薛小春， 陸翠華， 田堯

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇省南通市226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇省南通市226001；3.海安市人民醫(yī)院，江蘇省海安市226600)

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，對(duì)結(jié)腸癌分子機(jī)制研究的不斷進(jìn)展將有助于尋找新的治療方法。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白(glioma associated oncogene proteins,GLI)是C2H2-Kruppel型轉(zhuǎn)錄因子[1]，特定同源物和細(xì)胞環(huán)境存在4種GLI蛋白(GLI1、GLI2、GLI3和GLI4)，可作為基因表達(dá)激活劑或阻遏物[2]。GLI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與GLI蛋白作為Hedgehog(HH)信號(hào)通路的下游效應(yīng)器所發(fā)揮的作用有關(guān)，也稱為HH/GLI信號(hào)通路[3]。GLI1通過HH的非典型上調(diào)和/或激活是多種癌癥的致癌驅(qū)動(dòng)因素，包括結(jié)腸癌[4]。但是，同為GL1家族的GLI4在癌癥中的作用尚不明確?；诖耍狙芯恐荚谔接慓LI4在結(jié)腸癌中的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 入選病例

納入2019年10月—2021年10月本院收治的結(jié)腸癌患者160例，其中男94例，女66例，年齡(69.15±25.07)歲。所有患者術(shù)前未接受任何治療，組織被采集后快速冷凍在液氮中，-80 ℃保存。所有患者均病理確診，并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

GLI4哺乳動(dòng)物過表達(dá)質(zhì)粒和siGLI4均由南京金斯瑞設(shè)計(jì)合成。Lipofectamine 3000購(gòu)自廣州瑞舒生物科技有限公司。SYBR-green IMaster Mix購(gòu)自Thermo公司。N-cadherin、E-cadherin、NANOG、OCT4、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司。GLI4抗體購(gòu)自Sigma公司。 白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)ELISA試劑盒購(gòu)自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。IL-5 ELISA試劑盒購(gòu)自北京奇松生物科技有限公司。IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自北京依珊匯通科技有限公司。IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自安徽澤升科技有限公司。TRIzol試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Cell Counting Kit-8購(gòu)自廣州寶匯生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、SW1116購(gòu)自Procell公司。結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、SW1116于37 ℃、5%CO2在含有10%胎牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)。將GLI4哺乳動(dòng)物過表達(dá)質(zhì)粒和siGLI4用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染LoVo或SW1116細(xì)胞中48 h后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞GLI4、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染GLI4過表達(dá)質(zhì)粒后，利用TRIzol從SW1116細(xì)胞中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用SYBR-green IMaster Mix進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。使用2-ΔΔCt計(jì)算基因表達(dá)，并通過GAPDH歸一化進(jìn)行定量。GLI4-F：5′-GGAGTCAACTTCGGTCGGAG-3′，R：5′-TCAGGA GCAGCGAGTTATACT-3′；GAPDH-F：5′-TGTGGGC ATCAATGGATTTGG-3′，R：5′-ACACCATGTATTCC GGGTCAAT-3′；IL-4-F：5′-GCCAAGACCCCTTCG AGAAAT-3′，R：5′-CCGATCCTGTTATCTGCCTCC-3′；IL-5-F：5′-ATCATCGTGGCGCATGTATTAC-3′，R：5′-AAAGAACTTGAGCCAAACCAGT-3′；IL-6-F：5′-GAA GAGCGCCGCTGAGAAT-3′，R：5′-GTGCAGAGGGTTTAATGTCAACT-3′；IL-10-F：5′-TACCACCTCCCGAA AATGTCA-3′，R：5′-CCCAGTCTGAATGCTCATCTG-3′。

1.5 TCGA數(shù)據(jù)收集和分析

從TCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載結(jié)腸癌表達(dá)譜。本研究收集87個(gè)樣本的htseq計(jì)數(shù)和每千堿基外顯子每百萬(wàn)reads mapped(FPKM)的片段，檢索患者人口學(xué)信息和生存終點(diǎn)。利用DEseq2分析GLI4在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異。當(dāng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)調(diào)整P<0.05時(shí)，log(fold-change)>1.0或<-1.0分別被定義為下調(diào)或上調(diào)基因。

1.6 免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織GLI4蛋白表達(dá)水平。包埋組織切片，65 ℃脫蠟4 h，放置在0.3%過氧化氫和甲醇溶液中30 min。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，組織切片樣品與GLI4一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，室溫下生物素化二抗孵育20 min。陰性對(duì)照用另一個(gè)芯片中的稀釋緩沖液代替一抗。PBS洗滌后，DAB中孵育5 min，進(jìn)行免疫染色。洗滌后，用乙醇和二甲苯脫水，用永久培養(yǎng)基固定，顯微鏡下觀察，根據(jù)染色深度判斷GLI4表達(dá)水平。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

按照說(shuō)明書操作，用ELISA IL-4、IL-5、IL-6和IL-10試劑盒分別測(cè)量結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW116上清中IL-4、IL-5、IL-6、IL-10含量。使用自動(dòng)酶標(biāo)儀ELX 808IU在450 nm處讀取光密度。使用二次曲線擬合分析結(jié)果。

1.8 細(xì)胞增殖的測(cè)定

結(jié)腸癌LoVo或SW1116細(xì)胞增殖由Cell Counting Kit-8確定。將細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，按照說(shuō)明操作，在570 nm處測(cè)量光密度。

1.9 免疫印跡

LoVo或SW1116細(xì)胞用裂解緩沖液在冰上裂解，裂解液在12 000×g條件下離心15 min。BCA試劑盒用于評(píng)估蛋白水平。蛋白經(jīng)SDS-PAGE處理，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗和二抗按順序孵育膜。利用ECL檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化檢測(cè)。使用ImageJ計(jì)算蛋白質(zhì)條帶的灰度值，結(jié)果以灰度值顯示。

1.10 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和免疫浸潤(rùn)分析

利用TRIzol試劑從結(jié)腸癌組織中抽取RNA，由諾禾致源公司進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析免疫細(xì)胞分子標(biāo)志物；根據(jù)測(cè)序結(jié)果中免疫細(xì)胞分子標(biāo)志物的表達(dá)水平檢測(cè)GLI4表達(dá)與CD56brightNK細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 GLI4在結(jié)腸癌的表達(dá)水平和對(duì)預(yù)后的影響

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸癌患者基于不同GLI4表達(dá)組的Kaplan-Meier生存分析，GLI4高表達(dá)患者的中位生存期低于低表達(dá)患者(圖1A)。在TCGA(圖1B)和本研究(圖1C)隊(duì)列中，GLI4在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均高于癌旁正常組織,本研究隊(duì)列中GLI4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期具有相關(guān)性(P<0.05；表1)。

圖1 GLI4在結(jié)腸癌的表達(dá)水平和對(duì)預(yù)后的影響

表1 不同表達(dá)水平GLI4與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系(n=80) 單位：例(%)

2.2 GLI4促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力和干性

結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW1116增殖在過表達(dá)GLI4后上升，在敲低GLI4后下降(P<0.05；圖2)。結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW1116的E-cadherin水平在過表達(dá)GLI4后下降，在敲低GLI4后升高；N-cadherin則與E-cadherin相反；提示GLI4的敲低阻斷了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程(P<0.05；圖2)。過表達(dá)GLI4后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW1116的NANGOG和OCT4在過表達(dá)GLI4后上升，在敲低GLI4后下降，提示GLI4的敲低減少了結(jié)腸癌細(xì)胞的干性(P<0.05；圖2)。

2.3 GLI4促進(jìn)CD56bright NK細(xì)胞抑制因子的分泌

將免疫浸潤(rùn)中的免疫細(xì)胞與GLI4表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CD56brightNK細(xì)胞數(shù)與GLI4的表達(dá)水平呈正相關(guān)(圖3A)。結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW1116中CD56brightNK細(xì)胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10在過表達(dá)GLI4后上升，在敲低GLI4后下降(圖3B)。

圖3 GLI4促進(jìn)CD56bright NK細(xì)胞抑制因子的分泌

3 討 論

在全球癌癥發(fā)病率和死亡率排名中，結(jié)腸癌分別位列第三位和第四位[5]，每年有超過100萬(wàn)新的結(jié)腸癌病例和大約60萬(wàn)人死于結(jié)腸癌[6]。結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多種因素，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活[7]。由于抗腫瘤治療方法的改進(jìn)，近幾十年來(lái)，每年的死亡人數(shù)正在逐漸減少[8]。遺傳和表觀遺傳的改變被認(rèn)為與結(jié)腸癌惡化密切相關(guān)[9]。據(jù)預(yù)測(cè)，結(jié)腸癌的死亡率將在2035年前不斷攀升[10]。對(duì)結(jié)直癌分子機(jī)制的不斷探討將有助于尋找新的治療方法。

本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)GLI4高表達(dá)結(jié)腸癌患者的中位生存期明顯低于低表達(dá)患者。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的隊(duì)列和本研究隊(duì)列結(jié)腸癌患者中，GLI4在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。此外，GLI4的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)分期具有相關(guān)性。因此，GLI4的表達(dá)水平可以作為結(jié)腸癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GLI4后結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW1116增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力和干性水平上升。GLI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與Hedgehog(HH)信號(hào)通路的下游效應(yīng)器所發(fā)揮的作用有關(guān)，也稱為HH/GLI信號(hào)通路，GLI蛋白是Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)的效應(yīng)物，在胚胎發(fā)育期間參與許多細(xì)胞增殖和分化等過程，GLI轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合靶基因上的共有序列以啟動(dòng)或抑制轉(zhuǎn)錄[11]。有研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子GLI1在卵巢上皮癌中表達(dá)水平顯著高于卵巢正常上皮組織,在卵巢上皮癌中表達(dá)水平顯著高于卵巢上皮良性腫瘤,其在卵巢上皮癌細(xì)胞的高表達(dá)可能參與促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展,推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子GLI1可能作為卵巢上皮癌的治療靶點(diǎn)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗狀細(xì)胞癌病變過程中HH通路被異常激活，GLI2在該通路活化過程中發(fā)揮重要作用[13]。干擾GLI2表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、遷移和侵襲。GLI2通過調(diào)控HH通路下游細(xì)胞遷移和侵襲標(biāo)志基因及蛋白的表達(dá)而影響口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲。GLI3在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織表達(dá)上調(diào),并同腫瘤組織的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)和腫瘤TNM分期密切相關(guān)。GLI3過表達(dá)可能與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移行為有關(guān),有望成為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的潛在的腫瘤靶標(biāo)或預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[14]。因此，抑制GLI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活可以成為治療各種人類惡性腫瘤的潛在的化療策略。

NK細(xì)胞可以根據(jù)CD56的相對(duì)表達(dá)細(xì)分為不同的亞群[15]。CD56brightNK細(xì)胞被認(rèn)為是具有免疫調(diào)節(jié)特性的有效細(xì)胞因子生產(chǎn)者，在抗感染和抗癌防御中起關(guān)鍵作用[16]?？紤]到CD56brightNK細(xì)胞具有腫瘤殺傷作用，并且促癌因子GLI4的表達(dá)水平與其數(shù)量呈正相關(guān)，因此本研究檢測(cè)了GLI4是否促進(jìn)CD56brightNK細(xì)胞抑制因子的分泌。本研究過表達(dá)GLI4后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和SW1116中CD56brightNK細(xì)胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌水平上升。因此，即使在結(jié)腸癌組織中浸潤(rùn)了很多CD56brightNK細(xì)胞，GLI4也可以促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子分泌來(lái)抑制CD56brightNK細(xì)胞的抗腫瘤功能。

綜上所述，高GLI4表達(dá)與結(jié)腸癌患者的癌癥進(jìn)展和中位生存期顯著相關(guān)。GLI4可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖水平、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力和干性水平。此外，GLI4可以促進(jìn)CD56brightNK細(xì)胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的表達(dá)。