高質(zhì)涵，高銘澤，孫 藝，劉海峰，付高潔，肖 陽(yáng)

(1. 牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011) (2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011) (3. 東北財(cái)經(jīng)大學(xué)工商管理學(xué)院，遼寧 大連 116000) (4. 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

1 前 言

可生物降解金屬在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了越來(lái)越多的關(guān)注，因?yàn)樗鼈冊(cè)谶_(dá)到所需功能后可以自行降解，減少帶給患者的經(jīng)濟(jì)和身體負(fù)擔(dān)，適合作為臨時(shí)固定的骨科植入物使用。鎂材料被視為最適合用作新一代人體植入材料的可生物降解金屬[1]。近年來(lái)，眾多研究表明，鎂合金具有優(yōu)異的生物相容性和物理特性，可用于醫(yī)療應(yīng)用，尤其是作為骨科和頜面植入物[2]。目前應(yīng)用于臨床的植入物材料包括不可降解金屬(例如鈦合金)和可生物吸收的聚合物[3]。盡管鈦合金材料目前已被廣泛使用，但這種材料具有一定的局限性，主要包括對(duì)周圍骨骼的應(yīng)力屏蔽，必要時(shí)需要做去除植入物的翻修手術(shù)以及在術(shù)后一段時(shí)間可能發(fā)生變形。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，這些不可降解金屬會(huì)產(chǎn)生有害的磨損顆粒，從而導(dǎo)致植入物松動(dòng)和故障，甚至發(fā)生骨溶解[1-3]?？山到獾目缮镂站酆衔锿狈Τ休d植入物[4]所需的機(jī)械強(qiáng)度。聚合物植入物在手術(shù)期間和術(shù)后發(fā)生斷裂的情況已被報(bào)道，這種情況下患者的恢復(fù)更加復(fù)雜，引起了人們對(duì)植入材料安全性的擔(dān)憂[5-9]。此外，可生物吸收的聚合物材料還會(huì)產(chǎn)生酸性降解產(chǎn)物，從而進(jìn)一步導(dǎo)致植入失敗和組織炎癥。

鎂基植入物的主要優(yōu)點(diǎn)在于鎂的生物可降解和可吸收特性，其中鎂的降解產(chǎn)物可被排泄或用于代謝過(guò)程，并且其機(jī)械性能與皮質(zhì)骨相當(dāng)。鎂是人體細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外液中最豐富的陽(yáng)離子之一，對(duì)骨骼和牙齒的形成至關(guān)重要。人體中50%～60%的鎂存在于骨骼中，其中細(xì)胞外液的鎂離子濃度在0.70～1.05 mmol/L之間，人體通過(guò)腎臟和腸道來(lái)維持體內(nèi)鎂離子的穩(wěn)態(tài)。盡管鎂是一種有前途的適用于承重醫(yī)療植入物的材料，但它由于在生理?xiàng)l件下降解得太快而無(wú)法滿足臨床要求[10-13]。鎂合金的降解速率應(yīng)足夠慢，以便在組織再生前保持植入物的承載性能?？焖俳到鈺?huì)導(dǎo)致過(guò)早的機(jī)械故障或植入物脫落，并增加局部pH值。與純鎂材料相比，合金化可以不同程度地降低鎂合金材料的降解速率，提高其機(jī)械性能，同時(shí)促進(jìn)骨骼的形成等[14-16]。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究并優(yōu)化鎂合金成分，以改善應(yīng)用于骨科和頜面修復(fù)領(lǐng)域中的鎂合金植入物的生物降解性、生物活性、生物相容性和機(jī)械性能等。

與純鎂相比，改善鎂合金材料的降解性能及與細(xì)胞相互作用的研究可以潛在地控制其晶粒尺寸、表面微觀結(jié)構(gòu)、降解及機(jī)械性能[16-20]。鎵(Ga)和鍶(Sr)作為合金元素除了可以提高鎂合金的物理和機(jī)械性能外，Ga還具有一定的抗菌能力，研究發(fā)現(xiàn)Ga在骨代謝中也發(fā)揮著一定的作用；Sr具有與鈣(Ca)類似的化學(xué)特性，主要集中在骨骼中的骨小梁處[21, 22]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，Sr可以改善骨質(zhì)疏松癥患者的骨質(zhì)量和結(jié)構(gòu)完整性[23-26]，且可以改善羥基磷灰石水泥的降解和生物相容性[27, 28]。本研究在純鎂中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ga和Sr元素制備了鎂合金材料，探索了這些鎂合金材料在體內(nèi)外的相容性及是否有促進(jìn)骨愈合的能力。此外，還選用人脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)培育法對(duì)鎂合金體外生物相容性效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將材料植入到SD大鼠股骨內(nèi)以此來(lái)評(píng)價(jià)材料在體內(nèi)的相容性和對(duì)骨愈合的促進(jìn)作用。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)材料用高純度金屬M(fèi)g(99.95%，雜質(zhì)含量≤0.05%)和商業(yè)級(jí)純度金屬Ti由澳大利亞奧古斯特金屬合金公司提供。Mg-0.1Ga，Mg-0.1Sr和Mg-0.1Ga-0.1Sr(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鑄錠是通過(guò)真空感應(yīng)熔煉法融化純Ga(99.9%)、Sr(99.9%)(Alfa Aesar，美國(guó))和高純Mg共同制備的。將原材料Mg，Ga和Sr儲(chǔ)存在陰涼、干燥和密封的環(huán)境中，將制備的鎂合金樣品放置在真空干燥設(shè)備中，以避免在露天環(huán)境中的污染和氧化(腐蝕)。為了最大程度地減少熔融Mg的氧化和燃燒，將爐膛抽真空至0.2～1 MPa、加溫至約50 ℃，并用保護(hù)性氬氣吹掃。將與熔融鎂接觸的設(shè)備(包括攪拌器、熱電偶保護(hù)器和模具)均預(yù)先噴灑涂覆石墨，以減少鐵的污染。將金屬混合物以3～5 ℃/s的升溫速率加熱到760 ℃，并保持25～30 min，每5 min劇烈攪拌一次；然后將熔體轉(zhuǎn)移到預(yù)熱至250 ℃(以減少收縮)的矩形模具中，并自然冷卻至室溫；將純鎂、鎂合金和純鈦分別加工成直徑為15 mm、厚度為3 mm的圓片狀和直徑為1 mm、長(zhǎng)為10 mm的棒狀試樣，以進(jìn)行體外相容性實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)之前，使用蒸餾水作為潤(rùn)滑劑，用砂紙對(duì)加工后的樣品進(jìn)行機(jī)械打磨直到2000粒度，然后分別在丙酮、乙醇(96%)和去離子水中超聲清洗5 min，后在通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干備用。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

采用hMSCs進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)(hMSCs細(xì)胞購(gòu)買于上海澤葉生物科技有限公司)。將含有16% 胎牛血清(Gibco，美國(guó))和1%雙抗的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco，美國(guó))與hMSCs細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，用胰酶將貼壁的hMSCs從培養(yǎng)液中分離出來(lái)，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將hMSCs細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于24孔板的培養(yǎng)基中(每組3孔)，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞獲得最佳粘附后，再與制備的鎂合金樣品在DMEM培養(yǎng)基中浸泡72 h。后用溴化乙錠(EB)和吖啶橙(AO)染色15 min，用磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline，PBS)溶液沖洗3次，然后采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM，奧林巴斯，F(xiàn)V1000)進(jìn)行觀察，以此來(lái)評(píng)價(jià)各組培養(yǎng)基中細(xì)胞的增殖情況。

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的3個(gè)月的無(wú)特定病原體(SPF)級(jí) SD大鼠36只，其平均體重為215 g(140～228 g)。將大鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。用聚維酮碘消毒后，在大鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.9 mL/100 g)對(duì)大鼠實(shí)施麻醉，確定穿刺點(diǎn)，并在股骨內(nèi)上髁最高點(diǎn)位置使用克氏針定位鉆孔，沿通踝線方向鉆開直徑2 mm小孔，鉆透雙層皮質(zhì)，并將準(zhǔn)備好的材料插入鉆開的骨髓腔中，如表1和圖1所示。用骨蠟封閉，然后用無(wú)菌生理鹽水沖洗，逐層縫合(未給予抗生素)，手術(shù)后的大鼠被安置在無(wú)菌、通風(fēng)的房間飼養(yǎng)。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組

圖1 植入材料與大鼠股骨冠狀位(a)和矢狀位(b)示意圖Fig.1 Schematic diagrams of coronal view (a) and sagittal view (b) of planted material and femur of rats

2.3.1 X射線透視觀察

植入術(shù)后第3 d和第5 d，取出實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行呼吸麻醉，后進(jìn)行X射線透視觀察。

2.3.2 Micro-CT掃描

植入術(shù)后7 d，將大鼠處以安樂(lè)死，后取出股骨標(biāo)本固定，并進(jìn)行Mirco-CT掃描(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)分子影像研究中心，SuperArgus 小動(dòng)物PET/CT)。

2.3.3 掃描電鏡觀察

將20 g重鉻酸鉀溶于40 mL蒸餾水中，邊攪拌溶解邊加入400 mL濃硫酸配置得到鉻酸溶液，將Mirco-CT掃描后的股骨標(biāo)本材料用鉻酸洗液清洗表面化合物沉積，然后使用掃描電鏡(德國(guó)蔡司，SIGMA500)觀察植入材料的表面形貌。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，3組間比較采用方差分析。數(shù)據(jù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 體外相容性

純鎂、各組鎂合金材料和純鈦對(duì)hMSCs的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖2所示。其中具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞被染色成熒光綠色，而具有受損細(xì)胞膜的死細(xì)胞被染色成熒光紅色。由圖2a～2f可以明顯看出，空白組細(xì)胞(圖2f)顯示出良好的細(xì)胞擴(kuò)散能力且?guī)缀鯖](méi)有死亡細(xì)胞；純鈦組細(xì)胞仍能很好地分布(圖2e)，同空白對(duì)照組結(jié)果相似；純鎂組及鎂合金材料組中，可以在培養(yǎng)基中觀察到一定比例的死細(xì)胞(圖2a～2d)，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，鎂合金材料Mg-Ga-Sr的培養(yǎng)基中死亡細(xì)胞比例低于Mg、Mg-Sr和Mg-Ga的，這表明Mg-Ga-Sr鎂合金材料對(duì)細(xì)胞的毒性較小。通過(guò)Image J軟件對(duì)細(xì)胞熒光染色圖進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，死亡細(xì)胞占比數(shù)據(jù)結(jié)果如圖2g所示。相較于純鈦，純鎂和鎂合金材料都顯示出一定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性；相比鎂合金材料，純鈦與細(xì)胞展現(xiàn)出更加兼容的狀態(tài)，這表明在體外環(huán)境鎂合金材料的降解過(guò)程尤其是在早期階段會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生一定的抑制作用，這可能是鎂合金材料在培養(yǎng)基中降解釋放的OH離子、過(guò)量的Mg離子以及Ga離子和Sr離子所致。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光染色照片，綠色為活細(xì)胞，紅色為死亡細(xì)胞(a～f)；用Image J軟件分析得到的死亡細(xì)胞占比數(shù)據(jù)(g)Fig.2 Fluorescent staining pictures of cells in each experimental group, green is the living cells and red is the dead cells (a～f); the proportion of dead cells analyzed by Image J software (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001) (g)

3.2 體內(nèi)相容性

3.2.1 X射線透視結(jié)果

大鼠術(shù)后第3 d和第5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)麻醉拍攝的X射線透視照片如圖3所示。其中黑色箭頭指示材料所在部位，白色箭頭指示氣腔。由圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，純鎂和鎂合金材料體積逐漸縮小，對(duì)比純鈦和空白組(圖3e和3f)，植入初期鎂合金材料周圍形成了一些氣腔(圖3a～3d)，這些氣腔是鎂合金材料降解產(chǎn)生；隨著時(shí)間的推移，氣腔逐漸縮小(圖3g～3j)，一是因?yàn)楸粰C(jī)體自行吸收，二是純鎂和鎂合金表面形成的氧化層減緩了降解速率。由圖3g～3j可以看到，Mg-Ga-Sr合金組氣腔小于其他組，表明加入Ga和Sr元素可以延緩鎂合金材料的降解速率，從而使反應(yīng)產(chǎn)生的氣體減少。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第3 d(a～f)和第5 d(g～l)大鼠X射線透視照片F(xiàn)ig.3 X-ray fluoroscopy images of rats in each experimental group at 3rd (a～f) and 5th (g～l) after surgery

3.2.2 Micro-CT結(jié)果

大鼠術(shù)后7 d安樂(lè)死后的股骨Micro-CT掃描照片如圖4所示。對(duì)比鎂材料組(圖4a～4d)，純鈦組與空白對(duì)照組(圖4e和4f)周圍無(wú)任何白色信號(hào)。此外，可以看到加入Sr元素的鎂合金周圍有不同程度的線性不規(guī)則白色信號(hào)影(鈣鹽沉積)，Micro-CT顯影程度表明，Mg-Sr及Mg-Ga-Sr材料周圍的沉積顯影比其他材料組更為明顯。這表明加入Sr元素可以提高鎂合金材料促進(jìn)骨愈合的能力。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7 d股骨樣本的Micro-CT掃描照片F(xiàn)ig.4 Micro-CT scan images of the samples at 7 d after surgery in each experimental group

3.2.3 掃描電鏡結(jié)果

大鼠術(shù)后7 d后取骨組織中植入材料清洗，后拍攝的掃描電鏡照片如圖5所示，可以看出純鈦表面幾乎無(wú)任何改變，純鎂和鎂合金材料表面有不同程度的腐蝕痕跡，且鎂合金材料表面腐蝕痕跡更小，也進(jìn)一步證明合金化可以減緩鎂材料的降解。

圖5 術(shù)后7 d植入材料清洗后的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5 SEM images of the planted material surface after material removal and clean at 7 d after operation

從臨床角度來(lái)看，理想的鎂材料植入物應(yīng)在一定時(shí)間段內(nèi)具有良好的支持作用，以適應(yīng)骨折的愈合過(guò)程，并向周圍組織釋放無(wú)毒無(wú)害物質(zhì)。鎂合金材料具有較高的化學(xué)和電化學(xué)活性，在與生理環(huán)境接觸后容易發(fā)生降解(或腐蝕)。目前的研究工作主要集中于探索抑制鎂合金降解動(dòng)力學(xué)的方法，以滿足臨床要求，即植入物在12～18周內(nèi)仍可保持較好的機(jī)械強(qiáng)度[27-29]。Wang等[17]首次提出通過(guò)將原始Mg基質(zhì)與Sr合金化來(lái)控制Mg合金生物學(xué)性能的概念性工作，通過(guò)延緩Mg-Sr合金降解的方式，將Sr元素緩慢地釋放到生物系統(tǒng)中，使Sr元素發(fā)揮促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本文在制備鎂合金材料時(shí)使用添加0.1%的Ga和0.1%的Sr元素的微合金化方案，是因?yàn)閺碾娀瘜W(xué)的角度來(lái)看，0.1%的Ga和0.1%的Sr含量遠(yuǎn)低于兩種元素在鎂中的固溶度，因此不會(huì)產(chǎn)生微電偶而影響材料的降解速率。因此，在鎂材料中通過(guò)合金化方法加入具備其它作用的元素，不僅可以實(shí)現(xiàn)鎂材料功能化，還可以延緩鎂材料降解過(guò)快的問(wèn)題。結(jié)合圖3中植入材料釋放的氣體量和圖5中植入材料表面形貌，可以看出Ga和Sr微合金化可以進(jìn)一步減緩鎂材料的降解。

前期研究發(fā)現(xiàn)，鎂材料的過(guò)快降解會(huì)導(dǎo)致緩沖的生理介質(zhì)的pH值急劇上升(高達(dá)10.0)，并釋放出過(guò)量Mg離子[3]，這些離子對(duì)包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的活生物體的大多數(shù)代謝功能均具有一定的毒性作用[30-33]。鎂材料在體外實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同程度的抑制(圖2)，這主要是因?yàn)殒V材料降解導(dǎo)致培養(yǎng)基中Mg2+濃度高和pH迅速改變使得細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生轉(zhuǎn)變[34-36]。根據(jù)報(bào)道，當(dāng)用含Mg離子的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hMSCs時(shí)，100倍的稀釋提取物比10倍稀釋的培養(yǎng)基具有更低的抑制作用[25-30]，因此找到合適的鎂合金成分配比，使材料具備理想的降解率，可以使鎂合金材料具有良好的生物相容性。研究表明，DMEM中Sr離子的存在促進(jìn)了hMSCs和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。盡管目前尚未有研究明確定義Ga離子的體外生物相容性，但一些研究表明Ga離子的存在可能會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]，而相關(guān)機(jī)制還不明確。

體內(nèi)模型是一種成本高昂但直接有效的實(shí)驗(yàn)方法，可用于評(píng)估生物系統(tǒng)與植入材料之間的相互作用并為后續(xù)的臨床試驗(yàn)提供參考。本研究采用基于SD大鼠的動(dòng)物模型來(lái)對(duì)鎂合金材料進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)，揭示了Ga離子和Sr離子在短時(shí)間內(nèi)的釋放有助于骨組織恢復(fù)。圖4中的Micro-CT照片顯示，與純鈦相比，純鎂和鎂合金材料植入物周圍均有不同程度的鈣鹽沉積，加入Sr元素的鎂合金材料鈣鹽沉積的顯影較其他鎂材料更為明顯，而鈣鹽沉積是骨修復(fù)的前提條件，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[35, 36]。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在鎂合金材料植入后骨損傷在一定程度上得到了修復(fù)，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同(表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的抑制作用)，分析認(rèn)為鎂材料體外生物相容性實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的抑制作用和培養(yǎng)基的固定性相關(guān)，培養(yǎng)基內(nèi)環(huán)境組成固定，鎂材料降解釋放的離子濃度只會(huì)越來(lái)越高，而機(jī)體是一個(gè)時(shí)刻都在進(jìn)行物質(zhì)交換的大環(huán)境，材料降解產(chǎn)生的離子很少會(huì)在一處大量聚集，離子會(huì)通過(guò)體液交換代謝掉，因此鎂合金材料相容性在體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比體外實(shí)驗(yàn)更具代表性。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)向鎂材料中微量添加Ga和Sr元素的合金化手段可以減緩鎂合金的降解速率，同時(shí)Ga和Sr元素的加入可以促進(jìn)骨組織恢復(fù)。鎂基合金材料作為新型臨床醫(yī)用材料具有廣闊的前景，而Ga，Sr元素以及Mg元素在機(jī)體中對(duì)骨愈合的促進(jìn)作用的具體機(jī)制仍需更加深入的研究。