龐麗君 裴明霞 劉 凱 林明華 陳德喜

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所，北京 100069

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ploymerase chain reaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA 片段，可看作生物體外的特殊DNA 復(fù)制。PCR 技術(shù)是20 世紀(jì)80 年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。PCR 技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑，不僅可用于基礎(chǔ)研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫(yī)學(xué)調(diào)查和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究等方面，可以從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA 供分析研究和檢測鑒定[1-2]。PCR 技術(shù)是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，也是科研工作中很常用的技術(shù)，因此，熟練掌握PCR 技術(shù)對研究生以后的科研學(xué)習(xí)以及臨床工作都有至關(guān)重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)原理

PCR 技術(shù)是以擬擴(kuò)增的DNA 分子為模板，以一對與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA 聚合酶作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿DNA 模板鏈延伸直至完成兩條新鏈合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA 片段得到擴(kuò)增。PCR 技術(shù)中反應(yīng)步驟包括預(yù)變性、變性、退火、延伸、再延伸幾個(gè)部分。首先，模板DNA 發(fā)生變性，即高溫下模板DNA 雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合，為后續(xù)反應(yīng)做準(zhǔn)備；其次，模板DNA 與引物的退火，是指模板DNA 經(jīng)過加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板單鏈DNA 上特定部位配對結(jié)合的過程；最后，進(jìn)行引物延伸，DNA 模板-引物結(jié)合物在DNA 聚合酶的作用下，以靶序列為模板，四種脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)配對原則連接在引物之后，使其延伸合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈[3-4]。

2 教學(xué)目標(biāo)

基于課程內(nèi)容要求、具體專業(yè)特點(diǎn)，并圍繞培養(yǎng)學(xué)生科研素養(yǎng)的要求，制訂了如下教學(xué)目標(biāo)：①基于課堂實(shí)例講解，結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟，認(rèn)識并理解PCR 技術(shù)在科研和臨床中的應(yīng)用。②利用已知的基因DNA 序列，嘗試設(shè)計(jì)相應(yīng)片段大小的擴(kuò)增引物。③通過實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，掌握PCR 技術(shù)的操作步驟和儀器設(shè)置。④建立科學(xué)的病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全意識，并在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守及執(zhí)行。

3 教學(xué)過程

3.1 實(shí)驗(yàn)理論

PCR 的主要成分有模板、引物、DNA 聚合酶、底物脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）[7]。以100 μl 總體系為例，各種組分按如下比例加入，10×緩沖液10 μl，4 種dNTP 混合物各200 μmol/L，模板0.1～2.0 μg，DNA 聚合酶2.5 U，Mg2+1.5 mmol/L，加ddH2O 將體積補(bǔ)至100 μl。PCR條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。

3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及安排

考慮到本課程的學(xué)生大都是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院各科室的研究生，醫(yī)院又屬于傳染病相關(guān)醫(yī)院，無論是在科研學(xué)習(xí)還是以后工作中很可能會(huì)涉及感染及傳染性樣本，本實(shí)驗(yàn)課中設(shè)計(jì)使用乙型肝炎患者樣本，學(xué)生通過自己提取乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA 樣本，更深刻地理解病原微生物生物安全操作。我們準(zhǔn)備了不同病毒載量的HBV 患者血清樣本，在生物安全柜中完成HBV DNA 的整個(gè)提取過程。開始實(shí)驗(yàn)前，臺(tái)內(nèi)的廢液桶內(nèi)先噴灑含氯消毒液，實(shí)驗(yàn)過程中如果有樣本溢出到臺(tái)面上，及時(shí)用含氯消毒劑消毒，實(shí)驗(yàn)完成后需要按生物安全要求丟棄實(shí)驗(yàn)廢棄物。新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)后，各個(gè)機(jī)構(gòu)都更加重視實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作，意識到生物安全的重要性，因此在學(xué)生實(shí)驗(yàn)技術(shù)培養(yǎng)過程中也加強(qiáng)了生物安全方面的培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)課程計(jì)劃分兩次課完成，第一次進(jìn)行DNA的提取，并檢測其濃度和質(zhì)量；第二次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增大約需要2 h，最后利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并用凝膠成像儀拍照。

3.3 教學(xué)中發(fā)現(xiàn)的問題

在PCR 實(shí)驗(yàn)課堂上，發(fā)現(xiàn)初學(xué)者在以下幾個(gè)方面的操作和流程上容易出現(xiàn)錯(cuò)誤：不檢查引物濃度，未經(jīng)稀釋直接加入儲(chǔ)存濃度的引物；用移液器進(jìn)行混勻時(shí)，操作不夠輕柔，導(dǎo)致混合液中氣泡很多，不利于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致樣品損失；混勻后忘記瞬時(shí)離心；進(jìn)行PCR 儀設(shè)定時(shí)，容易將分鐘設(shè)置成秒，這是一個(gè)很簡單但很容易出現(xiàn)的操作錯(cuò)誤，設(shè)置好反應(yīng)條件后一定要再次檢查確認(rèn)；PCR 程序遺漏一項(xiàng)，沒有設(shè)定最后的低溫儲(chǔ)存，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)安排有時(shí)不能及時(shí)去取擴(kuò)增產(chǎn)物，避免產(chǎn)物降解，這步設(shè)定還是很有必要的。實(shí)驗(yàn)課程的目的絕不僅僅是熟悉實(shí)驗(yàn)步驟，更加著重培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，每個(gè)細(xì)節(jié)都可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以每步操作都不能隨心所欲。在實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫及研究生平時(shí)進(jìn)行科研實(shí)驗(yàn)過程中，也發(fā)現(xiàn)一個(gè)很容易被學(xué)生忽視卻非常重要的問題，一部分學(xué)生不重視平時(shí)的實(shí)驗(yàn)記錄，盲目著急做更多的實(shí)驗(yàn)，并沒有及時(shí)做實(shí)驗(yàn)記錄，甚至不做記錄，只保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其實(shí)很多時(shí)候?qū)嶒?yàn)失敗是實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)導(dǎo)致，我們可以根據(jù)當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)記錄得到更多提示，發(fā)現(xiàn)其中隱藏的問題，而科研人員經(jīng)常遇到無法重現(xiàn)之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有時(shí)也是因?yàn)闆]有詳盡的實(shí)驗(yàn)記錄，無法復(fù)原當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和條件。因此，實(shí)驗(yàn)記錄的及時(shí)撰寫和整理對于科研學(xué)習(xí)至關(guān)重要。

4 回歸應(yīng)用

由于時(shí)間有限，課堂上只能讓學(xué)生進(jìn)行最基本最普通的PCR 實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)際上PCR 技術(shù)已與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合形成了多種衍生技術(shù)，與醫(yī)學(xué)研究密切相關(guān)的有逆轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)、原位PCR 技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)等[9-10]，其中實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)是科研學(xué)習(xí)中應(yīng)用最多的技術(shù)。

PCR 的用途非常廣泛，主要可以分為幾大類：獲得目的基因片段、DNA 和RNA 的微量分析、DNA 序列分析、基因突變分析、基因的體外突變?；A(chǔ)科研方面的應(yīng)用有目的基因克隆、構(gòu)建重組質(zhì)粒、構(gòu)建點(diǎn)突變、缺失載體、基因表達(dá)檢測、甲基化分析、基因芯片等；臨床應(yīng)用方面包括DNA 親子鑒定、法醫(yī)DNA 鑒定、HBV 耐藥監(jiān)測、非侵入性產(chǎn)前染色體檢測、基因突變分析、細(xì)菌感染耐藥檢測等；其他方面的應(yīng)用：農(nóng)業(yè)方面包括轉(zhuǎn)基因成分的檢測、分子標(biāo)記輔助育種中的單核苷酸多天性標(biāo)記SNP 技術(shù)的應(yīng)用，在食品監(jiān)測及環(huán)境監(jiān)測中也均有應(yīng)用，例如對食品中某一細(xì)菌進(jìn)行定量分析、檢測環(huán)境中的微生物含量等[11-15]。PCR技術(shù)看似相對簡單，功能卻很強(qiáng)大，眾所周知，PCR 核酸檢測對新型冠狀病毒肺炎的診斷發(fā)揮了極其重要的作用，其衍生應(yīng)用不僅僅限于醫(yī)學(xué)，已涉及多個(gè)行業(yè)，是科研工作中不可或缺的一個(gè)技術(shù)手段。

5 教學(xué)總結(jié)

通過這幾年研究生實(shí)驗(yàn)課的帶教工作，個(gè)人有以下體會(huì)。我們承擔(dān)的是研究生一年級《感染與傳染性疾病診斷新技術(shù)進(jìn)展》的第一節(jié)實(shí)驗(yàn)課，大部分研究生剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室或者仍未開始實(shí)驗(yàn)室工作，對于實(shí)驗(yàn)室的基本操作及常規(guī)儀器還沒有直觀的認(rèn)識，需要從移液器的認(rèn)識及使用、離心機(jī)的設(shè)置及使用等基礎(chǔ)知識開始教授。實(shí)驗(yàn)課的目的不僅是讓學(xué)生學(xué)會(huì)某一個(gè)實(shí)驗(yàn)，更是要讓他們從開始就建立規(guī)范操作的意識[16]。有些同學(xué)不重視實(shí)驗(yàn)課，覺得直接跟著師兄師姐做實(shí)驗(yàn)，學(xué)會(huì)操作就可以了，這是一個(gè)不太正確的想法，每個(gè)人都有自己的操作習(xí)慣，并不一定都是規(guī)范的，可能是他們沿襲前人做法，也可能是自己在實(shí)驗(yàn)過程中摸索和總結(jié)的手法，但新手如果知其然而不知其所以然，只是盲目地模仿與重復(fù)，便領(lǐng)會(huì)不到其中的精髓。當(dāng)以后自己獨(dú)立操作時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)過程中遇到從未見過的難題或者出現(xiàn)了無法解釋的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，便會(huì)無從下手，其實(shí)很可能是哪個(gè)細(xì)節(jié)操作不規(guī)范，但卻意識不到，導(dǎo)致花費(fèi)很多無謂的時(shí)間和精力去解決一些失誤。另外筆者認(rèn)為還有一個(gè)很重要的原因，現(xiàn)在的各種試劑盒研發(fā)比較成熟，操作簡單快速，步驟一再簡化，按照說明書新手使用也比較得心應(yīng)手，大大提高了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，但與此同時(shí)也給研究生的科研學(xué)習(xí)帶來一些問題，不了解每個(gè)步驟、每個(gè)試劑組分的功能，因此實(shí)驗(yàn)遇到阻礙時(shí)，只是單純的重復(fù)，或者更換試劑盒，無法從中其中尋找問題的根源。

因此，在實(shí)驗(yàn)課課堂上，從老師的角度講，不光是教會(huì)同學(xué)們怎么操作，首先要講清楚實(shí)驗(yàn)原理，并且依次說明每個(gè)步驟的實(shí)際意義和所用試劑的功能，哪些步驟不可改動(dòng)，哪些地方可以自主進(jìn)行調(diào)整以及其中的原因，從而加強(qiáng)同學(xué)們對理論知識的理解，當(dāng)然也要把自己親歷的、見到的錯(cuò)誤做法舉例講解，以后的實(shí)驗(yàn)中他們可以避免走入誤區(qū)或者遇到類似的問題不至于束手無策，能夠盡快找到失敗的根源[17-18]。同時(shí)，所有的實(shí)驗(yàn)流程做到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，教師在課堂上要認(rèn)真巡視和指導(dǎo)，及時(shí)糾正學(xué)生錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)操作，適時(shí)示教規(guī)范操作，避免學(xué)生在以后的實(shí)驗(yàn)中走不必要的彎路[19]。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是醫(yī)學(xué)研究生科研學(xué)習(xí)的一門基礎(chǔ)課程，其理論和技術(shù)是抽象和復(fù)雜的，為了提高學(xué)生對這門課程的學(xué)習(xí)興趣和動(dòng)手操作能力，提高學(xué)生的分析、理解能力，可以采用啟發(fā)式和討論式的教學(xué)方法[17,20-21]。作為老師，我也會(huì)更加重視實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，通過更豐滿的教案和更生動(dòng)的舉例使學(xué)生認(rèn)識到實(shí)驗(yàn)本身也許并無難點(diǎn)，但細(xì)節(jié)決定成敗。

通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)能夠加深學(xué)生對于理論知識的理解，提高其獨(dú)立動(dòng)手的能力，對于加強(qiáng)學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)和科研綜合能力的提升至關(guān)重要[22-23]。但如果在課堂只是讓學(xué)生機(jī)械地模仿，也可能會(huì)使學(xué)生失去思考與創(chuàng)新的能力，因此教師可以讓學(xué)生更多地參與到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，鼓勵(lì)研究生盡早參與到科學(xué)研究及創(chuàng)新活動(dòng)中，訓(xùn)練研究生的動(dòng)手、分析與解決問題的能力，為將來科研及臨床學(xué)習(xí)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[24-25]