陳耀華 豆亞偉

(陜西省人民醫(yī)院胸外科，陜西省西安市 710068)

肺癌是病死率極高的惡性腫瘤，占所有癌癥類型的26%～29%，其中肺腺癌是肺癌最常見的類型[1]。研究顯示，免疫抑制在肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，腫瘤細(xì)胞可以通過分泌白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等因子促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移并抑制免疫細(xì)胞活性[2-3]。Notch通路可介導(dǎo)肺癌細(xì)胞的免疫抑制，與肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)具有交聯(lián)和聚集整聯(lián)蛋白的能力，其不但可以調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，還可通過與整合素共同作用來介導(dǎo)細(xì)胞的遷移[5]。臨床研究顯示，Gal-3的高表達(dá)與肺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[6]。還有研究顯示，口服活性Gal-3拮抗劑可以抑制肺癌的進(jìn)展[7]。這些研究均提示Gal-3參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展，且與預(yù)后密切相關(guān)，但是其對(duì)肺癌進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。故本文探討Gal-3對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為及免疫相關(guān)因子的影響，并基于Notch信號(hào)通路分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人肺癌細(xì)胞A549(美國ATCC?CCL-185)，胎牛血清和鏈-青霉素(Invitrogen公司，批號(hào)：20200612、20200709)，DMEM(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：20210116007)。Gal-3過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：200315001、200402003)，LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司，批號(hào)：20021809)，Notch信號(hào)通路抑制劑LY450139(Selleck公司，批號(hào)：191209004)，Gal-3一抗、Notch受體1(Notch receptor 1,NOTCH1)一抗、Gal-3和NOTCH1相應(yīng)二抗(Abcam公司，批號(hào)：191106003、200123009、200322008、191226011)，硝酸纖維素膜(Millipore公司，批號(hào)：200112002)，ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：19110302)，Annexin Ⅴ-FITC試劑盒和碘化丙啶試劑盒(YEASEN公司，批號(hào)：190912003、200423021)。TRIzol試劑和RNAspin Mini試劑盒(QIAGEN GmbH公司，批號(hào)：200413、200510)，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：200318001)。流式細(xì)胞儀(BD公司，型號(hào)：BD-FACSAriaTMFusion)，基質(zhì)膠和Transwell裝置(Corning公司，批號(hào)：20200112、20200203)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，型號(hào)：BX53)。

1.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的完全DMEM，置于37 ℃、95%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%后，將A549細(xì)胞分為4組，即對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒)、Gal-3組(轉(zhuǎn)染Gal-3過表達(dá)質(zhì)粒)、LY450139組(給予2 μL終濃度為20 nmol/L的Notch信號(hào)通路抑制劑LY450139處理)、Gal-3+LY450139組(轉(zhuǎn)染Gal-3過表達(dá)質(zhì)粒，并給予2 μL終濃度為20 nmol/L的LY450139處理)。轉(zhuǎn)染操作過程均嚴(yán)格根據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)的檢測(cè)方法

1.3.1 Western blot檢測(cè)Gal-3和NOTCH1蛋白表達(dá)水平：取轉(zhuǎn)染72 h后的各組細(xì)胞，裂解后于4 ℃下12 000 r/min離心5min，收集總蛋白。取40 μg蛋白，通過10% SDS-PAGE分離等量蛋白，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，加入5 μL Gal-3一抗、5 μL NOTCH1一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育8 h，TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL相應(yīng)二抗(稀釋比均為1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。利用ECL顯色試劑盒對(duì)條帶進(jìn)行顯影。以GAPDH(稀釋比為1 ∶10 000)作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析Gal-3和NOTCH1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：取轉(zhuǎn)染72 h后的各組細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，置于37 ℃、95%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱，分別孵育24 h、48 h后加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：將轉(zhuǎn)染72 h后的各組細(xì)胞用1×PBS洗滌并懸浮在100 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶，室溫下避光孵育10～15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將基質(zhì)膠(稀釋比為1 ∶8)加入Transwell小室的上室并在 37 ℃下孵育30 min。將600 μL完全DMEM加入Transwell小室的下室。取轉(zhuǎn)染72 h后的各組細(xì)胞，于無血清培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)24 h進(jìn)行饑餓處理。使用胰酶消化后，將100 μL 細(xì)胞溶液(5×105個(gè)/mL)接種于水合的 Transwell 小室上室中，置于37 ℃、95%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，洗去未侵入的細(xì)胞。用95%乙醇固定侵入下室的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫在室溫下染色20 min。置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-6和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平：取轉(zhuǎn)染72 h后的各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。使用RNAspin Mini試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用 SYBR Premix Ex TaqTM進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。IL-6上游引物序列為5′-TCAATGAGGAGACTTGCCTG-3′，下游引物序列為5′-GATGAGTTGTCATGTCCTGC-3′；TGF-β1上游引物序列為5′-CACCCGCGTGCTAATGG-3′，下游引物序列為5′-ATGCTGTGTGTACTCTGCTTGAACT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，上游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。反應(yīng)體系(共50 μL)包括SYBR Green染料10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、dNTP 0.5 μL、Taq酶1 μL、模板DNA 5 μL、ddH2O 32.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min預(yù)加熱； 95 ℃ 2 min，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s， 共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-6和TGF-β1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組A549細(xì)胞Gal-3和NOTCH1蛋白表達(dá)水平的比較 4組A549細(xì)胞Gal-3和NOTCH1蛋白表達(dá)水平的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，Gal-3組的Gal-3和NOTCH1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組；LY450139組的Gal-3蛋白表達(dá)水平低于Gal-3組，NOTCH1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組和Gal-3組；Gal-3+LY450139組的Gal-3蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組和LY450139組，NOTCH1蛋白表達(dá)水平低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞Gal-3和NOTCH1蛋白表達(dá)情況

表1 4組A549細(xì)胞Gal-3和NOTCH1蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 4組A549細(xì)胞增殖活力的比較 孵育24 h、48 h后，4組A549細(xì)胞的增殖活力比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中孵育24 h、48 h后，Gal-3組的增殖活力均高于對(duì)照組，LY450139組的增殖活力低于對(duì)照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的增殖活力低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)。見表2。

表2 4組A549細(xì)胞增殖活力的比較(x±s，光密度值)

2.3 4組A549細(xì)胞凋亡率的比較 4組A549細(xì)胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，Gal-3組的凋亡率低于對(duì)照組，LY450139組的凋亡率高于對(duì)照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的凋亡率高于Gal-3組，但低于LY450139組(均P<0.05)。見圖2、表3。

對(duì)照組 Gal-3組 LY450139組 Gal-3+LY450139組

表3 4組A549細(xì)胞凋亡率的比較(x±s，%)

2.4 4組A540細(xì)胞侵襲能力的比較 4組A549細(xì)胞的侵襲能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，Gal-3組的侵襲能力高于對(duì)照組，LY450139組的侵襲能力低于對(duì)照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的侵襲能力低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)。見圖3、表4。

對(duì)照組 Gal-3組 LY450139組 Gal-3+LY450139組

表4 4組A549細(xì)胞侵襲能力的比較(x±s，個(gè))

2.5 4組A549細(xì)胞免疫相關(guān)因子表達(dá)水平的比較 4組A549細(xì)胞的IL-6和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，Gal-3組的IL-6和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，LY450139組的IL-6和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組和Gal-3組，Gal-3+LY450139組的IL-6和TGF-β1 mRNA水平低于Gal-3組，但高于LY450139組(均P<0.05)。見表5。

表5 4組A549細(xì)胞免疫相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，全球每年新發(fā)肺癌患者約210萬例，死于肺癌的患者約176萬例，在所有惡性腫瘤中其發(fā)病率居于前列[8]。雖然近年來有新的治療方法應(yīng)用于臨床，但肺癌患者的預(yù)后仍不盡如人意，其5年總體生存率僅為15%左右[9]。因此分析肺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制對(duì)于臨床診斷和治療肺癌具有重要意義。

Gal-3是一種由LGALS3基因編碼的多功能蛋白，屬于β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族成員。作為一種胞質(zhì)蛋白，Gal-3能輕易穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞核和線粒體，從而調(diào)節(jié)多種生物過程[10]。大量研究表明，Gal-3可以調(diào)控血管生成、免疫抑制和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等過程，在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。還有研究顯示，Gal-3在結(jié)直腸癌[13]、前列腺癌[14]、胰腺癌[15]等腫瘤中發(fā)揮介導(dǎo)免疫抑制和促進(jìn)癌癥進(jìn)展的作用。臨床研究顯示，Gal-3表達(dá)水平與肺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]。體外研究顯示，Gal-3抑制劑可以增強(qiáng)程序性死亡受體配體1阻斷劑治療肺癌的效果[17]。但關(guān)于Gal-3在肺癌中的作用機(jī)制研究仍較少。

為分析Gal-3對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究構(gòu)建了過表達(dá)Gal-3的肺癌細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，Gal-3組細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力高于對(duì)照組，而凋亡率低于對(duì)照組(P<0.05)，說明過表達(dá)Gal-3會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制其凋亡，提示Gal-3具有促進(jìn)肺癌進(jìn)展的作用。IL-6可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[18]。TGF-β1不但會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]，還會(huì)抑制淋巴細(xì)胞分化，降低免疫細(xì)胞活性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[20]。本研究中，Gal-3組細(xì)胞的IL-6和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，提示Gal-3可抑制免疫相關(guān)因子IL-6和TGF-β1的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

已有研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)肺癌的進(jìn)展，NOTCH1蛋白表達(dá)水平升高與肺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)[21]。NOTCH1蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，其不但會(huì)促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，還可以提高IL-6和TGF-β1等免疫相關(guān)因子的表達(dá)水平[22]。研究顯示，Gal-3表達(dá)水平降低會(huì)抑制Notch通路，并干擾B淋巴細(xì)胞的分化[23]。此外，Gal-3可通過激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)血管生成，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[24]。為進(jìn)一步分析Gal-3促進(jìn)肺癌進(jìn)展的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了Gal-3對(duì)Notch通路的調(diào)控作用，以及該作用對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為和免疫相關(guān)因子表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，Gal-3組的NOTCH1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，說明過表達(dá)Gal-3可以促進(jìn)NOTCH1蛋白的表達(dá)水平，對(duì)Notch信號(hào)通路具有一定調(diào)控作用。而Gal-3+LY450139組細(xì)胞的NOTCH1蛋白水平、增殖活力、侵襲能力、IL-6和TGF-β1 mRNA水平均低于Gal-3組但高于LY450139組，凋亡率高于Gal-3組，但低于LY450139組(均P<0.05)，說明使用LY450139抑制Notch通路，可以抑制A549細(xì)胞的增殖、侵襲能力及IL-6、TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，阻斷Gal-3的促癌作用，這也提示Gal-3可能通過調(diào)控Notch信號(hào)通路來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的免疫抑制。

綜上所述，Gal-3可能通過調(diào)控Notch信號(hào)通路來提高肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并促進(jìn)免疫相關(guān)因子IL-6和TGF-β1的表達(dá)，從而參與肺癌的進(jìn)展。Gal-3可能成為治療肺癌的新靶點(diǎn)。