陳楷，黃志深，曾羲，雷燕，林秀敏，蔣佳希，陳賢馳，肖劍

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

蠟樣芽胞桿菌作為食品中重要防控的致病菌之一，也是食源性疾病中常見(jiàn)的條件致病菌。研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌在即食肉制品、乳制品及各種生鮮食品中均有一定的檢出率，其中最為典型的是米面制品，作為主要污染源的濕粉類(lèi)食品，蠟樣芽胞桿菌檢出率達(dá)到43.17%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，環(huán)境中的蠟樣芽胞桿菌僅有1%～2%的菌株會(huì)產(chǎn)生嘔吐毒素[2]，但在食品和臨床樣品中產(chǎn)嘔吐毒素菌株的流行率卻高達(dá)32.8%[3]。

蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素（Cereulide，以下簡(jiǎn)稱(chēng)嘔吐毒素）的結(jié)構(gòu)為[D-O-Leu-D-Ala-D-O-Val-D-Val]3，如圖1，是一種十二環(huán)形多肽，分子量為1,153.38 u[4,5]，由位于巨質(zhì)粒上的ces基因簇（Cereulide Synthetase Gene Cluster）編碼的非核糖體肽合成酶（Networked Robot Perceptual System，NRPS）合成的，該毒素由攜帶ces基因的菌株在食物中預(yù)先產(chǎn)生且非常穩(wěn)定，進(jìn)入人體后在胃中與其受體結(jié)合，導(dǎo)致嘔吐反應(yīng)[6]。目前，國(guó)內(nèi)蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)方法是GB 4789.14-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》[7]，該方法只進(jìn)行蠟樣芽胞桿菌的鑒定，無(wú)法區(qū)分菌株是否產(chǎn)嘔吐毒素，而區(qū)分該菌株的方法通常用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測(cè)[8]，通過(guò)檢測(cè)菌株是否攜帶ces基因進(jìn)行辨別，但無(wú)法確定嘔吐毒素是否產(chǎn)生，要測(cè)定嘔吐毒素生成量還需通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等儀器進(jìn)行檢測(cè)[9]，前處理復(fù)雜、基質(zhì)效應(yīng)大?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)被廣泛運(yùn)用于微生物鑒定，該技術(shù)通過(guò)高度復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)軟件自動(dòng)生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有快速便捷、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、運(yùn)行成本低等特點(diǎn)[10]。目前，Ulrich 等[11]通過(guò)MALDI-TOFMS 測(cè)量700～3 500 u 質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白，確定了嘔吐毒素的兩個(gè)特定生物特征峰分別為m/z1 171 和m/z1,187，Doellinger 等[12]在MALDI-TOF MS 反射模式下測(cè)得嘔吐毒素的鈉和鉀加合物信號(hào)峰為m/z1 175（[M+Na]+）和m/z1 191（[M+K]+），MALDI-TOF MS 在檢測(cè)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌方面的潛力得到了檢驗(yàn)。

圖1 嘔吐毒素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of cereulide

但由于嘔吐毒素的合成不僅受細(xì)菌內(nèi)部基因的調(diào)控，還受所在環(huán)境因素的影響，研究顯示，蠟樣芽胞桿菌合成嘔吐毒素的最適溫度為20～30 ℃[13]。此外，營(yíng)養(yǎng)條件、pH 值、濕度和NaCl 等也會(huì)影響嘔吐毒素的產(chǎn)生[14,15]。為此，本研究通過(guò)對(duì)嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，對(duì)特征峰進(jìn)行定位并測(cè)定其靈敏度，評(píng)估國(guó)內(nèi)常用于培養(yǎng)蠟樣芽胞桿菌不同培養(yǎng)基和其他條件之間檢測(cè)結(jié)果的差別，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，并采用已確定含有ces基因型的蠟樣芽胞桿菌菌株進(jìn)行方法特異性驗(yàn)證，建立一種能簡(jiǎn)單、快速、高通量直接進(jìn)行產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的鑒別方法，為食品中病原微生物靶標(biāo)性監(jiān)測(cè)和食品安全事件應(yīng)急檢驗(yàn)提供一種快捷鑒別技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用菌株

蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 10352）、蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 21473），來(lái)自于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；蘇云金芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 10792），來(lái)自于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；49 株野生蠟樣芽胞桿菌菌株[16]（編號(hào)BC-1～49，其中BC-43、49 攜帶ces基因，實(shí)驗(yàn)室分離）。

1.1.2 主要試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，荷蘭Chiralix 公司；甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（Mannitol Yolk Polymyxin Agar Base，MYP）、胰酪胨大豆羊血瓊脂平板（Trypticase Soy Sheep Blood Agar Plate，TSSB）、胰酪大豆胨瓊脂（Tryptic Soytone Agar，TSA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙腈（色譜純），德國(guó)Meker 公司；甲酸（色譜純），美國(guó)Fisher Scientific 公司；三氟乙酸（色譜純），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）、Bacterial Test Standard，德國(guó)Bruker 公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Ultrafle Xtreme），德國(guó)Bruker 公司；生化培養(yǎng)箱，賓德環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備（上海）有限公司；生物安全柜，賽默飛世爾（上海）有限公司；高壓滅菌器，致微（廈門(mén)）儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)

將嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（2 mg）用純乙腈溶解后定容至200 μg/mL 制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用φ=75%乙醇進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e制備10、5、1、0.1、0.01 μg/mL 的稀釋液，從這些稀釋液中分別吸取1 μL 至MTP 384 靶板上，在室溫下風(fēng)干，覆蓋1 μL 基質(zhì)HCCA，待基質(zhì)干燥后進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)。

1.3.2 不同培養(yǎng)條件菌株的檢測(cè)

依據(jù)GB 4789.14[7]中蠟樣芽胞桿菌分離鑒定使用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度，將攜帶ces基因的蠟樣芽胞桿菌菌株分別接種到TSA、TSSB 和MYP 三種培養(yǎng)基平板，并將每種培養(yǎng)基平板分別放置于30 ℃和36 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)12、18、24 和48 h 后用1 μL的一次性接種環(huán)直接從培養(yǎng)基中挑取典型菌落，均勻的涂抹到MTP 384 靶板上，用1 μL 體積分?jǐn)?shù)70%甲酸覆蓋菌苔，在室溫下風(fēng)干，再覆蓋1 μL 基質(zhì)HCCA，待基質(zhì)干燥后上機(jī)進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)。

根據(jù)試驗(yàn)要求，試驗(yàn)指標(biāo)為特征峰的響應(yīng)值，不考慮交互作用，試驗(yàn)因素水平如表1，其中因素A 為四水平，而因素B、C 由于受試驗(yàn)條件的限制，分別只取二水平和三水平，為此把因素B 虛擬二個(gè)水平，因素C 虛擬一個(gè)水平，虛擬結(jié)果相當(dāng)于把L16(43)表2作了改造，第2 列為1→1，2→2，3→1，4→2，第三列為1→1，2→2，3→3，4→1，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2 試驗(yàn)方案Table 2 Test scheme

1.3.3 方法特異性檢驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的49 株蠟樣芽胞桿菌野生菌株（其中2 株含ces基因）和標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟樣芽胞桿菌（CICC 10352）、蕈狀芽胞桿菌（CICC21473）、蘇云金芽胞桿菌（ATCC10792），使用1.3.2 的最優(yōu)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，用1 μL 的一次性接種環(huán)直接從培養(yǎng)基中挑取典型菌落，均勻的涂抹到MTP 384 靶板上，用1 μLφ=70%甲酸覆蓋菌苔，在室溫下風(fēng)干，再覆蓋1 μL 基質(zhì)HCCA，待基質(zhì)干燥后上機(jī)進(jìn)行MALDITOF MS 檢測(cè)。

1.3.4 質(zhì)譜條件

正離子反射模式；檢測(cè)范圍：700～3 500 u；激光強(qiáng)度：30%；激光點(diǎn)擊數(shù)：每圖譜200 次（8 次激光累積）；激光頻率；2 000.0 Hz；離子源加速電壓：20 kV；采用速率：5.00 GS/s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1K值和k值的計(jì)算

以第一列A 因素為例：

K1=x3+x5+x8+x15

K2=x1+x7+x10+x14

K3=x4+x6+x11+x16

K4=x2+x9+x12+x13

ki=

式中：

Ki——各因素同一水平之和；

i——第i個(gè)水平；

ki——各因素同一水平的平均值；

n——該水平的總試驗(yàn)數(shù)。

1.4.2 極差R的計(jì)算

R=max(ki)-min(ki)

式中：

R——該因素在其取值范圍內(nèi)試驗(yàn)指標(biāo)變化的幅度。

2 結(jié)果與討論

2.1 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果

分別吸取1 μL 質(zhì)量濃度為10、5、1、0.1、0.01 μg/mL的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，每個(gè)濃度均可以檢測(cè)到嘔吐毒素相應(yīng)m/z值為1 175 的[M+Na]+和1 191 的[M+K]+加合物特征峰，峰高響應(yīng)值均大于104，檢驗(yàn)結(jié)果與Doellinger等[12]在MALDI-TOF MS反射模式下測(cè)得的嘔吐毒素鈉和鉀加合物信號(hào)峰位置和響應(yīng)值結(jié)果一致，均檢測(cè)到響應(yīng)值大于104的m/z值為1 175 [M+Na]+和m/z值為1 191 [M+K]+。Ulrich 等[11]在線性正模式下測(cè)得嘔吐毒素的兩個(gè)特征峰為m/z1 171 和1 187，最高響應(yīng)值均大于104，但因儀器和檢測(cè)模式條件不同，故特征峰出峰位置存在一定差異。

本次檢驗(yàn)結(jié)果中，在最低質(zhì)量濃度0.01 μg/mL 的稀釋液1 μL 中仍可以檢測(cè)到相應(yīng)的加合物特征峰，響應(yīng)值大于104，說(shuō)明該方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，達(dá)到0.01 μg/mL。Ulrich 等[11]使用MALDI-TOF/TOF MS（Bruker Daltonics Gmbh）在線性正模式（m/z800～1 800）下，對(duì)不同濃度的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量的檢出限為1.0 μg/mL；Doellinger 等[12]使用MALDITOF/TOF MS 在正離子反射模式（m/z700～3 500）下，對(duì)不同濃度的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量精密度的為0.25 ng，均低于本次試驗(yàn)結(jié)果的靈敏度0.01 μg/mL。將各個(gè)質(zhì)量濃度的嘔吐毒素特征峰響應(yīng)值與質(zhì)量濃度做折線圖，如圖2所示，從趨勢(shì)線上看，兩個(gè)嘔吐毒素特征峰m/z值為1 175 [M+Na]+和m/z值為1 191[M+K]+的響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度不成線性關(guān)系，這也反映了MALDI-TOF MS 在定量檢測(cè)方面存在一定的局限性。

圖2 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度曲線(n=2)Fig.2 Concentration curve of cereulide standard (n=2)

2.2 不同培養(yǎng)條件的檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)表2的試驗(yàn)方案進(jìn)行16 次試驗(yàn)，檢測(cè)分析結(jié)果如表3所示。其中，K為第j列因素m 水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)和，k為K的平均值。由k的大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。故在m/z1 175 因素A（培養(yǎng)時(shí)間）的優(yōu)水平：k4＞k1＞k3＞k2，因素B（培養(yǎng)溫度）的優(yōu)水平：k1＞k2，因素C（培養(yǎng)基）的優(yōu)水平：k1＞k2＞k3，優(yōu)組合為A4B1C1，即MYP 培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)48 h 的培養(yǎng)物；在m/z1 191 因素A（培養(yǎng)時(shí)間）的優(yōu)水平：k1＞k4＞k2＞k3，因素B（培養(yǎng)溫度）的優(yōu)水平：k1＞k2，因素C（培養(yǎng)基）的優(yōu)水平：k1＞k2＞k3，優(yōu)組合為A1B1C1，即MYP 培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)12 h 的培養(yǎng)物。

R為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動(dòng)時(shí)，試驗(yàn)指標(biāo)的變動(dòng)幅度。R越大，說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。因此，根據(jù)表3中極差R的大小，判斷本次試驗(yàn)各因素的影響主次順序分別是m/z1 175：因素A（培養(yǎng)時(shí)間）＞因素C（培養(yǎng)基）＞因素B（培養(yǎng)溫度）；m/z1 191：因素C（培養(yǎng)基）＞因素B（培養(yǎng)溫度）＞因素A（培養(yǎng)時(shí)間）。

表3 試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 3 Test results and range analysis

以上對(duì)m/z1 175 響應(yīng)值和m/z1 191 響應(yīng)值兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)分析出的優(yōu)化條件中，除了因素A（培養(yǎng)時(shí)間）不一致，因素B（培養(yǎng)溫度）、C（培養(yǎng)基）均一致，綜合快速鑒別的時(shí)效性考慮，為了在食品監(jiān)督控制過(guò)程中盡快找出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌，故因素A 取A1（12 h），選定最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為A1B1C1，即接種MYP 培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行檢驗(yàn)。

Ulrich 等[11]用5wt%羊血哥倫比亞瓊脂上37 ℃培養(yǎng)48 h 的培養(yǎng)物，在線性正模式下進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)，雖然可以檢測(cè)到m/z1 171 和1 187 的兩個(gè)特征峰，但響應(yīng)值低于104；Doellinger 等[12]用Caso 瓊脂和血平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 的培養(yǎng)物，在反射模式下進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)，可直接檢測(cè)到嘔吐毒素相應(yīng)m/z值為1 175的[M+Na]+和1 191的[M+K]+加合物特征峰，但響應(yīng)值均小于104，只有經(jīng)過(guò)溶劑提取處理后再進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量數(shù)據(jù)響應(yīng)值才大幅提高（＞105）。Carroll等[13]研究顯示，蠟樣芽胞桿菌合成嘔吐毒素的最適溫度為20～30 ℃。故筆者認(rèn)為，使用MYP 培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)12 h 的培養(yǎng)物直接進(jìn)行檢測(cè)，與CB 4789.14[7]中樣品分離培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度高度契合，有利于產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)毒，可以更快速高效的對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行區(qū)分。

2.3 方法特異性檢驗(yàn)結(jié)果

將49 株野生蠟樣芽胞桿菌和3 株標(biāo)準(zhǔn)菌株，蠟樣芽胞桿菌（CICC 10352）、蕈狀芽胞桿菌（CICC 21473）、蘇云金芽胞桿菌（ATCC 10792）接種到MYP 瓊脂平板上經(jīng)過(guò)30 ℃培養(yǎng)12 h 后，挑取培養(yǎng)物進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表4、圖3、圖4所示，其中2 株含ces基因的蠟樣芽胞桿菌均檢測(cè)到嘔吐毒素相應(yīng)的m/z值為1 175 的[M+Na]+和m/z值為1 191 的[M+K]+加合物特征峰，響應(yīng)值均大于104，其他未攜帶ces基因的菌株均未檢測(cè)到相應(yīng)的特征峰；標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟樣芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌均不攜帶ces基因，試驗(yàn)結(jié)果均未檢測(cè)到相應(yīng)的m/z值為1 175 的[M+Na]+和m/z值為1 191 的[M+K]+加合物特征峰，特異性達(dá)到100%。

圖3 49 株陽(yáng)性蠟樣芽胞桿菌的MALDI-TOF MS 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 MALDI-TOF MS detection results of 49 positive strains of Bacillus cereus

圖4 標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of standard strains

表4 菌株的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of strains

Ulrich 等[11]對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素和非產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌分離株的區(qū)分研究中，121 株測(cè)試菌株中有120株MALDI-TOF MS 測(cè)定結(jié)果和PCR 分析的比對(duì)結(jié)果一致，只有一株產(chǎn)嘔吐毒素菌株在MALDI-TOF MS中呈假陰性，主要是因?yàn)樵摼戤a(chǎn)毒能力極低，無(wú)法被檢測(cè)到，作者認(rèn)為該低產(chǎn)毒菌無(wú)法構(gòu)成公共衛(wèi)生危害，故MALDI-TOF MS 對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性（＞99%）。Doellinger等[12]共測(cè)試了8 株蠟樣芽胞桿菌，包括高產(chǎn)毒菌2 株，中產(chǎn)毒菌1 株，低產(chǎn)毒菌3 株，非產(chǎn)毒菌2 株，但未給出8 株菌全部的檢測(cè)結(jié)果和譜圖，未進(jìn)行特異性判斷。因此，筆者認(rèn)為后續(xù)若有條件仍可增大樣本量對(duì)該方法的特異性再進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論

蠟樣芽胞桿菌是食品生產(chǎn)過(guò)程中污染食物的一個(gè)主要來(lái)源，是食物中毒的主要致病因子之一。雖然目前有國(guó)標(biāo)方法可以檢測(cè)食品中的細(xì)菌污染，但該方法不能區(qū)分產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌。MALDI-TOF MS技術(shù)的易用性和廣泛可用性有助于在常規(guī)鑒定中檢出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用MALDI-TOF MS 技術(shù)檢測(cè)嘔吐毒素相應(yīng)m/z值為1 175 的[M+Na]+和1 191 的[M+K]+加合物特征峰，可以有效的區(qū)分產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌，該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01 μg/mL。通過(guò)正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果，選用樣品培養(yǎng)條件為接種MYP 培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng) 12 h，培養(yǎng)后直接挑取典型菌落進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)，這與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法GB 4789.14中對(duì)食品中蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)的分離條件剛好契合，且培養(yǎng)時(shí)間減少一半以上，僅需12 h，且上機(jī)檢測(cè)結(jié)果響應(yīng)值高（＞104）。該方法對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)特異性強(qiáng)（100%），靈敏度高（0.01 μg/mL），因此可在食品樣品檢測(cè)過(guò)程中，使用MYP 培養(yǎng)基平板上的典型菌落直接進(jìn)行MALDI-TOF MS 檢測(cè)，如果檢測(cè)到m/z值為1 175 的[M+Na]+和m/z值為1 191的[M+K]+加合物特征峰且響應(yīng)值大于104，即可判斷該菌為疑似產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌，從而鎖定該樣品并進(jìn)行進(jìn)一步的傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定和毒力基因檢測(cè)確認(rèn)。該方法是一種適合產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的高通量篩查技術(shù)，操作簡(jiǎn)單、靈敏，可為食品生產(chǎn)危害控制及快速監(jiān)管提供技術(shù)支持，可實(shí)現(xiàn)對(duì)消費(fèi)者的保護(hù)和食品加工質(zhì)量的保障，應(yīng)用前景廣闊。