江藍(lán)藍(lán)，劉 慶，鐘俊威

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東廣州 510110）

生物素（Biotin）又稱維生素 H，屬于水溶性 B族維生素。生物素可能有8種同分異構(gòu)體，其中只有D-生物素是天然存在的，具有維生素的功能[1]。生物素是蛋白質(zhì)、脂肪代謝的必需物質(zhì)[2]。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 10765—2010[3]明確規(guī)定了嬰兒配方食品中生物素的添加量為0.36～2.39 μg/100 kJ。

目前，現(xiàn)有生物素的測(cè)定方法主要有液相色譜法[4]和微生物法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-7]、酶聯(lián)免疫法[8]、熒光免疫層析法[9]和生物傳感器法[10]等。其中，微生物法是GB 5009.259—2016[5]所采用的方法，靈敏度較高，適用于添加量較低的基質(zhì)樣品，但該方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要無(wú)菌操作等問(wèn)題。酶聯(lián)免疫法雖然有較強(qiáng)的專一性，但是試劑盒價(jià)格較貴，不適用于日常檢測(cè)；生物傳感器法存在重現(xiàn)性不好的問(wèn)題；生物素?zé)o典型的熒光發(fā)色團(tuán)和紫外發(fā)色團(tuán)，導(dǎo)致分光光度法和適用紫外檢測(cè)器的高效液相色譜法都存在靈敏度低的問(wèn)題，也導(dǎo)致了熒光法的可靠性存在缺陷。

嬰兒配方食品具有基質(zhì)復(fù)雜，生物素含量添加量低的特點(diǎn)。本研究擬建立一種用PLS固相萃取小柱凈化，經(jīng)反向C18柱分離，UPLC-MS檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量的分析方法，為嬰幼兒配方乳粉中生物素的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

D-生物素（純度≥99.0%）；生物素-d4內(nèi)標(biāo)（純度≥98%）；甲酸；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；二氯甲烷（色譜純）；高氯酸（優(yōu)級(jí)純）；PLS固相萃取小柱；0.22 μm水相濾膜。

1.2 儀器和設(shè)備

AB 4500型液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀；分析天平（感量為0.1 mg和0.01 mg）；恒溫水浴鍋；超聲波發(fā)生器；渦旋混合器；離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確到0.1 mg）生物素標(biāo)準(zhǔn)品（濃度97.8%），用50%乙醇溶液定容至100 mL。在4 ℃避光保存，有效期為12個(gè)月。

（2）生物素 -d4 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（10 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確稱取0.5 mg（精確到0.01 mg）生物素d4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（＞95%），用50%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，于4 ℃避光保存，有效期為12個(gè)月。

（3）生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（0.5 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確吸取5 mL生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋并定容至100 mL，配制成濃度為0.5 μg·mL-1的生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

高碳天然氣捕集技術(shù)：以松南高碳天然氣分離捕集裝置為代表，采用MDEA胺法脫碳工藝，將松南高碳?xì)馓铮ǘ趸己?3%）中的二氧化碳捕集分離，生產(chǎn)清潔天然氣，年處理能力達(dá)50萬(wàn)噸。

（4）生物素 -d4 內(nèi)標(biāo)中間液（1.0 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確吸取1 mL生物素-d4內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用水稀釋并定容至10 mL，配制成濃度為1.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（5）生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。將生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋得到濃度為 5.00 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1和 100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間液中加入100 μL 生物素 -d4 內(nèi)標(biāo)中間液（1.0 μg·mL-1），用水定容至1 000 μL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品處理方法

（1）提取。稱取0.5～2.0 g（精確到0.000 1 g）樣品于50 mL離心管中，加0.775 mL內(nèi)標(biāo)中間液，加14.225 mL 50 ℃左右的超純水溶解，混勻，振蕩5min，加入0.5 mL 60%的高氯酸溶液和5 mL二氯甲烷，振 蕩 5 min，6 000 r·min-1離 心 5 min， 取 出 上 清液。向下層殘留物加入15 mL 50 ℃左右的超純水和0.5 mL 60%的高氯酸溶液，再按上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次提取的上清液，待凈化。

（2）樣品凈化。依次加入6 mL甲醇，6 mL水活化PLS固相萃取小柱小柱，將4 mL上清液加入固相萃取柱中，用6 mL水淋洗，以上流出液都棄去。用6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在40 ℃下氮吹至近干，用1.00 mL水復(fù)溶，振蕩混勻，用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后上液相質(zhì)譜儀分析檢測(cè)。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：100%乙腈；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電離模式：ESI+；離子化電壓：+5 500 kV；溫度：350 ℃；監(jiān)測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)比較乙腈-10 mmol·L-1甲酸銨（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸與乙腈-10 mmol·L-1甲酸銨對(duì)目標(biāo)物峰形、分離效果以及靈敏度的影響。結(jié)果表明，乙腈-10 mmol·L-1甲酸銨（含0.1%甲酸）的分離效果不好，響應(yīng)值也較低；乙腈-10 mmol·L-1甲酸銨的保留最差。乙腈-0.1%甲酸的分離效果較好，響應(yīng)高，故采用乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相。

2.1.2 確定質(zhì)譜條件

通過(guò)電噴霧電離源正離子掃描模式，調(diào)諧并優(yōu)化錐孔的碰撞能量以及電壓等參數(shù)，確定了定性定量離子對(duì)為D-生物素和生物素-d4，具體質(zhì)譜參數(shù)見表 1。在最優(yōu)的色譜-質(zhì)譜條件之下，生物素及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng·mL-1）的 MRM 色譜圖見圖1。

圖1 生物素及生物素-d4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

以生物素濃度為橫坐標(biāo)，以生物素與生物素內(nèi)標(biāo)峰面積比（A生物素/A生物素-d4）為縱坐標(biāo)，繪制生物素的校準(zhǔn)曲線。在5～100 ng·mL-1線性符合要求，線性回歸方程為y=0.012x+0.006 67，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。檢出限為0.3 μg/100 g，定量限為1.0 μg/100 g，可適用于嬰幼兒配方乳粉中生物素的定性定量分析。

2.2.2 方法的重現(xiàn)性

選取市售某品牌嬰兒配方食品（1段奶粉）為代表考察方法的重現(xiàn)性，每個(gè)樣品測(cè)試6個(gè)平行樣品，精密度為1.49%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定，方法重現(xiàn)性好。測(cè)試結(jié)果見表2。

表2 方法精密度結(jié)果

2.2.3 方法準(zhǔn)確度

選取市售某品牌嬰兒配方食品（1段奶粉）為代表進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，向樣品中分別加入低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度水平，每個(gè)濃度取6個(gè)平行樣，結(jié)果見表3。加標(biāo)回收率在96.5%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.77%～2.56%，該方法對(duì)不同濃度的生物素的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確度。

表3 方法回收率和精密度結(jié)果

2.2.4 與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比

應(yīng)用本方法和GB 5009.259—2016方法對(duì)市售6個(gè)不同品牌的嬰兒配方乳粉進(jìn)行生物素含量測(cè)定，兩種測(cè)試方法的結(jié)果并沒(méi)有明顯的差異，故此實(shí)驗(yàn)所建立的方法可適用于嬰兒配方乳粉，結(jié)果見表4。

表4 本方法與國(guó)標(biāo)方法（GB 5009.259—2016）生物素含量測(cè)試結(jié)果比較

3 結(jié)論

針對(duì)嬰兒配方食品形態(tài)多樣化、復(fù)雜化的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用PSL固相萃取小柱對(duì)其進(jìn)行凈化，從而降低基質(zhì)干擾成分的影響；而定量分析則使用了同位素內(nèi)標(biāo)法來(lái)降低質(zhì)量效應(yīng)和前處理過(guò)程引起的偏差，從而使分析方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性得到了提高。

本文建立的方法通過(guò)使用HPLC-MSIMS法進(jìn)行測(cè)定，有效提高了分析效率，縮短了檢測(cè)周期。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，證實(shí)本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用的微生物法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，可將此方法用于嬰幼兒配方食品中生物素的分析檢測(cè)。同時(shí)本方法還具備操作簡(jiǎn)單，靈敏度更高，檢測(cè)周期更短，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可以為嬰兒配方食品的產(chǎn)品質(zhì)量控制和監(jiān)督提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，也為嬰兒配方食品中生物素的測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)。