劉英語(yǔ)，程愛(ài)迪，吳酉芝，韓帥，彭飛*

（1.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西南昌 330047）（2.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品學(xué)院，上海 201514）

生物催化反應(yīng)因符合“綠色化學(xué)”原則而備受關(guān)注[1]。反應(yīng)歷程中所使用的生物酶是以降低反應(yīng)的活化能而使反應(yīng)順利進(jìn)行，是生物催化的核心要素。因酶催化具有高效性、專一性、條件溫和性的優(yōu)勢(shì)，其在高附加值化工產(chǎn)品，食品藥品，造紙等領(lǐng)域占據(jù)重要地位[2,3]。然而在實(shí)際的生產(chǎn)中，通常需要兩種或兩種以上的生物酶串聯(lián)共同發(fā)揮作用。多酶催化反應(yīng)可獨(dú)立開(kāi)展，即將此反應(yīng)得到的產(chǎn)物分離提純后用于后續(xù)生物反應(yīng)中，一直等到目標(biāo)產(chǎn)物出現(xiàn)為止。這種方式的優(yōu)勢(shì)在于不需要協(xié)調(diào)不同種類生物酶催化反應(yīng)中條件難相容的問(wèn)題，但是實(shí)際操作復(fù)雜，產(chǎn)物的時(shí)空產(chǎn)率偏低以及增加“三廢”排放[4,5]，這不利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和經(jīng)濟(jì)效益的提高。鑒于此，多酶級(jí)聯(lián)催化的策略在生產(chǎn)中更加備受青睞。多酶級(jí)聯(lián)催化法（“一鍋法”）無(wú)需分離純化中間產(chǎn)物，是直接將反應(yīng)歷程中所需的生物酶加入到體系中，由最初的底物按照酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)順序直接合成目標(biāo)產(chǎn)物[6,7]。

然而參與級(jí)聯(lián)反應(yīng)的游離型生物酶催化劑存在著穩(wěn)定性較差、分離回收困難、重復(fù)利用率低等問(wèn)題[8,9]。因此可將其進(jìn)行固定化操作，實(shí)現(xiàn)微環(huán)境下的保護(hù)，即酶共固定化，不但大大增加了酶穩(wěn)定性和提高回收利用率，還進(jìn)一步縮短了酶分子之間的距離，構(gòu)建物質(zhì)傳輸通道，提升生物催化反應(yīng)速率[10-12]。此外，基于納米材料的固定化策略可以制備得到比表面積較大的生物催化劑，進(jìn)一步增大底物與酶催化位點(diǎn)的結(jié)合機(jī)率，這也是提高固定化酶催化性能的一種對(duì)策。因此，本文以酶和固定化材料間的作用方式作為歸類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行總結(jié)評(píng)價(jià)和展望，以期為生物催化的多酶固定化領(lǐng)域的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 基于非特異性非共價(jià)結(jié)合的共固定化納米酶

典型的有吸附法，它基本是通過(guò)酶分子與載體間的氫鍵、分子間作用力、離子間配位與疏水性等作用力制備共固定化酶[13]。吸附制備操作簡(jiǎn)單、制備環(huán)境溫和，不易損傷酶催化活力。事實(shí)上吸附法固定化酶的性能主要取決于載體材料和吸附方式，其中理想的載體材料應(yīng)具備良好的生物相容性和穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度。由于非特異作用強(qiáng)度較低，吸附法固定化酶在實(shí)際反應(yīng)中卻會(huì)面臨酶泄露的問(wèn)題，因此減少或避免酶蛋白的泄露則成為科研者的工作重心。吸附法涉及到的載體種類繁多，有二氧化硅、活性炭、瓊脂、淀粉等[14]。Pescador 等[15]以葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）和辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）組合作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究其在?fù)載聚合電解質(zhì)的二氧化硅納米粒子表面靜電吸附共固定化的可行性，結(jié)果表明分布在同一層的共固定化酶催化葡萄糖氧化的速率高出分布在不同層面的固定化酶的2.5 倍，究其原因可能是分子在薄膜間的傳輸效率不同。Cui 等[16]以介孔二氧化硅為載體材料原位合成共固定化酶：將谷胱甘肽合成酶吸附在介孔中，再將多聚磷酸鹽激酶借助多巴胺黏附在材料表面，以此完成多酶的共固定化。制備得到的固定化酶活力較游離酶顯著提升至少兩倍，在循環(huán)催化7 次后其催化活性仍保留有80%。催化活性的提高歸因于介孔材料對(duì)酶蛋白分子的截留，以略微小于酶分子直徑的材料對(duì)酶進(jìn)行固定化可減少或阻止酶蛋白的泄露。

酶與載體材料依靠微弱的非特異性吸附作用結(jié)合常會(huì)使制備得到的固定化酶出現(xiàn)崩解的現(xiàn)象，研究人員后期則設(shè)法對(duì)載體材料進(jìn)行官能團(tuán)修飾（-OH、-NH2、-COOH），以此顯著加強(qiáng)載體與酶蛋白間的作用力[17-19]，從而提升酶穩(wěn)定性[20]。同時(shí)科研人員的研究結(jié)果表明多種作用方式協(xié)同共固定化生物酶較單一固定化方式更能夠顯著提高酶的性能，例如將吸附法與共價(jià)結(jié)合法或包埋法相結(jié)合。Solé 等[21]在研究中首先表明以不同基團(tuán)修飾的載體材料制備的固定化酶之間的性能存在顯著差異，其中氨基化瓊脂糖的固定化酶性能最佳，因?yàn)橛杉?xì)胞色素P450 和葡萄糖脫氫酶構(gòu)成的共固定化酶的親和性更強(qiáng)。在此實(shí)驗(yàn)中，雙酶首先以吸附作用固定在氨基化瓊脂糖，繼而以零長(zhǎng)度交聯(lián)劑1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺交聯(lián)制備固定化雙酶，得到的共固定化酶在重復(fù)4 個(gè)循環(huán)催化反應(yīng)后殘余酶活仍＞20%。Henriques 等[22]將脂肪酶蛋白吸附固定在SDS 功能化的疏水磁性納米粒子，結(jié)果顯示脂肪酶活性得到4 倍提高。隨后通過(guò)對(duì)脂肪酶表面上的羧基進(jìn)行化學(xué)胺化，因而β-半乳糖苷酶可借助離子相互作用與已被吸附脂肪酶實(shí)現(xiàn)共固定化，再以戊二醛交聯(lián)加固，最終得到雙酶共固定化磁性納米粒子，結(jié)果表明制備的共固定化酶熱穩(wěn)定性和pH 值穩(wěn)定性均顯著得到提高。

蛋白-無(wú)機(jī)復(fù)合納米花固定化技術(shù)在2012年由Ge等[23]報(bào)道，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)酶蛋白、金屬陽(yáng)離子（Cu2+）與磷酸根陰離子的配位結(jié)合可構(gòu)成表面花狀的固定化酶。酶蛋白-無(wú)機(jī)物晶體復(fù)合納米花的生成主要分為三個(gè)步驟：成核、聚集、各向異性生長(zhǎng)[24]。以蛋白分子的-NH2與金屬離子結(jié)合形成的復(fù)合物作為晶體核心；酶-金屬?gòu)?fù)合物從金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)不斷生長(zhǎng)沉積形成納米花的花瓣；最后酶蛋白復(fù)合物不斷向各向異性生長(zhǎng)。蛋白-無(wú)機(jī)納米花固定化技術(shù)實(shí)操簡(jiǎn)便，所需反應(yīng)條件溫和。固定化納米花不僅具有比表面積高、傳質(zhì)阻力小、綠色溫和等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可以根據(jù)金屬離子或制備方式的不同構(gòu)造出多形態(tài)的納米花。由于雜化技術(shù)中運(yùn)用到金屬，固定化含金屬離子的生物酶因此可以依賴反應(yīng)環(huán)境中的金屬離子增強(qiáng)自身酶活，其中典型案例則是漆酶的固定化[25]。蛋白-無(wú)機(jī)雜化技術(shù)現(xiàn)已廣泛運(yùn)用到酶固定化[26,27]，酶催化輔因子ADP 再生體系[28]、生物傳感器[29,30]等多方面。

Sun 等[31]制備了氧化還原多酶納米花用作葡萄糖檢測(cè)的高靈敏度比色傳感器，是將GOD 和HRP 混合后加入到Cu3(PO4)2·3H2O 溶液，25 ℃組裝3 d 得到共固定化酶GOD&HRP-Cu3(PO4)2·3H2O。固定化酶分子之間的距離被縮短，因此共固定化酶催化葡萄糖氧化的活性高于游離型混合酶約4 倍，比單酶納米花級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)速率加快60%。與此同時(shí)，Li等[32]的關(guān)于GOD和HRP 共固定化的研究表明多酶固定化順序?qū)?fù)合納米花共固定化酶催化活性具有重要影響。這是由酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)中底物傳輸順序?qū)е碌?。因此多酶?jí)聯(lián)反應(yīng)歷程也為納米花組裝有序化的研究提供了新思考。由于納米花的沉積生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要2～3 d，因此學(xué)者們嘗試將傳統(tǒng)超聲法與蛋白-無(wú)機(jī)雜化技術(shù)結(jié)合，數(shù)分鐘內(nèi)即可合成聚合物，顯著提高了生物催化劑制備效率[33,34]。

納米花是依賴于非共價(jià)鍵作用因而結(jié)合力較弱，若在較酸環(huán)境中應(yīng)用或回收循環(huán)使用時(shí)穩(wěn)定性較差。因此，復(fù)合納米花反應(yīng)器穩(wěn)定性的提升常會(huì)融合交聯(lián)法或包埋法[35,36]。Patel 等[37]在進(jìn)行漆酶納米花制備時(shí)引入了戊二醛，通過(guò)與交聯(lián)法結(jié)合得到交聯(lián)體納米花復(fù)合物（Cross-Linked Nanoflower，CL-NF）（圖1）。研究表明，相較于未交聯(lián)納米花或游離漆酶，CL-NF酶活性更高且pH、溫度、儲(chǔ)藏和操作穩(wěn)定性得到加強(qiáng)。例如，CL-NF 和未交聯(lián)納米花催化溴酚藍(lán)脫色重復(fù)使用10 批次后其活分別保留96.8%和85.8%。Zhao 等[38]則通過(guò)與傳統(tǒng)的海藻酸鈣包埋技術(shù)結(jié)合制備了固定化小球 Ca3(PO4)2-ALDC/Alg[(Ca3(PO4)2-α-Acetolactate Decarboxylase Alginate Gel Beads]。研究結(jié)果表明，固定化小球的酶活回收率（98%）明顯高于傳統(tǒng)法海藻酸鈣包埋ALDC/Alg（70%），這得益于固定化小球內(nèi)的Ca3(PO4)2-ALDC 較為疏松的結(jié)構(gòu)特征。此外，雙酶復(fù)合納米花催化α-乙酰乳酸合成乙偶姻相較于單酶納米花反應(yīng)器具有更優(yōu)越的操作穩(wěn)定性。其在重復(fù)使用6批次后催化活性仍能保留82%。由于包埋法的介入在一定程度上增大了傳質(zhì)阻力，Zhang 等[39]設(shè)計(jì)通過(guò)使用結(jié)構(gòu)更疏松的聚乙烯醇[Poly(Vinyl Alcohol)，PVA]凝膠包埋法降低阻力，提高酶活力：以PVA 包埋固定化堿性蛋白酶-Cu3(PO4)2·3H2O 得到納米花凝膠酶復(fù)合物，二者的酶活回收率分別提高9 倍和5 倍。以催化底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯水解為例，納米花凝膠酶復(fù)合物經(jīng)12 次循環(huán)使用后其酶活回收達(dá)到108%，但是堿性蛋白酶-Cu3(PO4)2·3H2O 只能重復(fù)催化6 個(gè)批次。顯而易見(jiàn)，多酶雜化納米花可以借助包埋、交聯(lián)等多重技術(shù)提升酶的催化能力。

圖1 交聯(lián)laccase-Cu3(PO4)2·3H2O 復(fù)合納米花的制備[37]Fig.1 The preparation of cross-linked laccase-Cu3(PO4)2·3H2O composite nanoflowers[37]

2 基于非特異性包埋的共固定化納米酶

包埋固定化法是將酶蛋白約束在格子結(jié)構(gòu)或者微囊結(jié)構(gòu)中，與吸附法類似，包埋過(guò)程不涉及酶分子基團(tuán)修飾，對(duì)酶分子的構(gòu)象影響偏小，有利于酶活性的保留。使用的包埋材料生物相容性良好，包括纖維素、褐藻酸鈉、瓊膠素、脫乙酰甲殼素和SiO2等[40]，并且也在不斷涌現(xiàn)出前沿材料。Petrovi?ová 等[41]利用聚乙烯醇和聚乙二醇共包埋羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶制備多酶固定化小球催化α-丁酮酸乙酯的還原反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在反復(fù)利用18 個(gè)批次后，該共固定化小球的酶活性仍能保留80%。不僅如此，固定化酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性遠(yuǎn)優(yōu)于游離酶，例如固定化酶在儲(chǔ)藏10 個(gè)月后酶活保留約80%，但游離酶在90 h 后基本完全失活。此外，研究表明海藻酸鈣固定化游離生物酶也能夠顯著增強(qiáng)酶穩(wěn)定性[42]。但是，相較于游離型生物酶，高分子材料包埋制備得到的固定化小球尺寸偏大，在反應(yīng)過(guò)程中存在較大的傳質(zhì)阻力從而降低催化反應(yīng)效率，目前此種固定化技術(shù)常用來(lái)進(jìn)行微生物細(xì)胞包埋[43]。

納米材料因其巨大的比表面積可以有效地解決由傳統(tǒng)包埋法引起的傳質(zhì)阻力增大的問(wèn)題，此外據(jù)報(bào)道納米材料的引入還可以顯著地增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。金屬有機(jī)框架材料（Metal Organic Frameworks，MOFs）、二氧化硅納米粒子、超分子凝膠、納米纖維等是目前包埋酶蛋白常用的納米載體材料[44-46]。

Wu 等[47]利用金屬有機(jī)框架材料沸石咪唑酯骨架材料（Zeolitic Imidazolate Framework-8，ZIF-8）同時(shí)包埋葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶，制備得到GOD&HRP 共固定化酶。該技術(shù)打破了以往先合成MOFs 的慣例，采用原位封裝法合成酶-MOF 復(fù)合物，X 射線衍射（Diffraction of X-rays，XRD）和透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）的結(jié)果顯示新合成的GOD&HRP/ZIF-8持有ZIF-8原先的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。酶活性研究顯示GOD&HRP/ZIF-8 催化葡萄糖氧化的活性較GOD/ZIF-8 和HRP/ZIF-8 混合酶提高一倍，這主要?dú)w功于共固定化技術(shù)拉近了雙酶之間的距離，從而加快酶反應(yīng)速率。Ren 等[48]以同樣的載體材料實(shí)現(xiàn)碳酸酐酶，甲酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的原位封裝。由于聚氮雜環(huán)丙烷和輔因子 NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）的添加，該共固定化酶兼具輔因子自循環(huán)和催化CO2加氫合成甲酸的功能（圖2），且催化合成產(chǎn)物甲酸的得率提高3.6 倍，重復(fù)使用8 批次后酶的活性仍保留一半。

圖2 共固定化酶催化二氧化碳制備甲酸[48]Fig.2 The preparation of formic acid from carbon dioxide by co-immobilized enzymes [48]

值得注意的是，金屬有機(jī)框架載體材料因孔道內(nèi)徑大小差異變化可影響固定化酶的催化活性，因?yàn)橥ǔ＝饘儆袡C(jī)框架材料的孔徑小于2 nm 會(huì)妨礙底物分子與腔體內(nèi)酶蛋白的接觸。所以，適宜孔徑的框架材料有利于底物分子穿過(guò)載體材料，提升整體催化效率。如Zhao 等[49]使用了介孔孔徑（5.5 nm）的金屬有機(jī)框架材料PCN-333 共固定化膽固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase fromNocardia ery-thropolis，ChOx）和HPR 制造了用于膽固醇檢測(cè)的高靈敏度比色生物傳感器。

具有自我組裝和自我修復(fù)特性的非共價(jià)多孔配位聚合物在酶固定化技術(shù)開(kāi)發(fā)中已呈現(xiàn)出發(fā)展的遠(yuǎn)大前景。Liang 等[50]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出金屬離子（Zn2+）與核苷酸（腺苷酸、鳥(niǎo)苷酸、胞苷酸）和磷酸鹽具有較高的親和力可通過(guò)配位作用形成疏松多孔的凝膠。其中，Zn2+與腺苷酸（Adenine Nucleotides，AMP）可制得Zn/AMP 配位聚合物，這本身是一種可逆的相互作用，在機(jī)械力（離心）作用下，溶膠顆粒可以重新連接形成凝膠。此外，以Zn/AMP 為載體同時(shí)包埋GOD 和HRP 制得的固定化酶活回收率接近100%且其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性得到顯著提升，例如共固定化酶儲(chǔ)存15 d 后催化活性仍保留70%以上，而游離型酶幾乎完全失活[51]。凝膠柔性好，但本身回收程序較為繁瑣，將Zn/AMP依附在磁性納米粒子或金納米粒子等載體表面生長(zhǎng)可簡(jiǎn)化實(shí)際應(yīng)用中固定化酶的循環(huán)利用[52,53]。

3 基于非特性共價(jià)結(jié)合的共固定化納米酶

酶可以通過(guò)活性基團(tuán)反應(yīng)與載體以共價(jià)作用的方式結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)酶蛋白固定化。此種技術(shù)通常需要固定化前處理如活化酶和載體，一方面增加了操作復(fù)雜性，另一方面酶在固定化后構(gòu)象通常會(huì)因此發(fā)生變化而導(dǎo)致酶活回收率較低。但是酶與載體間的共價(jià)結(jié)合比較牢固，不易發(fā)生酶脫離，能在一定程度上提升酶穩(wěn)定性[54]。

對(duì)于多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將多種酶同時(shí)與載體活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合得到隨機(jī)固定化酶的催化活性一般高于單固定化酶的聯(lián)合催化。Chen 等[54]將纖維素酶和溶菌酶同時(shí)與經(jīng)戊二醛活化后的磁性二氧化硅納米粒子相結(jié)合得到可降解微擬球藻細(xì)胞回收微生物油脂的隨機(jī)共固定化酶。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，酶活回收率與單酶固定化的相接近。共固定化酶在降解微擬球藻細(xì)胞反應(yīng)中循環(huán)利用6 批次后催化能力依然能存留60%。由于共固定化伴侶具有改變酶的微環(huán)境的作用，過(guò)氧化物固定化酶在以過(guò)氧化氫（Hydrogen Peroxide，H2O2）為電子供體進(jìn)行氧化反應(yīng)時(shí)，可用細(xì)胞色素c 提高酶的穩(wěn)定性，Sahare 等[55]制備了過(guò)氧化物酶與細(xì)胞色素c 的共固定化酶且確定了二氧化硅微粒子較大孔二氧化硅更有利于增強(qiáng)隨機(jī)共固定化酶的穩(wěn)定性。Lee 等[56]對(duì)活性炭表面進(jìn)行改性后通過(guò)雙功能試劑戊二醛制備得到雙脂肪酶共固定化催化劑。此共固定化酶可以作為大豆油和藻油等制備生物柴油燃料的催化劑，其催化大豆油轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5%且重復(fù)使用20 個(gè)循環(huán)后催化活性仍保留80%以上。

鎖定酶在載體上的空間位置不僅有利于提高共固定化酶的催化活性和產(chǎn)物的產(chǎn)率，還有利于提高酶穩(wěn)定性[57]。Jia 等[58]借鑒自然界中高度協(xié)同催化機(jī)制的思路，設(shè)計(jì)了一種仿生雙功能化納米反應(yīng)器，用以修飾的聚苯乙烯載體，依次將模型酶HRP 和GOD 實(shí)現(xiàn)有序共固定化，該固定化酶轉(zhuǎn)化葡萄糖效率較是游離型混合酶提高一倍。García 等[59]的研究表明被同時(shí)均勻地固定在載體孔道中的雙酶催化效率顯著高于分層固定的雙酶，具體表現(xiàn)為共定位制備的胺氧化酶和過(guò)氧化物酶復(fù)合物消除中間產(chǎn)物H2O2的速率較分層固定化多酶提高七倍。由于雙酶分子位置距離很短，能夠快速消耗H2O2，抑制其泄露，所以共定位雙酶降解組胺的效率得到顯著提高。

共價(jià)固定化技術(shù)涉及到酶分子與載體官能團(tuán)的反應(yīng)，在一定程度上會(huì)改變酶蛋白構(gòu)象或阻塞底物通道增大空間位阻，這些問(wèn)題的存在將不利于制備高活性的固定化酶。為更好地保留酶催化活性，研究人員嘗試將載體與遠(yuǎn)離酶催化中心的官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合。Viswanath等[60]首先將枯草桿菌蛋白酶上遠(yuǎn)離催化中心的氨基酸殘基突變?yōu)榘腚装彼?，再借助半胱氨酸與載體膜共價(jià)結(jié)合制得定向固定化酶，其催化活性是隨機(jī)固定化酶的約1.7 倍。Wu 等[61]利用蛋白質(zhì)殘基顯式共價(jià)固定以增強(qiáng)穩(wěn)定性（Protein Residue-Explicit Covalent Immobilization for Stability Enhancement，PRECISE）系統(tǒng)應(yīng)用于模型酶T4 溶菌酶，通過(guò)遠(yuǎn)離酶活性中心的亮氨酸殘基將酶分子定向固定在免疫磁珠上，在變性條件下測(cè)試固定在離活性位點(diǎn)最近和較遠(yuǎn)位置的固定化酶的活性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明，可控方向的共價(jià)固定化技術(shù)較傳統(tǒng)隨機(jī)共價(jià)固定化技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)。將此策略用于多酶固定化以此來(lái)提升生物酶催化效率。因固定化甲酸脫氫酶催化活性中心與底物的接觸通道受限于活性位點(diǎn)附近的半胱氨酸殘基從而降低了固定化甲酸脫氫酶的活性，Gao 等[62]首先使用定向進(jìn)化技術(shù)獲得甲酸脫氫酶的突變體的C242A/C275V/C363V/K389C解除限制。再以聚多巴胺包裹的四氧化三鐵納米粒子共固定突變體和亮氨酸脫氫酶，結(jié)果表明目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-叔亮氨酸合成的產(chǎn)率提高至少4 倍。

交聯(lián)酶聚集體技術(shù)是其中一種無(wú)載體酶固定化方法，降低了對(duì)高純酶的依賴性和減少了非催化基質(zhì)的引入。該技術(shù)是酶蛋白分子在蛋白變性劑（硫酸銨、1-丙醇、二甲基酮等）的作用下發(fā)生集聚，再通過(guò)交聯(lián)劑（如1,5-戊二醛）的作用將蛋白交織得到固定化酶。此后研究者也常常借助磁性粒子等制備負(fù)載型酶交聯(lián)聚集體來(lái)提高固定化酶的機(jī)械性能。例如，Hu 等[63]直接利用超聲破碎后的含有重組羰基還原酶和重組葡萄糖脫氫酶的粗酶液，以丙酮為變性劑、戊二醛為交聯(lián)劑制備共交聯(lián)酶聚集體。該聚集體可以催化潛手性酮還原合成(S)-1-(2,6-氯-3-氟)-苯基乙醇，循環(huán)7 次后其催化活性仍大于80%。Periyasamy 等[64]探討了木聚糖酶，纖維素酶和β-1,3-葡聚糖酶的共交聯(lián)酶聚集體的制備、表征與應(yīng)用，制備的共交聯(lián)酶聚集體可實(shí)現(xiàn)甘蔗渣向單糖的一鍋法轉(zhuǎn)化，且較游離混合酶具有更高的熱穩(wěn)定性，在重復(fù)使用6 批次后聚集體的催化活性仍保留約90%。為提高聚集體與反應(yīng)體系的分離效率，增強(qiáng)循環(huán)使用的實(shí)用性，Su 等[65]制備了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的磁性共交聯(lián)酶聚集體，該聚集體不僅具有高底物濃度的耐受性和優(yōu)良的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，而且在多批次反應(yīng)中依靠外加磁場(chǎng)作用即可完成固定化酶的無(wú)損回收。

4 基于特異性組裝的共固定化納米酶

在自然界中存在大量的可通過(guò)非共價(jià)作用實(shí)現(xiàn)精確自組裝的“納米機(jī)器”，如纖維素小體機(jī)器、信號(hào)通路蛋白骨架、分子伴侶蛋白等。采用生物大分子自我識(shí)別的策略制備固定化多酶，有利于構(gòu)建底物通道顯著提高級(jí)聯(lián)催化效率。研究者對(duì)天然“機(jī)器”的借鑒和改造已成功構(gòu)造出多酶高效催化體系。

纖維小體是自然界中存在于厭氧微生物的一種多酶復(fù)合體，具有錨定-粘附功能，包括粘連結(jié)構(gòu)域（Cohesin）和對(duì)接結(jié)構(gòu)域（Dockerin）。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域有著非常強(qiáng)的相互作用，Ka 可達(dá)109L/mol[66]。纖維小體具有模塊化、靈活性、自組裝、多重協(xié)同以及高效等優(yōu)點(diǎn)，在生物催化領(lǐng)域的應(yīng)用也愈加廣泛。Fan 等[67]成功在釀酒酵母的細(xì)胞表面上展示微纖維素體、DocI-1、DocI-2 和 Doc I-3 與內(nèi)切葡聚糖酶（Endo-1,4-β-D-Glucanohydrolase，EG），纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolase，CBH）和β-葡糖苷酶（β-D-Glucosidase，BGL）融合，這些融合酶可通過(guò)特定位點(diǎn)V5 錨定在酵母表面。該酵母展示系統(tǒng)被用來(lái)發(fā)酵微晶纖維素直接合成生物乙醇，其在前4 d 的發(fā)酵合成速率較快，此時(shí)反應(yīng)體系中積累的乙醇濃度達(dá)到1 412 mg/L，但是發(fā)酵后期產(chǎn)物生物乙醇被用作碳源而消耗。Tang 等[68]也構(gòu)建了酵母表面展示纖維小體系統(tǒng)用于分解纖維素直接制備生物乙醇，是首次借助二硫鍵構(gòu)建新型合成纖維體，是將三個(gè)融合蛋白BGL、EG和CBH 通過(guò)亞基Aga1p 與酵母菌表面的亞基Aga2p自組裝。

尋求可設(shè)計(jì)和表征的生物構(gòu)件是生物催化領(lǐng)域中創(chuàng)造新生物“機(jī)器”的發(fā)展趨勢(shì)，如利用模塊化結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)改變酶化學(xué)計(jì)量以此來(lái)解除生物催化限速步驟提高代謝通路的效率。目前用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞通路的信號(hào)配體與受體蛋白具有特異性結(jié)合的性質(zhì)，因此生物催化領(lǐng)域視其為理想的多酶自組裝系統(tǒng)之一。較常見(jiàn)的有GBD 結(jié)構(gòu)域（Gelatin Binding Domain）和PDZ結(jié)構(gòu)域（Postsynaptic Density Protein of 95 Kilodaltons，Disc Large，Zona Occludens-1）[69]。Moon 等[70]在研究中以成功構(gòu)建的含有自組裝元件GBD、SH3（Sarcoma Homology 3）和PDZ 的蛋白支架分別與醛酸脫氫酶，肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇氧化酶靶向結(jié)合從而構(gòu)建多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)器用于催化合成D-葡糖二酸。通過(guò)調(diào)控蛋白骨架上SH3 和PDZ的比例與數(shù)量所構(gòu)建的新型組合多酶機(jī)器在一定程度上緩解了肌醇加氧酶由于肌醇底物濃度的影響所導(dǎo)致的催化限速，因此肌醇加氧酶的催化活性得到提高。該催化體系中D-葡萄糖二酸的積累量較未安裝酶蛋白支架的提高約5 倍。此外蛋白骨架結(jié)構(gòu)的改變?cè)鰪?qiáng)了肌醇氧化酶的穩(wěn)定性。Baek 等[71]利用代謝過(guò)程改造大腸桿菌并聯(lián)合合成支架蛋白共同建立一種丁酸合成途徑：自組裝元件GBD、SH3 和PDZ的蛋白骨架與3-羥基丁酰輔酶A 脫氫酶、3-羥基丁酰輔酶A 脫水酶和反式烯酰輔酶A 還原酶靶向結(jié)合。最終工程菌代謝葡萄糖轉(zhuǎn)化為丁酸鹽的產(chǎn)量提升3 倍，采用葡萄糖流加發(fā)酵后其產(chǎn)量達(dá)7.2 g/L。

通過(guò)基因工程技術(shù)將CnaB2 結(jié)構(gòu)域拆分可得到自組裝結(jié)構(gòu)單元SpyCatcher 和SpyTag，兩個(gè)元件借助蛋白分子上的賴氨酸殘基和短肽鏈上的天冬氨酸殘基自催化形成的異肽鍵在自然生理?xiàng)l件下元件即可完成自組裝[72]。該自催化反應(yīng)特異性強(qiáng)、反應(yīng)速率快、元件以共價(jià)鍵耦合、對(duì)反應(yīng)體系pH 和溫度適應(yīng)性強(qiáng)，這使它們成為仿生催化研究中理想的操作元件[73]。例如，Shen等[74]將麥芽寡糖基海藻糖合酶（Maltooligosyltrehalose Synthase，MTS）和麥芽寡糖基海藻糖海藻水解酶（Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase，MTH）通過(guò)SpyCatcher 和SpyTag 之間形成的異肽鍵自組裝成超分子多酶復(fù)合物（MTS-MTH）。催化結(jié)果表明蛋白質(zhì)-肽相互作用自組裝形成的復(fù)合酶催化效率顯著高于游離混合酶。Lim 等[75]開(kāi)發(fā)出一種可用于酶固定化的通用型自組裝酶支架平臺(tái)，即絲狀伴侶蛋白（Gamma-Prefoldin，γ-PFD）。然后將SpyTag 與γ-PFD融合表達(dá)得到γ-PFD-SpyTag，通過(guò)自組裝反應(yīng)與SpyCatcher-GOx 和SpyCatcher-HRP 共固定化。借助SpyTag 與SpyCatcher 共價(jià)偶聯(lián)形成有序、效率高且穩(wěn)定性強(qiáng)的超分子復(fù)合酶可作為一種通用型多酶固定化策略。但是此種寡聚酶因無(wú)載體機(jī)械性能較差，通常使用高速冷凍離心機(jī)或超濾裝置實(shí)現(xiàn)循環(huán)使用，這不僅增加其制備成本，也加大在工業(yè)應(yīng)用中的操作難度[76]。探究負(fù)載型自組裝寡聚酶技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用能夠有效地提高生物催化劑的制備效率，并在一定程度上拓寬體外多酶級(jí)聯(lián)的應(yīng)用范圍。

5 總結(jié)與展望

醫(yī)藥合成、精細(xì)化學(xué)品、食品、化妝品等的工業(yè)化生產(chǎn)往往需要兩種及以上的生物酶催化。將參與反應(yīng)的多酶進(jìn)行設(shè)計(jì)組合從而構(gòu)建底物通道是提高生產(chǎn)效率的有效措施。多酶固定化技術(shù)隨著蛋白質(zhì)工程、代謝工程、高分子材料等領(lǐng)域的發(fā)展而日新月異，對(duì)高效催化體系的構(gòu)建有著巨大的貢獻(xiàn)。眾多研究人員在新型固定化策略的研發(fā)過(guò)程中不斷突破傳統(tǒng)方式的局限性，如多酶固定化方式由基于普適性思維設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)單一方式向多維度固定化方式發(fā)展，甚至可以根據(jù)酶特性設(shè)計(jì)出具有針對(duì)性的新型固定化方案。另外，研究者不斷開(kāi)發(fā)出基于納米材料的具有較大比表面積的負(fù)載型固定化酶和無(wú)載體自組裝納米酶。由于多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)涉及酶的種類多樣，在實(shí)際固定化應(yīng)用中不僅需要對(duì)酶結(jié)構(gòu)和功能加以考慮而且酶反應(yīng)順序也不可忽略。多酶固定化發(fā)展趨勢(shì)偏向“智能化”，如酶蛋白自組裝技術(shù)，但是高端智能技術(shù)的發(fā)展仍需結(jié)合傳統(tǒng)固定化技術(shù)才有利于制備得到活性更高、耐用性更好的固定化多酶催化劑。