張欣欣，齊永華，岳 鋒，路少鵬，李文明，郭東光，潘鵬濤，王選年*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院動(dòng)物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學(xué)，河南鄭州 450000)

達(dá)氟沙星(danofloxacin,DAN)為第三代氟喹諾酮類動(dòng)物專用藥物，分子式為C19H20FN3O3[1]，分子質(zhì)量為357.38 u。市售產(chǎn)品多為甲磺酸達(dá)氟沙星，白色至淡黃色結(jié)晶性粉末，無臭、易溶于水、微溶于甲醇，幾乎不溶于氯仿。達(dá)氟沙星為廣譜抗菌藥物，對(duì)巴氏桿菌、支原體、大腸埃希氏菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性[2]；但不合理使用或?yàn)E用直接導(dǎo)致動(dòng)物性食品中DAN的殘留，嚴(yán)重威脅人類健康，給監(jiān)管工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。

目前檢測(cè)達(dá)氟沙星藥物殘留的方法主要有理化檢測(cè)法(包括高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等)、微生物檢測(cè)法、免疫分析檢測(cè)法(包括酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)酶聯(lián)免疫法)等。理化檢測(cè)法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但儀器設(shè)備昂貴，樣品前處理復(fù)雜，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求；微生物檢測(cè)法靈敏度不高；免疫分析檢測(cè)方法則克服了以上方法的缺點(diǎn)，憑借其快速、高效、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展[3]。

目前報(bào)道的檢測(cè)DAN殘留的ELISA方法有直接法、間接法和雙抗夾心法。直接法是將抗原直接包被到固相載體上，孵育洗滌后加入酶標(biāo)抗體與抗原反應(yīng)。間接法是目前檢測(cè)中應(yīng)用最多的一種方法。將待檢測(cè)樣品直接吸附到固相載體上，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，用無關(guān)蛋白封閉，洗滌后加入特異性抗體與固相抗原結(jié)合，再加酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色，顏色的深淺與待測(cè)抗原的量成正比。雙抗體夾心法是將特異性抗體先吸附到固相載體上，封閉后加含有待測(cè)抗原的樣品，形成固相抗體抗原復(fù)合物，然后加酶標(biāo)抗體，加底物顯色，根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行抗原的定性或定量。而ic-ELISA方法是包被抗原，將待測(cè)抗原與特異性抗體一起加入，接著加酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色。在ic-ELISA方法中，待測(cè)抗原與固相抗原一起競(jìng)爭(zhēng)相同的有限抗體，當(dāng)樣品中游離的抗原越多，結(jié)合的抗體就越多，而固相抗原只能結(jié)合較少的抗體，反之亦然。因此，ic-ELISA方法具有更高的靈敏性[4]。

因此，本研究合成了達(dá)氟沙星完全抗原，制備出針對(duì)DAN特異性強(qiáng)、靈敏度高的多克隆抗體，并以此多克隆抗體為核心試劑成功建立了檢測(cè)DAN的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ic-ELISA)方法，為進(jìn)一步開發(fā)快速檢測(cè)DAN試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 達(dá)氟沙星、諾氟沙星(norfloxacin,NOR)、氧氟沙星(ofloxacin,OFL)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)、二氟沙星(difloxacin,DIF)、培氟沙星(pefloxacin,PEF)、洛美沙星(lomefloxacin,LOM)、沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)標(biāo)準(zhǔn)品,浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant,FIA)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(Enspire)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；加熱磁力攪拌器(CMAGHS4)，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)(UV-3010)，日本Hitachi公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DAN完全抗原的制備 采用混合酸酐法制備DAN完全抗原。稱取10 mg DAN充分溶于混合溶劑(二氧六環(huán)、DMF、三乙胺的摩爾比為3∶3∶0.1)中，冰浴攪拌30 min，之后滴加5 μL氯甲酸異丁酯冰浴攪拌2 h，此反應(yīng)液為A液[5]；稱取20 mg BSA或18 mg OVA充分溶于2 mL 濃度為0.1 mol/L的PBS(pH7.4)中，此反應(yīng)液為B液；磁力攪拌下，將A液緩慢加入B液中，4 ℃條件下反應(yīng)12 h；反應(yīng)好的混合物裝入處理好的透析袋中，4 ℃條件下用PBS透析3 d，每天更換3次透析液[6]；透析結(jié)束，5 000 r/min離心10 min，上清即為完全抗原；將制備好的完全抗原分裝于1.5 mL EP管中，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 完全抗原的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定 使用Bradford檢測(cè)試劑盒測(cè)定完全抗原DAN-BSA和DAN-OVA的濃度，將完全抗原及載體蛋白等量上樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定；

1.2.3 完全抗原紫外光譜掃描鑒定 在200 nm～400 nm間分別對(duì)載體蛋白、半抗原、完全抗原進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定，確證半抗原與BSA或OVA是否偶聯(lián)成功。

1.2.4 動(dòng)物免疫 用上述制備的完全抗原DAN-BSA免疫2.0 kg～2.5 kg的雌性新西蘭大白兔，首次免疫注射時(shí)，取 1 mg/mL的免疫原500 μL，與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下多點(diǎn)注射。間隔半個(gè)月后，取相同劑量的DAN-BSA，與等量的不完全佐劑乳化，同樣方法二次免疫。每隔2周免疫1次，4免后10 d耳緣靜脈采血，檢測(cè)抗血清效價(jià)，15 d后心臟大量采血，分離血清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ic-ELISA的建立

1.2.5.1 ic-ELISA基本步驟

(1)包被：使用包被液將包被原DAN-OVA稀釋到合適濃度，100 μL/孔加入酶標(biāo)板孔中，4 ℃包被過夜。

(2)封閉：將過夜包被的酶標(biāo)板用PBST清洗5次，拍干，每孔加入含50 mg/mL脫脂奶粉的PBST溶液200 μL，37 ℃封閉 2 h；將封閉好的酶標(biāo)板用PBST清洗5次，拍干。

(3)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：將1 mg/mL的DAN標(biāo)準(zhǔn)品用含有50 mg/mL脫脂奶粉的PBST溶液稀釋成系列濃度，加入到已固定好抗原的酶標(biāo)板中，每孔50 μL，振蕩混勻；接著向每孔中加入50 μL稀釋至合適濃度的抗體，37 ℃孵育 40 min；反應(yīng)結(jié)束后，PBST清洗5次，拍干[7]。

(4)加酶標(biāo)二抗：用PBST-50 mg/mL脫脂奶粉將酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-HRP)稀釋成合適的濃度，每孔加入100 μL，37 ℃孵育30 min；反應(yīng)結(jié)束后，洗板5次，拍干。

(5)顯色：每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃顯色 10 min，之后每孔加入50 μL 終止液(2 mol/L H2SO4)。

(6)測(cè)定：用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光值。

(7)計(jì)算：使用Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，OD 450 nm值為縱坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算各曲線的最大吸光值(maximum absorbance,Amax)和半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。綜合考慮 Amax、IC50以及Amax/IC50，確定ic-ELISA的最佳反應(yīng)條件。Amax/IC50值越大，說明方法的靈敏度越高[8]。

1.2.5.2 ic-ELISA條件的優(yōu)化 參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

(1)最佳包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)的的確定：通過棋盤法確定包被原的合適濃度和抗體稀釋倍數(shù)。將包被原稀釋成不同的濃度包被于酶標(biāo)板上，抗體進(jìn)行倍比稀釋，按照步驟1.2.5.1測(cè)定在0 μg/mL和0.5 μg/mL DAN標(biāo)準(zhǔn)品存在下OD 450 nm值處的吸光值；選擇0 μg/mL DAN存在下OD 450 nm值在1.0～1.5之間及0.5 μg/mL DAN存在下OD 450 nm值在0.2～0.3之間的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)為最佳組合。

(2)最佳標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的確定：在上述最佳反應(yīng)條件下，分別用 PBS、PBST、PBST-50 mg/mL脫脂奶粉稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，按步驟1.2.5.1 測(cè)定，比較不同藥物稀釋液下的Amax和IC50及其比值，確定最佳的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

(3)最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的確定：在上述最佳反應(yīng)條件下，選擇不同的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間，按步驟1.2.5.1測(cè)定，比較不同競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間下的Amax和IC50及其比值，確定最佳的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間。

(4)最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定：在上述最佳反應(yīng)條件下，將二抗稀釋成不同的濃度，按步驟1.2.5.1測(cè)定，比較不同濃度下的Amax和IC50及其比值，確定最佳的二抗稀釋倍數(shù)。

(5)最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間的確定：在上述最佳反應(yīng)條件下，選擇不同的二抗反應(yīng)時(shí)間，按步驟1.2.5.1測(cè)定，比較不同反應(yīng)時(shí)間下的Amax和IC50及其比值，確定最佳的二抗反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5.3 ic-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在上述優(yōu)化好的反應(yīng)條件下，按步驟1.2.5.1測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率B/B0(B：添加標(biāo)準(zhǔn)品的OD值；B0：不添加標(biāo)準(zhǔn)品的OD值)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.2.6 方法特異性鑒定 在上述優(yōu)化好的反應(yīng)條件下，選取8種與待測(cè)物結(jié)構(gòu)和功能相似的藥物按步驟1.2.5.1測(cè)定其交叉反應(yīng)率(CR)。交叉反應(yīng)率(CR)%=IC50(標(biāo)準(zhǔn)品)/IC50(類似物)×100%。

1.2.7 靈敏度與穩(wěn)定性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個(gè)不同的濃度(0.04、0.4、4 μg/L)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算變異系數(shù)(CV)。變異系數(shù)(CV)%=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%。

1.2.8 回收率試驗(yàn) DAN在生物體內(nèi)主要通過腎臟代謝，故尿液中藥物濃度較高。以豬尿作為稀釋液，將DAN稀釋成3種不同的濃度(0.04、0.4、4 μg/L)，根據(jù)建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率?；厥章?=實(shí)際測(cè)定的濃度/添加的濃度×100%[11]。

2 結(jié)果

2.1 完全抗原的鑒定

2.1.1 SDS-PAGE電泳鑒定DAN-BSA和DAN-OVA 在SDS-PAGE凝膠電泳中，樣品的遷移率只與分子質(zhì)量大小有關(guān)；從圖 1和圖2可以看出，偶聯(lián)產(chǎn)物DAN-BSA和DAN-OVA遷移速度明顯慢于BSA和OVA，表明偶聯(lián)產(chǎn)物的分子質(zhì)量大于載體蛋白，并且條帶清晰，純度比較高，證明完全抗原偶聯(lián)成功。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.DAN-BSA；2.BSA

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.DAN-OVA；2.OVA

2.1.2 紫外光譜掃描鑒定DAN-BSA和DAN-OVA 在200 nm～400 nm間分別對(duì)載體蛋白、半抗原、完全抗原進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定，結(jié)果如圖3A和圖3B所示。載體蛋白BSA和OVA在278 nm處出現(xiàn)了最高吸收峰，半抗原在272 nm處出現(xiàn)了最高吸收峰，而合成的完全抗原在新的波長(zhǎng)處出現(xiàn)了最高吸收峰，表明完全抗原合成是成功的。

A.DAN-BSA；B.DAN-OVA

2.2 免疫血清的評(píng)價(jià)

在ELISA方法中，通常采用固定一定的包被原濃度(本文采用3 μg/mL)進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定，其450 nm處的吸光值在 1.0～1.5 時(shí)抗血清的稀釋倍數(shù)即為抗血清的效價(jià)[9]。經(jīng)測(cè)定，該血清的效價(jià)為1∶51 200。

2.3 ic-ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)的確定 合適的包被原濃度和抗體濃度有利于抗原抗體更好的反應(yīng)；將包被原分別稀釋成1、3、5、7 μg/mL，抗體按1∶1 600～1∶102 400進(jìn)行倍比稀釋；按照步驟1.2.5.1測(cè)定在0 μg/mL和0.5 μg/mL DAN標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)OD 450 nm值；選擇0 μg/mL DAN時(shí)OD 450 nm值在1.0～1.5之間和0.5 μg/mL DAN時(shí)OD 450 nm值在0.2～0.3之間的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)為最佳。經(jīng)測(cè)定，最佳的包被原濃度為3 μg/mL，最佳的抗體稀釋倍數(shù)為1∶25 600。

2.3.2 最佳標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的確定 合適的藥物稀釋液有利于藥物的分散，本研究比較了PBS、PBST、PBST-50 mg/mL脫脂奶粉3種溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液對(duì)ic-ELISA方法靈敏度的影響。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)用PBST-50 mg/mL脫脂奶粉作為稀釋液時(shí)IC50最低，Amax/IC50值最大，因此，選擇PBST-50 mg/mL脫脂奶粉為最佳的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

圖4 最佳標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的確定

2.3.3 最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的確定 一般情況下抗原抗體的結(jié)合隨著時(shí)間的延長(zhǎng)反應(yīng)會(huì)更充分，但當(dāng)達(dá)到一定水平后，延長(zhǎng)時(shí)間不僅不能夠明顯的提高檢測(cè)方法的靈敏度，而且還會(huì)造成時(shí)間上的浪費(fèi)。本研究比較了20、40、60、80 min 4個(gè)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間對(duì)ic-ELISA方法靈敏度的影響，結(jié)果如圖5所示，隨著競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Amax逐漸增大，IC50先減小后增大；當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為40 min時(shí)，IC50最低，且Amax/IC50值最大，故確定最佳的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為40 min。

圖5 最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的確定

2.3.4 最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定 抗原抗體的結(jié)合是一種動(dòng)態(tài)平衡的過程，在一抗?jié)舛却_定的條件下，二抗也具有最佳的反應(yīng)濃度。本研究比較了1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000不同二抗稀釋倍數(shù)對(duì)ic-ELISA方法靈敏度的影響。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)二抗稀釋倍數(shù)為1∶5 000時(shí)，IC50最低，且Amax/IC50值最大，故最佳的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1∶5 000。

圖6 最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定

2.3.5 最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間的確定 二抗反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增大，背景值偏高；本研究比較了20、30、40 min不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)ic-ELISA方法靈敏度的影響，結(jié)果如圖7所示，隨著二抗反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Amax逐漸增大，IC50先減小后增大；因?yàn)榉磻?yīng)20 min時(shí)，二抗與固定在酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合不充分，而反應(yīng)40 min又使得非特異性結(jié)合增大，導(dǎo)致IC50的增加，因此，確定的最佳二抗反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖7 最佳二抗反應(yīng)時(shí)間的確定

2.4 ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

綜上所述，3 μg/mL為最佳的包被濃度，標(biāo)準(zhǔn)品用PBST-50 mg/mL脫脂奶粉稀釋最好，最佳的競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為40 min，酶標(biāo)二抗按1∶5 000稀釋時(shí)，抗原抗體作用30 min效果最好。在上述最優(yōu)的反應(yīng)條件下建立ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，以DAN標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，吸光值B/B0為縱坐標(biāo)(y)，應(yīng)用Origin 9.0軟件建立競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖8所示，線性回歸方程為y=36.85-39.21x，相關(guān)系數(shù)R2為0.98，IC50為0.39 μg/L，最低檢測(cè)限為0.04 μg/L，線性范圍IC20-IC80為0.09 μg/L～6.16 μg/L。

圖8 ic-ELISA檢測(cè)DAN標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 ic-ELISA方法特異性分析

在上述最優(yōu)的反應(yīng)條件下，本研究選取了NOR、OFL、CIP、ENR、DIF、PEF、LOM、SAR 8種與DAN結(jié)構(gòu)和功能相似的氟喹諾酮類藥物按照步驟1.2.5.1進(jìn)行交叉反應(yīng)率檢測(cè)。結(jié)果如表1所示，所建立的檢測(cè)DAN的ic-ELISA方法特異性極好，與選取的8種相似物均沒有交叉反應(yīng)性。

表1 DAN抗血清與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率檢測(cè)

2.6 重復(fù)性與穩(wěn)定性分析

重復(fù)性與穩(wěn)定性是保證殘留檢測(cè)準(zhǔn)確度的先決條件，本研究中以樣品測(cè)定值的CV來表示。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個(gè)不同的濃度(0.04、0.4、4 μg/L)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度所對(duì)應(yīng)的CV分別為6.37%、7.61%、5.49%，其平均CV為6.49%，CV<10%，表明該方法重復(fù)性與穩(wěn)定性較好。

2.7 豬尿中DAN回收率的測(cè)定

用豬尿?qū)AN稀釋成3種不同的濃度(0.04、0.4、4 μg/L)根據(jù)建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，將每個(gè)濃度反復(fù)測(cè)定3次，最終確定了豬尿中樣品的平均回收率在92%～101%之間，證明了該檢測(cè)方法適用于樣品中DAN的檢測(cè)。

3 討論

3.1 完全抗原的合成及多克隆抗體的制備

強(qiáng)特異性抗體保證了免疫分析方法的順利進(jìn)行，但強(qiáng)特異性抗體的產(chǎn)生需要高質(zhì)量的完全抗原。完全抗原的制備受多種因素的影響，如小分子本身結(jié)構(gòu)需具有某些特征的基團(tuán)，如含有苯環(huán)、雜環(huán)或含有分支結(jié)構(gòu)等，否則難以刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體或產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低[12]；同時(shí)應(yīng)該盡可能保持半抗原原有的分子結(jié)構(gòu)特征，使其暴露在人工抗原的表面，并能夠最大限度的被免疫細(xì)胞識(shí)別，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而才能產(chǎn)生針對(duì)半抗原的高親和力、高特異性抗體[13]。

達(dá)氟沙星是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，不能引起免疫應(yīng)答，只有與載體偶聯(lián)形成完全抗原后才能借助T細(xì)胞表位間接誘導(dǎo)B細(xì)胞進(jìn)行增殖和分裂，進(jìn)而產(chǎn)生特異性抗體。由于免疫系統(tǒng)一般對(duì)遠(yuǎn)離載體端的結(jié)構(gòu)識(shí)別能力較強(qiáng)，對(duì)連接端的結(jié)構(gòu)識(shí)別能力較弱，文獻(xiàn)中通常選擇遠(yuǎn)離待測(cè)物特征結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)作為連接臂的結(jié)合位點(diǎn)[14]。達(dá)氟沙星自身結(jié)構(gòu)帶有活性基團(tuán)羧基，本研究使用混合酸酐法制備了完全抗原。由于免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體時(shí)，機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)小分子半抗原和大分子蛋白表位的抗體，為了避免載體蛋白抗體的干擾，本研究在制備免疫原和包被原時(shí)選擇了不同的載體蛋白，保證了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和特異性。本研究結(jié)果顯示，采用混合酸酐法成功制備完全抗原，用偶聯(lián)成功的DAN-BSA免疫新西蘭大白兔，用DAN-OVA檢測(cè)免疫效果，四免后兔血清效價(jià)可達(dá)51 200。用該抗體構(gòu)建的ic-ELISA檢測(cè)方法的IC50為0.39 μg/L，且特異性極好，與NOR、OFL、CIP、ENR、DIF、PEF、LOM、SAR均無交叉反應(yīng)。

目前多篇文獻(xiàn)報(bào)道制備了抗DAN的單克隆抗體和多克隆抗體并建立了類似的檢測(cè)方法。盧圣欣[6]采用碳二亞胺法制備完全抗原，成功獲得了抗DAN的多克隆抗體，其IC50為2.0 μg/L，對(duì)氟羅沙星的交叉反應(yīng)率為20.65%，對(duì)培氟沙星的交叉反應(yīng)率為21.7%，對(duì)其他氟喹諾酮類交叉反應(yīng)率小于0.5%；袁美芳[2]也采用碳二亞胺法制備完全抗原，成功獲得了抗DAN的單克隆抗體，其IC50為0.129 μg/L，與環(huán)丙沙星、恩諾沙星、莫西沙星和沙拉沙星均有一定的交叉反應(yīng)能力。經(jīng)分析得出，單克隆抗體相比于多克隆抗體其靈敏度更好，相對(duì)穩(wěn)定，但是制備周期長(zhǎng)，過程復(fù)雜，容易造成污染。而多克隆抗體靈敏度雖略差，但其制備周期短，比單克隆抗體更能容許抗原中的微小變化。

3.2 ic-ELISA方法的優(yōu)化

ic-ELISA方法的靈敏度和穩(wěn)定性受包被原濃度、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間等多種因素的影響，故優(yōu)化反應(yīng)條件是至關(guān)重要的。包被原濃度的高低直接影響了抗原抗體的反應(yīng)，合適的稀釋液有利于標(biāo)準(zhǔn)品的分散，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短決定抗原抗體是否充分結(jié)合[15]；除此之外，二抗的稀釋倍數(shù)和反應(yīng)時(shí)間也會(huì)影響方法的靈敏性。鄧麗華[9]報(bào)道，優(yōu)化ic-ELISA方法時(shí)要綜合考慮最大吸光值(Amax)、半數(shù)抑制濃度(IC50)及兩者之間的比例(Amax/IC50)來確定最佳的反應(yīng)條件；IC50越低，Amax/IC50越高對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件越佳。

本研究對(duì)包被原濃度、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、二抗稀釋倍數(shù)及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定3 μg/mL為最佳的包被濃度，標(biāo)準(zhǔn)品用PBST-50 mg/mL脫脂奶粉稀釋最好，最佳的競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為40 min，酶標(biāo)二抗按1∶5 000稀釋時(shí)，抗原抗體作用30 min效果最好。最終在最佳反應(yīng)條件下建立了檢測(cè)DAN的ic-ELISA檢測(cè)方法。

本研究成功制備了抗達(dá)氟沙星的多克隆抗體，利用該抗體建立了檢測(cè)達(dá)氟沙星殘留的ic-ELISA方法，其 IC50為0.39 μg/L，最低檢測(cè)限為0.04 μg/L，檢測(cè)范圍為0.09 μg/L～6.16 μg/L，與NOR、OFL、CIP、ENR、DIF、PEF、LOM、SAR均無交叉反應(yīng)。該方法特異性好，準(zhǔn)確度高，為進(jìn)一步研制達(dá)氟沙星免疫快速檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。