張燚格，何妙嬴，柳冬冬，李 丹，張程程，ZAIN UR Rehman(巴基斯坦)，王 超

(湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208)

心肌缺血屬于中醫(yī)理論中“胸痹”范疇，臨床上主要有胸痛、胸悶、氣短、心律失常等表現(xiàn)。本病的典型表現(xiàn)及相關記載出現(xiàn)在較早的古籍中，歷代醫(yī)家在繼承前人醫(yī)學理論的基礎上，明確提出胸痹應重扶陽，調氣血的觀點，確立溫陽散寒、補氣助陽、通陽宣痹、回陽救逆四種扶陽方法。針刺療法的傳承歷史悠久，《內經(jīng)》中對于胸痹的論治較為簡單，多采取刺法，治療思路多從經(jīng)論治，常選取手少陰心經(jīng)、手太陽小腸經(jīng)腧穴，若兼見其他臟腑癥狀，取相關經(jīng)脈進行治療[1]。心肌缺血再灌注(MIRI)損傷作為引起心血管疾病的關鍵原因，與冠狀動脈閉塞相關疾病具有相關性。缺血再灌注損傷引起的心肌受損是冠狀動脈疾病的主要病理表現(xiàn)，其機制是缺血期間積聚的物質與再灌注傳遞物質之間的相互作用所致。因此，減輕缺血再灌注損傷是改善心肌缺血的重要目的[2-4]。針灸預處理是近年來預防醫(yī)學領域中一種安全、有效防治疾病的手段。實驗研究表明，針灸預處理可以對心、腦、胃腸等部位發(fā)生的缺血缺氧形成良好保護作用[5-6]。通過調動人體各種自我反饋和調節(jié)機制，啟動機體內源性保護機制，發(fā)揮預防和治療保護效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針預處理內關穴對MIRI模型大鼠具有預保護作用，且電針與艾灸均具有延遲保護作用，這種保護作用還存在時間差異[7-9]。不同時間點電針預處理內關穴對MIRI模型大鼠的影響，缺乏實驗觀察數(shù)據(jù)支撐。因此，本文將從不同時間點對針刺時間效應及其變化規(guī)律進行初步探討，尋求最佳針刺時間窗，為臨床MIRI預防、治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級的SD雄性大鼠48只，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[動物合格證SYXK(湘)2019-0004]，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度為50%～70%，大鼠體重200～250 g。使用自然光和黑暗交替周期采光，自由獲得標準飼料、自來水。實驗過程中，對動物的處理遵循科技部頒布的《實驗動物管理條例》[10]。

1.1.2 實驗儀器：小動物呼吸機 220V(型號HX-101E，成都泰盟軟件有限公司)；數(shù)字心電圖機(型號ECG-2303B，廣州市三銳電子科技有限公司)；華佗牌電子針療儀(型號SDZ-Ⅱ新款，蘇州醫(yī)療用品有限公司)；熒光定量PCR儀器(型號ABI 7500)；脫水機(型號JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司)；小型板式離心機(批號Minip-2500，杭州米歐儀器有限公司)；酶標檢測儀(型號Rt2100c，Rayto公司)；電泳儀(型號DYY-6C，北京六一儀器廠)。

1.1.3 實驗試劑：二甲苯(批號10023418，國藥集團化學試劑有限公司)；無水乙醇(批號100092683，國藥集團化學試劑有限公司)；超純總RNA提取試劑盒(批號CW0581S，康為世紀生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法：以SD大鼠為實驗對象，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg進行麻醉，仰臥位固定。術前連接心電圖，對心電圖不符合標準者不予納入數(shù)據(jù)。將大鼠的頸前和胸前區(qū)去毛，消毒，氣管插管后接小動物人工呼吸機(潮氣量20～30 ml/kg、呼吸頻率70～80 次/min)。沿胸骨正中線左側約4～5 mm處切開皮膚，在第3～4肋骨處打開胸部以暴露心臟。沿左側第4、5肋骨間打開胸腔，心臟打開后，剪開心包膜，抬起左心耳，在冠狀動脈左前降支上1/3處穿線并結扎0號線。心電圖ST段變化及冠狀動脈向外膨脹發(fā)紺作為結扎成功的標志。結扎后40 min，松開結扎線，對左前降支進行60 min灌流。每組造模結束后立即從腹主動脈取血3～5 ml，取出心臟。

1.2.2 穴位定位及干預方法：參照《常用實驗動物穴位的標準化定位方法研究》[11]中“常用實驗動物的針灸穴位”定位法，內關穴位于前肢內側的尺骨、橈骨縫之間，距腕關節(jié)3 mm左右。行提插捻轉手法大約1 min后接電針(在穴位旁0.1 cm刺入一輔助針)，疏密波，強度以大鼠能耐受且雙上肢輕微顫動為度，持續(xù)30 min，1次/d。

1.2.3 檢測指標及方法：石蠟切片經(jīng)烘烤、脫蠟、水化后進行HE染色，脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)學變化。將心肌組織進行勻漿處理，提取總RNA。參照試劑盒說明書，對RNA進行反轉錄處理，取0.2 ml的PCR管，制備相應的反應體系進行熒光定量PCR法(qRT-PCR)法。反應條件：95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，共循環(huán)40次。用2-△△Ct法對結果進行處理，各基因引物序列見表1。對大鼠心肌組織進行細胞總蛋白提取，采用BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳；轉膜，轉好的膜用5%脫脂牛奶(0.5%TBST配)。室溫下脫色搖床封閉1 h，一抗稀釋后在室溫下脫色搖床用TBST洗3次，5 min/次。二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，在室溫下脫色搖床用TBST洗3次，5 min/次。凝膠圖像分析：PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值情況。

表1 各基因PCR引物序列(5’→3’)

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組內比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，對不符合正態(tài)性、方差齊性的資料，采用非參數(shù)秩和檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理切片形態(tài)學比較 見圖1?？瞻捉M：心肌纖維排列整齊、清晰、細胞核較均勻，線粒體無破壞、無腫脹、無空泡化，未見自噬小體的形成。第3、7天之間無明顯區(qū)別。假手術組：心肌組織結構基本完整，細胞形態(tài)大體正常，排列有序，可見清晰完整的細胞核。第3、7天之間無明顯區(qū)別。模型組：第3天大鼠心肌纖維順序排列不整齊，細胞結構斷裂損害嚴重，細胞核表現(xiàn)不規(guī)則，線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化，細胞水腫加劇，變性明顯，形成自噬泡；第7天心肌組織細胞紊亂，心肌纖維斷裂，損害較嚴重，線粒體空泡化嚴重，結構模糊，自噬泡仍存在，與第3天相比，損傷程度略有下降。內關組：第3天大鼠心肌纖維排列略整齊，線粒體出現(xiàn)受損，少量細胞結構有損傷、空泡化，出現(xiàn)自噬小體；第7天心肌細胞受損不甚嚴重，少量線粒體被破壞，心肌細胞水腫不甚嚴重，與第3天相比，心肌間質和血管炎癥浸潤性損傷的程度得到明顯減少。

A：空白組；B：模型組；C：內關組；D：假手術組

2.2 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表達各項比較 見表2。第3天時，空白組與假手術組各項比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表達高于假手術組，內關組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。第7天時，空白組與假手術組各項比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA表達均高于假手術組；內關組各指標mRNA表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表達比較

2.3 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達各項比較 見表3(圖2、3)。第3天時，空白組與假手術組各項比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組大鼠心肌組織Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ蛋白表達水平高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；內關組Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ蛋白表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。第7天，空白組與假手術組各項比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組大鼠的心肌組織Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；內關組Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

表3 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 蛋白表達比較

A：空白組；B：模型組；C：內關組；D：假手術組

A：空白組；B：模型組；C：內關組；D：假手術組

3 討 論

本實驗依據(jù)中醫(yī)“治未病”理論，采用電針內關穴預處理的實驗方法探討預防和治療心肌缺血再灌注損傷，針灸預處理是傳統(tǒng)中醫(yī)學治未病的主要措施之一[12-13]?！鹅`樞》曰：“上工，刺其未生者也﹔其次，刺其未盛者也;其次，刺其已衰者也?！北辛恕拔床∠确?，既病防變”的醫(yī)學宗旨。大量文獻研究表明，中藥有效提取物和中醫(yī)復方能抑制氧自由基形成，抑制炎癥反應，繼而保護受損心肌細胞，抵抗心肌缺血傷害。針灸預處理具有無創(chuàng)傷、綠色健康、見效快等優(yōu)勢，成為現(xiàn)代醫(yī)學研究熱門。古代醫(yī)家治療胸痹，選穴主要集中在特定穴，如五輸穴、原穴、募穴、特定穴等，體現(xiàn)了循經(jīng)取穴原則，其中手厥陰心包經(jīng)為治療胸痹選用頻次最多的經(jīng)脈[14]。內關穴是手厥陰心包經(jīng)的絡穴,通于陰維脈,對心胸疾病的治療與預防有良好效果。本課題組前期研究表明，針灸預處理內關穴可以在48 h的延遲時相階段，對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用[15-20]。同時，可增加內源性保護物質，并能誘導熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)家族中HSP27、HSP70 表達。在延遲時相階段，針灸發(fā)揮的進一步保護心臟作用表明了針灸預處理具有心臟保護效應。

自噬是利用溶酶體這一細胞器來自我降解和循環(huán)利用細胞內物質成分的過程。自噬是真核細胞所專有的,并且主要負責長壽命蛋白、細胞器的降解及再利用，在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[21]。心肌缺血是指由于心臟血流灌注減少等所致的供氧不足、能量代謝紊亂等病理狀態(tài)。自噬可以通過急性或慢性缺血被激活，再灌注過程將促使自噬體進一步形成。在應激情況下，自噬水平的高低將決定細胞的壞死或生存狀況。因此自噬對細胞具有“雙刃劍效應”。研究顯示，酵母ATG6基因的同源物Beclin-1能與Ⅲ類磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class Ⅲ，PI3K)結合形成復合物，同時能夠介導相關自噬蛋白在前自噬小體中的定位，調節(jié)自噬體的形成[22-23]。PI3K是哺乳動物參與調節(jié)自噬的特異性基因，其表達強度與自噬活性密切相關。因此,Beclin-1對自噬調節(jié)尤為重要。酵母自噬基因8(ATG8)在哺乳動物細胞中的同源基因為LC3，它存在于自噬體和溶酶體的膜上，自噬體以及溶酶體的數(shù)量可通過表達量的多少來反映。因此，LC3被視為自噬體的標志分子。本實驗通過觀察比較不同時間點上自噬基因Beclin-1和LC3的表達水平，反映自噬調控在不同時間點上的表達結果[24-25]。

本研究運用RT-PCR法、Western blotting法檢測自噬表達相關基因Beclin-1、LC3蛋白在心肌細胞中的表達水平，從結果來看模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I mRNA表達均高于空白組、假手術組。內關組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I mRNA表達量低于模型組，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I蛋白表達水平也低于模型組。內關組自噬蛋白表達水平在第7天的表達量低于第3天，說明在心肌缺血發(fā)生過程中，心肌細胞會因缺血缺氧而激活自噬發(fā)生，并誘發(fā)細胞凋亡的出現(xiàn)。電針預處理內關穴可通過下調LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達來抑制自噬激活，防止心肌細胞凋亡發(fā)生，保護心肌組織。本研究分別檢測了心肌缺血再灌注大鼠第3、7天心肌組織中自噬相關蛋白在不同時間點的表達水平，提示隨著損傷時間延長，自噬在蛋白表達上出現(xiàn)進行性下調[26]。自噬在心肌缺血再灌注中可能發(fā)揮著雙向調節(jié)作用，在不同治療時間點的作用機制也不同。

綜上所述,本實驗證實了電針預處理內關穴，可調節(jié)MIRI自噬水平，而Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達下調，表明其信號通路可能參與了自噬的調控作用。此外，通過對比不同時間點的表達效果，第7天效果最佳。由于動物實驗的局限性和本實驗選擇的時間點較少，檢測指標也僅局限于Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平，對相關信號通路的研究內容過少。留針時間的長短和針刺頻率的高低也是影響針灸效果的重要內容和關鍵因素。因此，針灸預處理的最佳時間點仍需進一步研究。