēng)險預(yù)警。

2.2.4 Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法的特異性驗證

選擇10 個評估大腸菌群為陰性的巴氏殺菌乳樣品，同時進行Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法和平板計數(shù)法對照檢測，每個樣品重復(fù)2 次，得到的結(jié)果如表3。從表3可知，當(dāng)巴氏殺菌乳樣品平板計數(shù)法檢測結(jié)果為＜1 CFU/mL時，Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法結(jié)果均為“ND”（未檢出），該方法未出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，樣品基質(zhì)本身亦未對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。因此，Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法對巴氏殺菌乳大腸菌群的檢測具有良好的特異性[9]。

表3 陰性樣品的重復(fù)性試驗結(jié)果

3 討論

結(jié)合表1、表2的結(jié)果，當(dāng)平板計數(shù)法檢出樣品中大腸菌群含量為1 CFU/mL時，Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法檢出時間為10.8～11.4 h，在企業(yè)實際生產(chǎn)放行過程中，為了更好地進行風(fēng)險控制，可以將儀器檢測的截止時間延長2 h，設(shè)置為13.5 h，確保風(fēng)險被有效控制。

4 結(jié)論

本文建立Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法對巴氏殺菌乳中大腸菌群進行快速檢測，該方法操作簡便、實時快速，與國標(biāo)平板計數(shù)法具有良好的一致性，重復(fù)性良好，能有效減少人為誤差。Soleris微生物快速檢測系統(tǒng)方法從檢測到出結(jié)果只需要12 h左右，比傳統(tǒng)的國標(biāo)方法所需時間大大縮短，為企業(yè)巴氏殺菌乳快速放行提供決策依據(jù)。