黃敏霞，翟 頎，呂殿紅，溫肖會，翟少倫，羅勝軍，周秀蓉，賈春玲*，魏文康1,,3*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東廣州 510640；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東廣州 510640)

牛結節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease,LSD)是由牛結節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)感染自然宿主牛引起發(fā)熱、淺表淋巴結腫大和皮膚結節(jié)廣泛分布等臨床特征的一種病毒性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)列為必須通報的動物傳染病[1]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其定為二類動物疫病。LSD造成牛的皮膚損傷，降低皮張利用率和產(chǎn)肉率，甚至引起母牛產(chǎn)奶量下降，流產(chǎn)和不孕，以及公牛不育，從而給養(yǎng)牛業(yè)造成不可估量的經(jīng)濟損失[2]。LSD主要由節(jié)肢動物傳播，有明顯季節(jié)性，傳播范圍廣，還能在牛群中通過直接或間接接觸傳播，具有高發(fā)病率、低病死率的特點[3-5]。2019年8月，我國第一次在靠近哈薩克斯坦和俄羅斯邊境的新疆伊犁地區(qū)確診LSD[6]，此后LSD疫情在不到一年里時間里從中國最西北部的新疆蔓延到最東南部的臺灣省，波及數(shù)十個省份，對我國養(yǎng)牛業(yè)造成巨大威脅[7-8]。

LSDV是一種有囊膜的雙鏈線性DNA病毒，基因組約為151 kb，有156個開放閱讀框(opening reading frame,ORF)，屬于痘病毒科(Poxviridae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CaPV),CaPV包括山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)和綿羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)，LSDV幾乎囊括了GTPV和SPPV所有基因，存在交叉中和抗體，三者在血清學上無法區(qū)分[9-11]。其中p32蛋白是位于LSDV囊膜表面的一種主要結構蛋白，分子質(zhì)量為35.5 ku，含有主要的抗原表位，免疫原性強，能在病毒感染的初期刺激宿主產(chǎn)生抗體阻止病毒擴散，但該抗體無法阻止病毒在攻毒部位的復制[12-14]。p32蛋白在LSDV的致病性、診斷和防控中具有重要意義[15]。

建立以p32蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法，是進行LSDV血清學監(jiān)測的重要前提，但目前相關的研究較少[16]，主要由于p32蛋白難以表達、表達量不高或純度不夠，難以形成基于CaPV p32蛋白的商品化的ELISA試劑盒，國內(nèi)尚未有獲得批準文號的相關診斷試劑[17]。本研究利用pCold Ⅰ載體構建了LSDV p32蛋白膜外區(qū)的原核表達質(zhì)粒，在對可溶性表達的重組蛋白進行純化后，免疫昆明(Kunming,KM)小鼠制備了多克隆抗體，解決了p32蛋白難以表達或表達量不夠等問題，同時為LSDV血清學診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 LSDV感染的牛皮膚組織樣品，采集自廣西壯族自治區(qū)百色市公布LSDV疫情的牛群。

1.1.2 主要試劑 羊痘病毒、牛結節(jié)性皮膚病病毒核酸雙重熒光PCR檢測試劑盒，鄭州中道生物技術有限公司產(chǎn)品；pCold Ⅰ載體、無縫克隆試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌表達菌BL21(DE3)pLysS，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品；His標簽蛋白質(zhì)純化試劑盒，蘇州海貍生物醫(yī)學工程有限公司產(chǎn)品；His標簽小鼠單克隆抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、DAB顯色試劑盒，碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品。MONTANIDElM ISA 206VG佐劑，Seppic(上海)特殊化學品有限公司產(chǎn)品。引物合成與片段測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 qTOWER3熒光定量PCR儀，德國耶拿分析儀器股份有限公司產(chǎn)品；T100梯度PCR儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司產(chǎn)品；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠產(chǎn)品；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；搖床，美國賽洛捷克(SCILOGEX)公司產(chǎn)品；旋轉混勻儀，大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司產(chǎn)品。

1.1.4 實驗動物 4周齡SPF級KM雌性小鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測與P32基因擴增 在生物安全柜中取部分LSDV感染的牛皮膚組織樣品向其中加入適量生理鹽水，制成約100 mg/mL 的組織勻漿，經(jīng)65 ℃ 水浴30 min滅活處理，反復凍融3次，8 000 r/min離心2 min后棄沉淀，將上清液進行DNA提取。利用羊痘病毒、牛結節(jié)性皮膚病病毒核酸雙重熒光PCR檢測試劑盒進行檢測，陽性對照和陰性對照均為試劑盒所提供，同時設山羊痘疫苗為對照組。

將部分LSDV感染的牛皮膚組織剪切成細小的碎片，加入適量含1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液，研磨充分后在冰上進行裂解，10 000 r/min離心5 min，收集上清蛋白于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考中國首例LSDV毒株LSDV/Xinjiang/2019(GenBank登錄號：MN598005)的序列，利用Primer 5.0軟件設計1對引物P32-F1和P32-R1(表1)，擴增序列包含P32蛋白的的ORF序列，模板為樣品上清液DNA，膠回收后，連接至pClone007克隆載體，轉化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR鑒定正確的菌液送至生物公司進行測序，并用Blast分析測序結果中的ORF序列，將測序正確的菌液進行質(zhì)粒提取，該質(zhì)粒命名為pClone-P32，并上傳序列到GenBank。

表1 PCR引物序列

1.2.2 pCold I-P32重組表達質(zhì)粒的構建 根據(jù)同源重組原理，利用SnapGene 3.1.1軟件設計1對特異性引物P32-F2和P32-R2(在上、下游引物分別引入一段與表達載體pCold Ⅰ同源的序列，表1)，以上述1.2.1質(zhì)粒pClone-P32為模板，PCR擴增p32蛋白膜外區(qū)，膠回收后，利用無縫克隆試劑盒與經(jīng)過Hind Ⅲ單酶切得到的線性pCold Ⅰ載體進行連接，反應體系(10 μL)如下：5× InFusion HD Premix 2 μL，PCR擴增片段1 μL，線性pCold Ⅰ載體7 μL。連接體系轉化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落送測序，同時提取質(zhì)粒進行Hind Ⅲ單酶切鑒定，將測序及單酶切鑒定正確的陽性重組表達質(zhì)粒命名為pCold I-P32。

1.2.3 p32蛋白的表達與純化 將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒pCold Ⅰ-P32和空載體質(zhì)粒pCold Ⅰ分別轉化大腸埃希氏菌BL21(DE3)pLysS表達菌，挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中進行37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，次日將菌液按照1∶100的比例接種于含有氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌液的OD 600 nm值達到0.6時(培養(yǎng)大約3.5 h)，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol/L，置于低溫搖床15 ℃誘導培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀，并用含10 mmol/L咪唑和含蛋白酶抑制劑的Binding buffer溶解沉淀，然后超聲破菌，8 000 r/min離心15 min后分別收集上清液和沉淀，進行SDS-PAGE分析重組蛋白的可溶性。

根據(jù)His標簽蛋白純化試劑盒對收集的蛋白上清液進行純化，將樣品與鈷離子(Co2+)螯合的磁珠在室溫旋轉混合30 min，依次用含有20、40、80、100、200、400 mmol/L咪唑的緩沖溶液洗滌去雜蛋白或洗脫目的蛋白，每一步均收集洗滌或洗脫后的液體，進行SDS-PAGE分析純化效果。

將純化的p32截短蛋白進行SDS-PAGE，400 mA 20 min轉移至PVDF膜上，將膜置于50 g/L脫脂奶粉中37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次后加入1∶500稀釋的His標簽小鼠單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次后，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)為二抗，1∶1 000稀釋，37 ℃孵育1 h，洗滌后用DAB試劑盒顯色。

1.2.4 制備重組蛋白多克隆抗體與Western blot檢測 將預熱至31 ℃的純化蛋白與ISA 206 VG佐劑等體積混合，通過抗原乳化接頭乳化成水包油包水(W/O/W)的雙相油乳劑。按照50 μg/只的劑量多點皮下注射免疫小鼠；2周后進行第2次免疫；最后收集小鼠血清，置-20 ℃保存。

取1.2.1保存的牛感染LSDV的病變皮膚組織蛋白上清液進行SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜，50 g/L脫脂乳37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次，加入1∶100稀釋的免疫小鼠血清4 ℃孵育過夜，對照組是以1∶100稀釋的免疫前小鼠血清孵育，PBST洗滌3次，加入1∶1 000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，DAB試劑盒顯色。

2 結果

2.1 樣品檢測與P32蛋白擴增

根據(jù)樣品核酸檢測結果，陰性與陽性對照均正常(圖1A和圖1B)，樣品判定為LSDV陽性。

PCR產(chǎn)物在凝膠上顯示為大小約1 400 bp左右的條帶，符合預期結果(圖1C)。通過DNA Star軟件從測序正確的序列中獲取一段大小為969 bp的ORF序列，經(jīng)Blast分析確定該序列為LSDVP32基因序列，上傳GenBank后登錄號為OM046584，與我國LSDV/Xingjiang/2019的同源性達到100%。

A.FAM通道擴增曲線；B.VIC通道擴增曲線；1.待檢核酸樣品；2.山羊痘疫苗核酸樣品；3.陽性對照；C.P32擴增產(chǎn)物的電泳分析; M.DNA標準DL 2 000；4.P32擴增產(chǎn)物

2.2 pCold Ⅰ-P32重組表達質(zhì)粒的鑒定

重組表達質(zhì)粒pCold Ⅰ-P32經(jīng)Hind Ⅲ單酶切后出現(xiàn)兩條帶，大小分別為5 000 bp和900 bp左右(圖2)。測序結果表明，P32基因以正確的閱讀框架與原核表達載體pCold Ⅰ連接，pCold Ⅰ-P32重組表達質(zhì)粒構建成功。

M.DNA標準DL 5 000；1.重組菌株PCR擴增產(chǎn)物；2.重組表達質(zhì)粒pCold Ⅰ-P32單酶切產(chǎn)物

2.3 p32蛋白的表達與純化

SDS-PAGE分析表明重組菌株表達的蛋白與理論值相符，分子質(zhì)量為34.4 ku，且重組蛋白能以上清和包涵體2種方式同時表達(圖3A)。

SDS-PAGE分析目的蛋白純化效果(圖3B)，顯示Co2+親和層析純化效果較好，目標蛋白最佳的咪唑洗脫濃度為200 mmol/L，獲得的條帶單一且顏色較深。Western blot檢測純化的目的蛋白能被His標簽小鼠單克隆抗體特異性識別(圖3C)，說明表達的p32截短蛋白具有較好的反應原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；A.SDS-PAGE分析重組蛋白的可溶性；1.pCold I空載體誘導菌全蛋白；2.pCold Ⅰ-P32未誘導菌全蛋白；3.pCold Ⅰ-P32誘導菌的沉淀蛋白；4.pCold Ⅰ-P32誘導菌的上清蛋白；B.SDS-PAGE分析純化結果; 5～10.20、40、80、100、200、400 mmol/L咪唑的緩沖溶液依次洗滌的雜蛋白或洗脫的目的蛋白；C.重組蛋白的Western blot鑒定結果；11.pCold I空載體誘導菌全蛋白；12.純化的重組蛋白

2.4 多克隆抗體的特異性分析

經(jīng)Western blot檢測，從LSDV感染的牛病變皮膚組織中提取的天然蛋白可以被制備的小鼠多克隆抗體特異性識別，顯色條帶為p32全長蛋白，大小為35.5 ku(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.抗LSDV p32小鼠多克隆抗體；2.免疫前小鼠血清

3 討論

自2019年在我國新疆確診LSD以來，該病已波及我國數(shù)十個省份，傳播速度非?？欤瑢ξ覈B(yǎng)牛業(yè)造成巨大威脅[7]。p32蛋白是位于LSDV囊膜表面的一種主要結構蛋白，含有主要的抗原決定簇，其抗體能中和LSDV。但是關于LSDV的p32蛋白相關研究在國內(nèi)較少。

p32蛋白是CaPV所共有的一種主要結構蛋白，屬內(nèi)核苷酸同源性介于88.3%～99.8%[18]。針對GTPV和SPPV的p32蛋白研究相對較多，許多學者發(fā)現(xiàn)p32全長蛋白難以表達或表達量較低，郭巍等[19]嘗試用昆蟲細胞表達和大腸埃希氏菌表達完整p32蛋白均未獲得成功，而陳軼霞等[17]和Ebrahimi-Jam M H等[20]雖然成功表達了p32全長蛋白，但表達量不理想。因此許多學者嘗試表達p32截短蛋白，但表達的截短p32重組蛋白大都以包涵體形式存在，宋書婷等[21]表達了p32膜外區(qū)，結果重組蛋白以包涵體形式存在，表達量很低，且不易純化。

基于p32全長蛋白難以表達，本研究嘗試以可溶性形式表達LSDV p32蛋白的膜外區(qū)。從LSDV核酸樣品中PCR擴增得到P32全長基因，經(jīng)Blast分析可得該基因與我國LSDV/Xingjiang/2019的一致性達到100%。根據(jù)陳思睿[18]分析的LSDV/Xingjiang/2019毒株p32蛋白結構可知，該蛋白為跨膜蛋白，共有322個氨基酸，其中1-280位氨基酸在膜外側，281-303位氨基酸是跨膜結構域，304-322位氨基酸在膜內(nèi)側，且C端的跨膜區(qū)為疏水區(qū)。為了便于P32基因的高效表達，本研究在克隆P32基因時，去除了對細胞有毒性的3’端跨膜區(qū)及膜內(nèi)區(qū)，保留了膜外區(qū)，將其連接至原核表達載體pCold Ⅰ。pCold載體利用大腸埃希氏菌的冷休克基因，在低溫誘導下使截短p32蛋白能以可溶性形式得到高效表達，解決了基因表達困難或表達的蛋白質(zhì)不可溶等問題，同時低溫條件下大腸埃希氏菌暫時停止生長，大部分雜蛋白的表達量降低，能很好減輕純化蛋白的工作難度。

許多學者研究已證實p32蛋白截短表達沒有破壞p32蛋白抗原決定簇，仍然使免疫小鼠產(chǎn)生免疫應答[22-23]，這與本研究Western blot鑒定結果相符。本研究用純化的截短p32蛋白免疫小鼠后獲得的多克隆抗體能特異性識別感染LSDV牛皮膚組織的天然蛋白，說明本研究獲得的多克隆抗體可以應用于檢測LSDV抗原。本研究解決了p32蛋白難以表達等問題，獲得了純度較高的p32截短蛋白及其鼠源多克隆抗體，為進一步建立LSDV血清學診斷方法和基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎，有利于加強我國的LSD防控工作。