王文艷 周 希 魏 貞 喻惜珍 熊國遠(yuǎn)

(1. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 451450；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 3. 安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實驗室，安徽 合肥 230036)

近年來，天然色素指示薄膜常用來檢測食品的新鮮度，其作用機(jī)制是食品在由新鮮到腐敗的過程中，微生物和蛋白氧化會釋放出胺類物質(zhì)，造成食品包裝內(nèi)的環(huán)境呈堿性，具有pH響應(yīng)性的天然色素會產(chǎn)生可見的顏色變化，以此判斷食品新鮮程度[1-2]。該方法具有低成本、實時、可生物降解和方便安全等優(yōu)點[3]。目前，具有pH響應(yīng)性的天然色素主要來源于植物提取物，例如花青素[4]、紅蘿卜提取物[5]、姜黃素[6]和馬黛茶提取物[7]等。但從植物中分離獲取的花青素極不穩(wěn)定，容易受溫度、pH、光、氧氣、酶和金屬離子的影響，從而發(fā)生降解。因此，如何提高天然色素在薄膜基質(zhì)中的穩(wěn)定性是亟待解決的問題。B?kowska等[8]發(fā)現(xiàn)，紫外線對花青素穩(wěn)定性的影響要大于高溫和貯藏時間。Zhai等[9]采用含有TiO2的吉蘭糖膠基的光阻隔層(外層)來保護(hù)由瓊脂和花青素制成的指示層(內(nèi)層)。He等[10]將玉米醇溶蛋白薄膜和指示薄膜復(fù)合，制備出高疏水性和高機(jī)械性能的雙層指示膜。Zhou等[11]以卡拉膠基質(zhì)作為內(nèi)層，花青素、姜黃素和花青素—姜黃素(1∶1)為指示劑，魔芋葡甘聚糖和山茶油作為疏水保護(hù)外層，制備指示薄膜并測定各薄膜的理化性能，結(jié)果表明疏水保護(hù)層的嵌入顯著改善了指示薄膜的疏水性和抗紫外性能。上述研究均缺乏對指示薄膜貯藏穩(wěn)定性的研究。

研究擬以卡拉膠為基質(zhì)，花青素為指示層，魔芋葡甘聚糖和山茶油混合而成的乳化層作為疏水外層，通過澆鑄的方法制備雙層指示薄膜，測定指示薄膜在室溫、冷藏和冷凍條件下貯藏35 d的抗氧化性能、厚度、機(jī)械性能和水分等指標(biāo)，評價該指示薄膜的貯存穩(wěn)定性，以期為花青素指示薄膜的商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

越橘花青素：純度35%，西安百川生物科技公司；

姜黃素：純度95%，北京索萊寶科技公司；

魔芋葡甘聚糖、κ-卡拉膠：合肥博美生物科技有限公司；

山茶油：江西寶林天然香料有限公司；

甘油：西隴科學(xué)股份有限公司；

吐溫80、聚苯乙烯培養(yǎng)皿和無水硅膠：上海源葉生物科技有限公司；

其余試劑：分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)備

分析電子天平：JA503型，常州幸運電子設(shè)備有限公司；

超聲波細(xì)胞破碎儀：JY92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速分散器：IKA型，德國IKA科技有限公司；

智能薄膜拉伸力學(xué)試驗儀：XLW型，濟(jì)南蘭光光電技術(shù)有限公司；

全自動手持色差計：CR-400型，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；

紫外分光光度計：PE-Lambda型，美國PE儀器有限公司。

1.3 花青素指示膜的制備與處理

參照文獻(xiàn)[11]的方法制備出花青素指示膜，將雙層指示膜放置在25 ℃環(huán)境中干燥72 h后待測。將干燥后的花青素指示膜分別置于25，4，-18 ℃下貯藏，每隔1周(0，7，14，21，28，35 d)取樣在室溫下平衡6 h后測定厚度、機(jī)械強(qiáng)度、色差和抗氧化性能等指標(biāo)。

1.4 理化指標(biāo)測量

1.4.1 機(jī)械性能 參考Ruan等[12]的方法并稍作修改。將花青素指示膜裁剪為8 cm×2 cm的矩形，使用薄膜拉伸儀測量斷裂伸長率(EAB)，初始夾具之間的距離設(shè)置為60 mm，以50 mm/min的拉伸速度進(jìn)行試驗測量抗拉強(qiáng)度(TS)。

1.4.2 厚度 利用精度為0.001 mm的螺旋測微器進(jìn)行測定，在每片薄膜上隨機(jī)選取5個點進(jìn)行測量。

1.4.4 抗氧化性能

(1) 總酚含量測定：稱取25 mg薄膜加入到3 mL乙醇溶液中混合均勻后得到提取液?？偡雍康臏y定參考Balqis等[13]的方法進(jìn)行。量取0.3 mL提取液，加入2.5 mL 福林酚試劑(體積分?jǐn)?shù)10%)，再加入2 mL 7.5 g/mL碳酸鈉溶液，50 ℃水浴5 min后于600 nm處測量吸光度值。用沒食子酸溶液(0～1 000 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以每克薄膜的微克沒食子酸當(dāng)量(GAE)表示。

(2) DPPH自由基清除率測定：參照Adilah等[14]的方法。量取3 mL提取液并加入1 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液后混合均勻并在黑暗處室溫靜置30 min。測量混合液和以未加提取液的DPPH溶液在517 nm處的吸光度值。DPPH自由基清除率按式(1)計算：

(1)

式中：

S——DPPH自由基清除率，%；

A1——加入提取液的DPPH溶液的吸光度值；

A2——未加提取液的DPPH溶液的吸光度值。

(3) ABTS自由基清除率測定：參照文獻(xiàn)[14]并略作修改。將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液以體積比1∶1混合并靜置16 h。將所得混合液用乙醇稀釋直至其在734 nm處的吸光度值在0.70±0.02。同時，將40 mL薄膜乙醇提取液加入到3 960 mL稀釋液中后靜置6 min，測定其在734 nm處的吸光度值。用沒食子酸溶液(0～1 000 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以每克薄膜的微克沒食子酸當(dāng)量(GAE)表示。

1.5 統(tǒng)計分析

用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析，多重比較采用LSD法，使用Origin 2021進(jìn)行作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極其顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械性能

由圖1可知，在25，4，-18 ℃貯藏35 d后薄膜的斷裂伸長率分別為(19.13±5.94)%，(19.56±3.64)%，(18.47±3.73)%，相較于0 d的分別下降55.28%，55.29%，57.81%(P<0.05)，且隨著貯藏時間的延長，所有薄膜在貯藏期間的斷裂伸長率總體呈先下降后上升再下降的趨勢。貯藏第14天，25 ℃組的EAB顯著低于-18 ℃組(P<0.05)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是低溫下薄膜中山茶油的均勻度保持較好，山茶油起到的增塑作用并未減弱，與文獻(xiàn)[11]研究結(jié)果一致，適量山茶油的添加顯著改善了薄膜的EAB。由圖2可知，薄膜在25 ℃下貯藏7 d時的TS值顯著大于0 d的(P<0.05)，與EAB的變化趨勢相反，可能是以魔芋葡甘聚糖和卡拉膠為主要基質(zhì)的薄膜在貯藏過程中發(fā)生了氧化，導(dǎo)致薄膜老化，且在老化過程中，水分和增塑劑遷移到周圍環(huán)境，最終導(dǎo)致薄膜的TS值增大。此外，薄膜貯藏第7～35天TS無顯著變化(P>0.05)，但整體呈現(xiàn)下降的趨勢，可能是由于山茶油的增塑作用導(dǎo)致EAB增大，EAB的增大往往導(dǎo)致TS降低。薄膜的EAB在貯藏35 d后相較于0 d的顯著下降(P<0.05)，結(jié)合水、自由水的損失、甘油的滲出以及在不同環(huán)境溫度下薄膜的老化速度造成了EAB的下降。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時間的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.2 厚度穩(wěn)定性

由圖3可知，在貯藏第7～35天指示薄膜的厚度保持穩(wěn)定，薄膜的厚度范圍為0.126～0.162。薄膜在第7天的厚度相較于0 d的顯著增大(P<0.05)，其原因可能是山茶油作為疏水性材料添加到親水性KGM基質(zhì)中后在不同的溫度下貯藏時形成了不致密且較疏松的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致指示膜厚度的增加，與Liu等[15]研究結(jié)果一致。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時間的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.3 顏色穩(wěn)定性

由表1可知，指示薄膜在不同溫度下貯藏L*值呈先升高后下降的趨勢，且貯藏35 d后，指示薄膜在25，4，-18 ℃ 的L*值相較于貯藏0 d的分別下降2.4%，13.13%，26.80%，下降的原因可能與成膜基質(zhì)化學(xué)構(gòu)成有關(guān)，隨著貯藏時間的延長，魔芋葡甘聚糖和卡拉膠分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化和重排[16]，重排過程中基質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，從而降低了薄膜的透明度，導(dǎo)致指示薄膜L*降低。-18 ℃下薄膜L*值下降的速率要高于25 ℃和4 ℃下的，可能是由于低溫下整體老化程度較低，且低溫下自由水可形成冰晶，導(dǎo)致指示薄膜的不透明度升高，造成L*下降。

由表2可知，25 ℃貯藏下的薄膜a*值總體比較穩(wěn)定，只有貯藏第35天出現(xiàn)顯著變化(P<0.05)，原因在于薄膜在貯藏過程中，水和甘油從薄膜基質(zhì)中發(fā)生遷移。指示薄膜在不同溫度下a*值的變化可能受花青素結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變和山茶油狀態(tài)的影響。

由表3可知，隨著貯藏時間的延長，25，4，-18 ℃貯藏指示薄膜的b*值均顯著增大(P<0.05)。色差的測定結(jié)果表明，指示薄膜在-18 ℃貯藏時a*和b*的變化小于25 ℃和4 ℃下的，因此薄膜在-18 ℃貯藏時具有良好的顏色穩(wěn)定性。

2.4 抗氧化性能的變化

2.4.1 總酚含量的變化 由圖4可知，貯藏7 d后薄膜的總酚含量顯著下降(P<0.05)。當(dāng)貯藏溫度不變時，隨著貯藏時間的延長，薄膜的總酚含量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，且-18 ℃貯藏的薄膜總酚含量下降速率最大，可能是由于薄膜中的花青素和山茶油中的酚類物質(zhì)與薄膜基質(zhì)(KGM-CAR)結(jié)構(gòu)通過氫鍵相連，導(dǎo)致其在抗氧化分析中不能與自由基相互作用，從而降低了花青素在低溫下的抗氧化活性。薄膜在25 ℃貯藏第14天和第21天時總酚含量下降速率顯著快于4 ℃和8 ℃下的(P<0.05)，這是由于花青素的熱敏性，溫度越高，花青素結(jié)構(gòu)被破壞越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致其總酚含量的快速降低。

表1 指示薄膜在不同溫度和時間下L*值的變化?

表2 指示薄膜在不同溫度和時間a*值的變化?

表3 指示薄膜在不同溫度和時間下b*值的變化?

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.2 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，溫度對指示薄膜的DPPH自由基清除能力的影響不顯著(P>0.05)，含有花青素的指示薄膜在不同溫度下貯藏中前期(0～28 d)保持了比較好的抗氧化活性。此外，-18 ℃貯藏35 d后指示薄膜的DPPH自由基清除能力最低，與Adilah等[14]發(fā)現(xiàn)的在大豆分離蛋白中添加芒果核提取物貯藏90 d后的結(jié)果一致。指示薄膜在貯藏7 d后對DPPH自由基清除能力逐漸升高，可能是由于山茶油中酚類物質(zhì)的釋放量增加引起的。這也從側(cè)面說明薄膜的抗氧化活性主要是由酚類物質(zhì)提供的。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4.3 ABTS自由基清除能力 由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，薄膜在不同溫度下貯藏的ABTS自由基清除能力總體呈下降的趨勢。25 ℃條件下，貯藏第14天薄膜的ABTS自由基清除能力達(dá)到最高值，為9.44 μg/g，比4 ℃和-18 ℃下的最高值高出24.90%和21.08%。在成膜過程中，高溫使魔芋葡甘聚糖和卡拉膠結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，成膜基質(zhì)和其他化合物之間通過氫鍵鍵合，使成膜基質(zhì)不能完全恢復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)，從而改善了成膜基質(zhì)與花青素、水和甘油之間的相互作用，但在25 ℃貯藏時，薄膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使與薄膜結(jié)合的花青素和山茶油中的酚類物質(zhì)的釋放，從而使得薄膜在25 ℃貯藏14 d有最高的ABTS自由基清除能力。此外，不同溫度貯藏35 d后ABTS自由基清除能力相較于貯藏14 d的顯著下降與結(jié)合水、增塑劑和山茶油的損失有關(guān)。

小寫字母不同表示相同溫度下不同貯藏時間的樣品之間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時間下不同貯藏溫度的樣品之間差異顯著(P<0.05)

由于薄膜結(jié)構(gòu)中山茶油、水和甘油的損失，貯藏時間越長薄膜的老化程度越高，薄膜結(jié)構(gòu)的變化或重排影響了薄膜的抗氧化性能。從抗氧化能力的結(jié)果來看，隨著貯藏時間的延長，薄膜的總酚含量和ABTS自由基清除能力下降，但DPPH自由基清除能力升高。這可能是由于薄膜中所含的花青素和山茶油中會與水和甘油一樣從薄膜基質(zhì)中遷移到外界環(huán)境中。此外，抗氧化性能的降低不僅是由于花青素的損失，很大程度上也歸結(jié)于薄膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。

3 結(jié)論

薄膜的貯藏穩(wěn)定性隨著貯藏時間和溫度的變化而變化。薄膜在貯藏過程中機(jī)械性能、顏色和抗氧化性性能的變化與結(jié)合水和甘油導(dǎo)致薄膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)重排以及花青素和山茶油的損失有關(guān)。但研究僅從宏觀層面分析了指示薄膜性能的變化，并未從機(jī)理上探討變化發(fā)生的原因，未來可利用掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜等技術(shù)手段從微觀層面探討各種變化發(fā)生的原因和機(jī)理。