馬 妮 崔小麗 邸 偉 高俊卿 袁 婕

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，西安，710068)

缺血性腦卒中是慢性缺血性腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，主要是由于長期腦低灌注造成炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙等，因此抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)等可能是改善腦缺血損傷后認(rèn)知障礙的潛在治療靶點(diǎn)之一[1-3]。在預(yù)防與治療缺血性腦血管疾病中，西藥治療療效不甚理想，而中醫(yī)藥治療通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用，是一種較為理想的選擇[4]。復(fù)方蛭龍膠囊(FFZLC)作為陜西省人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由水蛭、地龍、遠(yuǎn)志等組成，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝制成膠囊，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。因此，我們通過探討FFZJC對其治療大鼠缺血性腦卒中作用及其相關(guān)機(jī)制，為缺血性腦卒中患者的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)；同時(shí)采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)初步分析了該制劑的活性成分，為后期研究其藥代動力學(xué)與組織分布提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步開發(fā)中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號：SCXK(陜)2018-004號。動物飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水，光照周期明暗各12 h，溫度控制在(23±2)℃，相對濕度控制在40%～70%。本實(shí)驗(yàn)通過陜西人民醫(yī)院動物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(倫理審批號：SXRMYYLAC2020-1001)。

1.1.2 藥物 復(fù)方蛭龍膠囊(陜西省人民醫(yī)院藥劑科研制，批號：20180806、20180807、20180808)，規(guī)格：0.3 g/粒。在灌胃前用蒸餾水將藥物粉末制成濃度為0.15 g/mL與0.45 g/mL均勻混懸液，置于冰箱(低于4 ℃)貯存?zhèn)溆?；吡拉西坦膠囊(西安必康心榮制藥有限公司，批號：20190614)，規(guī)格：0.4 g/粒。

1.1.3 試劑與儀器 甲醇、乙腈(Fisher公司，美國，批號：106246，HPLC級)；水合氯醛(西安天茂化工有限公司，批號：190508，分析純)；尿嘧啶(批號：100469-201302，純度99.6%)、次黃嘌呤(批號：140661-200903，純度99.5%)、黃嘌呤(批號：140661-200903，純度99.5%)、尿苷(批號：110887-201803，純度99.5%)、羥基紅花黃色素A(批號：111637-201810，純度93.1%)、丹酚酸B(批號：111562-201917，純度96.6%)均購自中國食品藥品檢定研究院；腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α，南京卡米洛生物工程有限公司，批號：BS-8628)；C反應(yīng)蛋白(C Reactive Protein,CRP，批號：A-01K98742)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6,批號：A105472-48T)、白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8,批號：A-01K98742)，均購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；超快速液相色譜儀(島津公司，日本，型號：Prominenece UFLC)；Kromasil C18色譜柱(NOBEL公司，瑞典，規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；電子分析天平(梅特勒公司，瑞士，型號：XPE105型)；數(shù)控超聲波發(fā)生器(江蘇昆山超聲儀器有限公司，型號：KQ-5200D)；高速臺式冷凍離心機(jī)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司，型號：TGL-16gR，最大離心力：15 455×g)；酶標(biāo)儀(北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司，瑞士，型號：Tecan sunrise)；恒溫水浴箱(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，型號：HWT-6B)；電動玻璃勻漿機(jī)(上海將來實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DY89-I)。

1.2 方法

1.2.1 抗缺血性腦卒中大鼠

1.2.1.1 分組與模型制備 取實(shí)施假手術(shù)成功的10只大鼠設(shè)為對照組；將40只造模成功的大鼠使用完全隨機(jī)方法隨機(jī)分為4組：模型組、FFZJC大劑量組、FFZJC小劑量組、陽性對照組，每組10只。參照文獻(xiàn)[6-7]方法，采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法制備慢性缺血腦卒中大鼠模型。大鼠禁食12 h，禁水6 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 g/kg)后，把大鼠以仰臥的方式固定在手術(shù)臺上，采用常規(guī)的消毒方式消毒皮膚，然后剪開頸部正中部分的皮膚，用鈍性方式分離皮下組織，在氣管旁找到大鼠雙側(cè)的頸總動脈，避免損傷神經(jīng)和氣管，充分暴露出雙側(cè)頸總動脈并分離，用絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，完成后逐層縫合組織與皮膚。在手術(shù)后第3周開始篩選大鼠模型，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測定各模型大鼠的平均潛伏期，以(平均潛伏期-參考值)/平均潛伏期作為篩選指標(biāo)，當(dāng)該值>0.2時(shí)，認(rèn)為模型大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知障礙，判定造模型成功。假手術(shù)組除不結(jié)扎頸總動脈，其他均按造模方法完成。大鼠在麻醉蘇醒恢復(fù)后進(jìn)行常規(guī)飲食與飲水，在造模整個(gè)過程中保持大鼠體溫(肛溫在37 ℃)。

1.2.1.2 給藥方法與檢測指標(biāo) 1)給藥方法：術(shù)后3 d開始給藥，將藥物溶于蒸餾水中，根據(jù)FFZJC和陽性對照藥物的臨床口服用量按體質(zhì)量(按60 kg體質(zhì)量成人給藥劑量轉(zhuǎn)換計(jì)算出大鼠的等效劑量定為小劑量組和對照組的劑量，F(xiàn)FZJC大劑量組的劑量為小劑量組的3倍)，計(jì)算結(jié)果FFZJC小劑量組、FFZJC大劑量組和陽性對照組分別為0.3 g/kg、0.9 g/kg和0.09 g/kg。大鼠灌胃量為1次/d，每次10 mL/kg。假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量(10 mL/kg)生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。2)檢測指標(biāo)：a.大鼠腦組織含水量的影響末次給藥后，把大鼠處死后立即解剖，取出完整的腦組織，采用稱量法分別稱定濕質(zhì)量與對應(yīng)的干質(zhì)量(60 ℃，干燥3 h)，計(jì)算腦組織含水量(g)=腦濕質(zhì)量(g)-腦干質(zhì)量(g)[8]。b.血清中TNF-α、CRP、IL-6、IL-8含量測定末次給藥后，大鼠眼眶采血，3 000 r/min，離心20 min,離心半徑55 mm,分離血清并冷凍于-80 ℃冰箱中。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法按照試劑盒檢測血清中炎癥介質(zhì)(IL-8、CRP、IL-6、TNF-α)的含量[7,9]。c.腦組織中TNF-α、CRP、IL-6、IL-8含量測定在“b項(xiàng)”取完血后，立即斷頭取腦，冰水浴中用0.9% NaCl溶液制成10%腦組織勻漿[以腦組織(g)/生理鹽水(mL)=1/9校對]。離心20 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心半徑55 mm,取上清液(在-20 ℃以下低溫保存?zhèn)溆?。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法按照試劑盒檢測腦組織中炎癥介質(zhì)(IL-8、CRP、IL-6、TNF-α)的含量[10]。

1.2.2 活性成分定量

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-10 mmol/L磷酸二氫鉀水溶液(B)，梯度洗脫，0～5 min，B 95%；5～25 min，B 95%→93%；25～30 min，B 93%→92%；30～45 min，B 92%→90%；45～50 min，B 90%→85%；50～60 min，B 85%→50%；60～70 min，B 50%→10%。記錄時(shí)間為70 min。流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取尿嘧啶6.02 mg、次黃嘌呤7.04 mg、黃嘌呤8.04 mg、尿苷5.03 mg、羥基紅花黃色素A 12.89 mg、丹酚酸B 24.00 mg對照品，置于20 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為299.80 μg/mL、350.24 μg/mL、402.00 μg/mL、250.24 μg/mL、600.03 μg/mL、1 242.24 μg/mL的混合對照品溶液，作為儲備液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 取20粒本品，傾出內(nèi)容物，研磨成細(xì)粉并混勻，再稱取該粉末2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取30 min后，取出并冷卻至室溫，再稱定重量，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，10 000 r/min離心15 min，取上清液，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液[5]。

1.2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，分別制備缺水蛭與地龍、缺丹參、缺紅花等3種陰性對照制劑，再分別按“1.2.2.3”項(xiàng)制備陰性對照溶液。

1.2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 分別精密量取儲備液0.01 mL，0.05 mL，0.10 mL，0.25 mL，0.50 mL，分別置于各個(gè)1 mL的量瓶中，加50%甲醇定容至1 mL，依次得混對照品溶液1、2、3、4、5與另標(biāo)記儲備液為6號。進(jìn)樣測定，記錄峰面積，對照品濃度(X)與峰面積(Y)的進(jìn)行回歸，計(jì)算線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)。

1.2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取3號混合對照品溶液，連續(xù)測定5次，進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)差(Relative Standard Deviation，RSD)(%)。

1.2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取3號混合對照品溶液，分別于0、2.0、4.0、8.0、12.0、24 h，進(jìn)樣記錄峰面積，計(jì)算RSD(%)。

1.2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取20180806批樣品2.5 g，精密稱定，按“1.2.2.3”項(xiàng)供試品制備方法制備6份供試品溶液及按“1.2.2.1”測定方法測定。

1.2.2.9 加樣回收率 取已知含量的20180806批樣品，精密稱定6份，分別添加對照品溶液(按表6添加)，再依據(jù)“1.2.2.3”項(xiàng)制備溶液與“1.2.1.1”項(xiàng)測定方法測定。

1.2.2.10 3批樣品含量測定 測定3批FFZJC中7成分即尿嘧啶、次黃嘌呤、羥基紅花黃色素A、黃嘌呤、尿苷、丹酚酸B的含量(mg/g)，依據(jù)“1.2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液與“1.2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織含水量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦組織含水量含量明顯增加(P<0.01)，說明MG組會導(dǎo)致腦組織炎性水腫。與模型組比較，F(xiàn)FZJC大劑量組及陽性對照組能明顯降低慢性缺血性腦卒中大鼠腦組織的含水量(P<0.01)；FFZJC小劑量組與模型組比較可改善腦組織水腫(P<0.01)，但效果不及假手術(shù)組顯著(P<0.01)。見表1。

2.2 血清中CRP、TNF-α、IL-8、IL-6含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清炎癥介質(zhì)CRP、IL-6、TNF-α、IL-8的含量較陽性對照組顯著升高(P<0.05或P<0.01)。FFZJC大劑量組、FFZJC小劑量組能顯著降低血清TNF-α、IL-6、IL-8、CRP的含量，F(xiàn)FZJC大劑量組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6、IL-8含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)FZJC大小劑量組及陽性對照組能顯著降低TNF-α、CRP、IL-6、IL-8的含量(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6、IL-8含量比較

2.3 腦組織中TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織炎癥介質(zhì)TNF-α、CRP、IL-6、IL-8的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)FZJC大劑量組、FFZJC小劑量組及陽性對照組能顯著降低大鼠腦組織炎癥介質(zhì)TNF-α、CRP、IL-6、IL-8的含量(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6、CRP、IL-8含量比較

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 7種成分在各濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。見表4。

表4 7種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及其濃度范圍

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 按“1.2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液與“1.2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定上述色譜條件分別進(jìn)樣陰性對照溶液(缺水蛭與地龍、缺丹參、缺紅花)、供試品溶液、混合對照溶液，結(jié)果各個(gè)陰性對照均無干擾，專屬性強(qiáng)。見圖1。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B的RSD分別為0.81%、0.88%、0.92%、0.93%、0.75%和0.85%，說明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B的RSD分別為0.91%、0.83%、0.90%、1.10%、1.02%和1.01%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B的含量(mg/g)與RSD(%)結(jié)果分別見表5，說明儀器重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性測定結(jié)果(mg/g)

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、羥基紅花黃色素A、尿苷、丹酚酸B(20180806批樣品含量見表5)的平均回收率(%)和RSD(%)結(jié)果分別為見表6，說明本方回收率良好。

表6 加樣回收率測定結(jié)果

2.10 樣品含量測定 3批FFZJC中尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、羥基紅花黃色素A、尿苷、丹酚酸B的含量(mg/g)與RSD(%)結(jié)果分別見表7，說明3批7種成分均一性較好。

表7 3批FFZJC5種成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病理狀態(tài)，是由多種致病因素參與的復(fù)雜病理發(fā)展變化過程，其損傷機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、腦水腫等，其中炎癥反應(yīng)以免疫炎癥反應(yīng)為主，有多種炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6、CRP、IL-8等大量釋放，且它們相互作用，相互促進(jìn)，使腦組織加速損傷[11]。TNF-α參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程，促進(jìn)神經(jīng)、組織損傷；IL-6加重腦水腫，加重腦損傷，形成惡性循環(huán)[12]。IL-8參與腦缺血再灌注損傷[13]。CRP在機(jī)體對炎癥反應(yīng)、組織損傷、感染等反應(yīng)中起著重要作用，不僅是心血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而且可精確、敏感地反映炎癥反應(yīng)程度，與患者腦梗死面積大小及意識障礙水平相關(guān)[14]。研究證實(shí)TNF-α、IL-6、CRP、IL-8等在缺血性腦卒中病變的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，可調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達(dá)及減輕腦缺血炎癥，保護(hù)腦缺血損傷[15]。

FFZJC由水蛭、地龍、遠(yuǎn)志、紅花、丹參、桃仁、黃精等7味中藥組成。研究證實(shí)水蛭、地龍對大鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用[16-17]，其主要成分為尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷等[18-19]；紅花及主要成分羥基紅花黃色素A、丹參及主要成分丹酚酸B、遠(yuǎn)志等能降低組織中炎癥介質(zhì)、調(diào)節(jié)信號通路等[20-22]；黃精對神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有廣泛藥理活性[23]；桃仁具有抗凝血和神經(jīng)保護(hù)作用[24]。結(jié)果顯示：假手術(shù)組血清炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8等基礎(chǔ)含量較低，模型組IL-6、IL-8等含量顯著增高，提示炎癥介質(zhì)參與腦缺血損傷過程；FFZJC大劑量組IL-6、IL-8、CRP、TNF-α等含量呈現(xiàn)不同程度下降，說明FFZJC可減少血清中炎癥介質(zhì)的含量，這可能是FFZJC對腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

通過優(yōu)選色譜柱種類，優(yōu)化色譜條件如優(yōu)化流動相系統(tǒng)、流速、柱溫、制樣方法、檢測波長等，建立了FFZJC活性成分的HPLC分析測定方法，該方法專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性與重復(fù)性良好，回收率高。

綜上所述，本研究證明FFZJC可能是通過降低炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、CRP、TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥腦水腫及神經(jīng)元損傷等機(jī)制對缺血性腦卒中大鼠起保護(hù)作用。本研究建立了FFZJC主成分的HPLC，可作為本品的質(zhì)量控制方法。