張燚格，何妙嬴，柳冬冬，李 丹，張程程，ZAIN UR Rehman(巴基斯坦)，王 超

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208)

心肌缺血屬于中醫(yī)理論中“胸痹”范疇，臨床上主要有胸痛、胸悶、氣短、心律失常等表現(xiàn)。本病的典型表現(xiàn)及相關(guān)記載出現(xiàn)在較早的古籍中，歷代醫(yī)家在繼承前人醫(yī)學(xué)理論的基礎(chǔ)上，明確提出胸痹應(yīng)重扶陽，調(diào)氣血的觀點，確立溫陽散寒、補氣助陽、通陽宣痹、回陽救逆四種扶陽方法。針刺療法的傳承歷史悠久，《內(nèi)經(jīng)》中對于胸痹的論治較為簡單，多采取刺法，治療思路多從經(jīng)論治，常選取手少陰心經(jīng)、手太陽小腸經(jīng)腧穴，若兼見其他臟腑癥狀，取相關(guān)經(jīng)脈進行治療[1]。心肌缺血再灌注(MIRI)損傷作為引起心血管疾病的關(guān)鍵原因，與冠狀動脈閉塞相關(guān)疾病具有相關(guān)性。缺血再灌注損傷引起的心肌受損是冠狀動脈疾病的主要病理表現(xiàn)，其機制是缺血期間積聚的物質(zhì)與再灌注傳遞物質(zhì)之間的相互作用所致。因此，減輕缺血再灌注損傷是改善心肌缺血的重要目的[2-4]。針灸預(yù)處理是近年來預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一種安全、有效防治疾病的手段。實驗研究表明，針灸預(yù)處理可以對心、腦、胃腸等部位發(fā)生的缺血缺氧形成良好保護作用[5-6]。通過調(diào)動人體各種自我反饋和調(diào)節(jié)機制，啟動機體內(nèi)源性保護機制，發(fā)揮預(yù)防和治療保護效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴對MIRI模型大鼠具有預(yù)保護作用，且電針與艾灸均具有延遲保護作用，這種保護作用還存在時間差異[7-9]。不同時間點電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴對MIRI模型大鼠的影響，缺乏實驗觀察數(shù)據(jù)支撐。因此，本文將從不同時間點對針刺時間效應(yīng)及其變化規(guī)律進行初步探討，尋求最佳針刺時間窗，為臨床MIRI預(yù)防、治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級的SD雄性大鼠48只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[動物合格證SYXK(湘)2019-0004]，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度為50%～70%，大鼠體重200～250 g。使用自然光和黑暗交替周期采光，自由獲得標準飼料、自來水。實驗過程中，對動物的處理遵循科技部頒布的《實驗動物管理條例》[10]。

1.1.2 實驗儀器：小動物呼吸機 220V(型號HX-101E，成都泰盟軟件有限公司)；數(shù)字心電圖機(型號ECG-2303B，廣州市三銳電子科技有限公司)；華佗牌電子針療儀(型號SDZ-Ⅱ新款，蘇州醫(yī)療用品有限公司)；熒光定量PCR儀器(型號ABI 7500)；脫水機(型號JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司)；小型板式離心機(批號Minip-2500，杭州米歐儀器有限公司)；酶標檢測儀(型號Rt2100c，Rayto公司)；電泳儀(型號DYY-6C，北京六一儀器廠)。

1.1.3 實驗試劑：二甲苯(批號10023418，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(批號100092683，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；超純總RNA提取試劑盒(批號CW0581S，康為世紀生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法：以SD大鼠為實驗對象，腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg進行麻醉，仰臥位固定。術(shù)前連接心電圖，對心電圖不符合標準者不予納入數(shù)據(jù)。將大鼠的頸前和胸前區(qū)去毛，消毒，氣管插管后接小動物人工呼吸機(潮氣量20～30 ml/kg、呼吸頻率70～80 次/min)。沿胸骨正中線左側(cè)約4～5 mm處切開皮膚，在第3～4肋骨處打開胸部以暴露心臟。沿左側(cè)第4、5肋骨間打開胸腔，心臟打開后，剪開心包膜，抬起左心耳，在冠狀動脈左前降支上1/3處穿線并結(jié)扎0號線。心電圖ST段變化及冠狀動脈向外膨脹發(fā)紺作為結(jié)扎成功的標志。結(jié)扎后40 min，松開結(jié)扎線，對左前降支進行60 min灌流。每組造模結(jié)束后立即從腹主動脈取血3～5 ml，取出心臟。

1.2.2 穴位定位及干預(yù)方法：參照《常用實驗動物穴位的標準化定位方法研究》[11]中“常用實驗動物的針灸穴位”定位法，內(nèi)關(guān)穴位于前肢內(nèi)側(cè)的尺骨、橈骨縫之間，距腕關(guān)節(jié)3 mm左右。行提插捻轉(zhuǎn)手法大約1 min后接電針(在穴位旁0.1 cm刺入一輔助針)，疏密波，強度以大鼠能耐受且雙上肢輕微顫動為度，持續(xù)30 min，1次/d。

1.2.3 檢測指標及方法：石蠟切片經(jīng)烘烤、脫蠟、水化后進行HE染色，脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化。將心肌組織進行勻漿處理，提取總RNA。參照試劑盒說明書，對RNA進行反轉(zhuǎn)錄處理，取0.2 ml的PCR管，制備相應(yīng)的反應(yīng)體系進行熒光定量PCR法(qRT-PCR)法。反應(yīng)條件：95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，共循環(huán)40次。用2-△△Ct法對結(jié)果進行處理，各基因引物序列見表1。對大鼠心肌組織進行細胞總蛋白提取，采用BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂牛奶(0.5%TBST配)。室溫下脫色搖床封閉1 h，一抗稀釋后在室溫下脫色搖床用TBST洗3次，5 min/次。二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，在室溫下脫色搖床用TBST洗3次，5 min/次。凝膠圖像分析：PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值情況。

表1 各基因PCR引物序列(5’→3’)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，對不符合正態(tài)性、方差齊性的資料，采用非參數(shù)秩和檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理切片形態(tài)學(xué)比較 見圖1?？瞻捉M：心肌纖維排列整齊、清晰、細胞核較均勻，線粒體無破壞、無腫脹、無空泡化，未見自噬小體的形成。第3、7天之間無明顯區(qū)別。假手術(shù)組：心肌組織結(jié)構(gòu)基本完整，細胞形態(tài)大體正常，排列有序，可見清晰完整的細胞核。第3、7天之間無明顯區(qū)別。模型組：第3天大鼠心肌纖維順序排列不整齊，細胞結(jié)構(gòu)斷裂損害嚴重，細胞核表現(xiàn)不規(guī)則，線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化，細胞水腫加劇，變性明顯，形成自噬泡；第7天心肌組織細胞紊亂，心肌纖維斷裂，損害較嚴重，線粒體空泡化嚴重，結(jié)構(gòu)模糊，自噬泡仍存在，與第3天相比，損傷程度略有下降。內(nèi)關(guān)組：第3天大鼠心肌纖維排列略整齊，線粒體出現(xiàn)受損，少量細胞結(jié)構(gòu)有損傷、空泡化，出現(xiàn)自噬小體；第7天心肌細胞受損不甚嚴重，少量線粒體被破壞，心肌細胞水腫不甚嚴重，與第3天相比，心肌間質(zhì)和血管炎癥浸潤性損傷的程度得到明顯減少。

A：空白組；B：模型組；C：內(nèi)關(guān)組；D：假手術(shù)組

2.2 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表達各項比較 見表2。第3天時，空白組與假手術(shù)組各項比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表達高于假手術(shù)組，內(nèi)關(guān)組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第7天時，空白組與假手術(shù)組各項比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA表達均高于假手術(shù)組；內(nèi)關(guān)組各指標mRNA表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA表達比較

2.3 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達各項比較 見表3(圖2、3)。第3天時，空白組與假手術(shù)組各項比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組大鼠心肌組織Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ蛋白表達水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；內(nèi)關(guān)組Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ蛋白表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。第7天，空白組與假手術(shù)組各項比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組大鼠的心肌組織Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；內(nèi)關(guān)組Beclin-1、LC 3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。

表3 各組大鼠心肌組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 蛋白表達比較

A：空白組；B：模型組；C：內(nèi)關(guān)組；D：假手術(shù)組

A：空白組；B：模型組；C：內(nèi)關(guān)組；D：假手術(shù)組

3 討 論

本實驗依據(jù)中醫(yī)“治未病”理論，采用電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理的實驗方法探討預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷，針灸預(yù)處理是傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)治未病的主要措施之一[12-13]?！鹅`樞》曰：“上工，刺其未生者也﹔其次，刺其未盛者也;其次，刺其已衰者也?！北辛恕拔床∠确?，既病防變”的醫(yī)學(xué)宗旨。大量文獻研究表明，中藥有效提取物和中醫(yī)復(fù)方能抑制氧自由基形成，抑制炎癥反應(yīng)，繼而保護受損心肌細胞，抵抗心肌缺血傷害。針灸預(yù)處理具有無創(chuàng)傷、綠色健康、見效快等優(yōu)勢，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究熱門。古代醫(yī)家治療胸痹，選穴主要集中在特定穴，如五輸穴、原穴、募穴、特定穴等，體現(xiàn)了循經(jīng)取穴原則，其中手厥陰心包經(jīng)為治療胸痹選用頻次最多的經(jīng)脈[14]。內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴,通于陰維脈,對心胸疾病的治療與預(yù)防有良好效果。本課題組前期研究表明，針灸預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴可以在48 h的延遲時相階段，對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用[15-20]。同時，可增加內(nèi)源性保護物質(zhì)，并能誘導(dǎo)熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)家族中HSP27、HSP70 表達。在延遲時相階段，針灸發(fā)揮的進一步保護心臟作用表明了針灸預(yù)處理具有心臟保護效應(yīng)。

自噬是利用溶酶體這一細胞器來自我降解和循環(huán)利用細胞內(nèi)物質(zhì)成分的過程。自噬是真核細胞所專有的,并且主要負責長壽命蛋白、細胞器的降解及再利用，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[21]。心肌缺血是指由于心臟血流灌注減少等所致的供氧不足、能量代謝紊亂等病理狀態(tài)。自噬可以通過急性或慢性缺血被激活，再灌注過程將促使自噬體進一步形成。在應(yīng)激情況下，自噬水平的高低將決定細胞的壞死或生存狀況。因此自噬對細胞具有“雙刃劍效應(yīng)”。研究顯示，酵母ATG6基因的同源物Beclin-1能與Ⅲ類磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class Ⅲ，PI3K)結(jié)合形成復(fù)合物，同時能夠介導(dǎo)相關(guān)自噬蛋白在前自噬小體中的定位，調(diào)節(jié)自噬體的形成[22-23]。PI3K是哺乳動物參與調(diào)節(jié)自噬的特異性基因，其表達強度與自噬活性密切相關(guān)。因此,Beclin-1對自噬調(diào)節(jié)尤為重要。酵母自噬基因8(ATG8)在哺乳動物細胞中的同源基因為LC3，它存在于自噬體和溶酶體的膜上，自噬體以及溶酶體的數(shù)量可通過表達量的多少來反映。因此，LC3被視為自噬體的標志分子。本實驗通過觀察比較不同時間點上自噬基因Beclin-1和LC3的表達水平，反映自噬調(diào)控在不同時間點上的表達結(jié)果[24-25]。

本研究運用RT-PCR法、Western blotting法檢測自噬表達相關(guān)基因Beclin-1、LC3蛋白在心肌細胞中的表達水平，從結(jié)果來看模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I mRNA表達均高于空白組、假手術(shù)組。內(nèi)關(guān)組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I mRNA表達量低于模型組，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3I蛋白表達水平也低于模型組。內(nèi)關(guān)組自噬蛋白表達水平在第7天的表達量低于第3天，說明在心肌缺血發(fā)生過程中，心肌細胞會因缺血缺氧而激活自噬發(fā)生，并誘發(fā)細胞凋亡的出現(xiàn)。電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴可通過下調(diào)LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達來抑制自噬激活，防止心肌細胞凋亡發(fā)生，保護心肌組織。本研究分別檢測了心肌缺血再灌注大鼠第3、7天心肌組織中自噬相關(guān)蛋白在不同時間點的表達水平，提示隨著損傷時間延長，自噬在蛋白表達上出現(xiàn)進行性下調(diào)[26]。自噬在心肌缺血再灌注中可能發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)作用，在不同治療時間點的作用機制也不同。

綜上所述,本實驗證實了電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴，可調(diào)節(jié)MIRI自噬水平，而Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達下調(diào)，表明其信號通路可能參與了自噬的調(diào)控作用。此外，通過對比不同時間點的表達效果，第7天效果最佳。由于動物實驗的局限性和本實驗選擇的時間點較少，檢測指標也僅局限于Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平，對相關(guān)信號通路的研究內(nèi)容過少。留針時間的長短和針刺頻率的高低也是影響針灸效果的重要內(nèi)容和關(guān)鍵因素。因此，針灸預(yù)處理的最佳時間點仍需進一步研究。