張秋云 楊洪生,2 譚秀慧 朱曉華,2 陳風(fēng)蔚 陳慧敏

(1. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2. 江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇 南京 210017；3. 上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200335)

苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑是1,4-苯并二氮卓類衍生物，為苯二氮卓受體激動(dòng)劑，可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的抑制[1-3]。長(zhǎng)期服用此類藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性及成癮性，突然停藥還會(huì)導(dǎo)致戒斷癥狀出現(xiàn)[4-5]。苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑具有蓄積毒性，在體內(nèi)吸收快，排泄慢，長(zhǎng)期攝入后，會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝功能下降，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響，引起頭腦昏沉，記憶退化、運(yùn)動(dòng)障礙等問(wèn)題[6-9]。中國(guó)于2002年禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用硝西泮、奧沙西泮等藥物[10]。最新發(fā)布的GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，地西泮僅允許治療使用，但不得檢出。

目前，檢測(cè)鎮(zhèn)定劑類藥物殘留的主要方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[11]、液相色譜法(LC)[12-13]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[14-15]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[16-18]，其中氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法和液相色譜法前處理過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性差，靈敏度低，難以滿足日常檢測(cè)需求，而液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高，抗干擾性強(qiáng)，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，是目前檢測(cè)鎮(zhèn)靜劑類藥物最主要的檢測(cè)方法。此外，內(nèi)標(biāo)法相對(duì)于外標(biāo)法具有簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，有效抵消基質(zhì)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是質(zhì)譜法的最優(yōu)選擇[19]。目前，水產(chǎn)品中檢測(cè)常用鎮(zhèn)靜劑類藥物定量定性檢測(cè)主要以外標(biāo)法為主，如何曉明等[20]建立了水產(chǎn)品中13種鎮(zhèn)靜劑殘留檢測(cè)的液質(zhì)聯(lián)用法，采用外標(biāo)法定量，其前處理過(guò)程采用QuEChERS凈化，但操作較繁瑣、凈化效果較差，也未考慮基質(zhì)效應(yīng)可能對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。有學(xué)者采用內(nèi)標(biāo)法，但是也僅僅用1～3種內(nèi)標(biāo)物，如張璇等[18]建立了液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中12種鎮(zhèn)靜劑及其代謝物殘留的內(nèi)標(biāo)法，但只用了安眠酮-D7、鹽酸氯丙嗪-D6、地西泮-D53種內(nèi)標(biāo)，具有一定的局限性。

研究擬建立一種以內(nèi)標(biāo)法為基礎(chǔ)且能同時(shí)檢測(cè)多種鎮(zhèn)靜劑類物質(zhì)及其代謝物的方法，并對(duì)樣品前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，以期解決基質(zhì)干擾問(wèn)題，為水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留監(jiān)測(cè)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15種鎮(zhèn)靜劑及14種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(具體名稱見(jiàn)表1)：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，美國(guó)Cerilliant公司；

乙腈、甲醇、氨水、乙酸乙酯和甲酸：色譜純，德國(guó)Merck公司；

Waters Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(150 mg/3 mL)、Waters Oasis HLB固相萃取小柱(150 mg/3 mL)、Waters C18柱(200 mg/3 mL)、Waters CORTECS C18液相色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)：美國(guó)Waters公司；

Supelclean LC-18 固相萃取儀：德國(guó)Merck公司；

草魚(yú)、南美白對(duì)蝦和中華絨螯蟹等水產(chǎn)品：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀：SCIEX Triple QuadTM5500型，美國(guó)Sciex公司；

高速冷凍離心機(jī)：Avanti J-26XP型，美國(guó)Beckman Coulter公司；

電子天平：CP225D型，德國(guó)Sartorius公司；

全自動(dòng)濃縮儀：Turbo Vap LV型，瑞典Biotage公司；

純水儀：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1) 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取一定體積的15種鎮(zhèn)定劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18 ℃保存。

(2) 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取一定體積的同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用乙腈配制成質(zhì)量濃度均為50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18 ℃保存。

1.4 樣品前處理

草魚(yú)、南美白對(duì)蝦和中華絨螯蟹分別取可食部分，充分均質(zhì)后-20 ℃保存。

于50 mL聚丙烯離心管中準(zhǔn)確稱取試樣2.00 g，添加質(zhì)量濃度為50 μg/L混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，靜置5 min，加入提取溶劑乙腈10 mL，渦旋混勻30 s，于常溫下超聲10 min，然后8 000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確移取5 mL上清液過(guò)Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱，調(diào)節(jié)流速至小于1滴/s，收集流出液于10 mL刻度離心管中，真空抽干1 min。流出液于50 ℃氮?dú)獯抵?.5 mL左右，用乙腈定容至1 mL，過(guò)0.22 μm尼龍微孔濾膜，備用待測(cè)。

1.5 分析方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS C18液相色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流速：400 μL/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；B：甲醇。梯度洗脫程序：0～8.00 min，95% A；8.00～12.00 min，95%～10% A；12.00～12.10 min，10%～95% A；12.10～15.00 min，95% A。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI源，正離子模式；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：450 ℃；氣簾氣：0.24 MPa；霧化氣：0.38 MPa；輔助霧化氣：0.38 MPa。15種鎮(zhèn)靜劑和14種內(nèi)標(biāo)物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1(其中普拉西泮對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)為勞拉西泮-D4)。

表1 15種鎮(zhèn)靜劑和14種內(nèi)標(biāo)物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量?

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分析檢出限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度及回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 液質(zhì)條件優(yōu)化

試驗(yàn)所選的鎮(zhèn)靜劑均含有仲胺或者叔胺基團(tuán)，屬于苯二氮卓類藥物，易與氫離子結(jié)合成帶正電荷的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，因此在正離子模式下，采用流動(dòng)注射的方式分別將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的地西泮等15種鎮(zhèn)定劑及14種內(nèi)標(biāo)物注入質(zhì)譜，對(duì)目標(biāo)化合物在m/z為200～450的范圍內(nèi)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，獲得分子離子峰[M+H]+，且強(qiáng)度穩(wěn)定在1×106以上。以高純氮?dú)鉃榕鲎矚?，通過(guò)優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，分別選取干擾少、響應(yīng)值高的2個(gè)子離子作為定量離子和定性離子，其中內(nèi)標(biāo)化合物只選取1個(gè)離子，用于目標(biāo)化合物的定量。同時(shí)，分別考察了0.1%甲酸水溶液—乙腈、0.1%甲酸水溶液—甲醇、5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)—甲醇、5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)—乙腈4種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物的靈敏度和峰型的影響。經(jīng)過(guò)比較，采用0.1%甲酸水溶液—甲醇為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)值高，峰型更尖銳，各物質(zhì)間的分離效果更好，因此選用0.1%甲酸水溶液—甲醇作為目標(biāo)化合物檢測(cè)的流動(dòng)相，在此條件下15種鎮(zhèn)靜劑及14種內(nèi)標(biāo)化合物的提取離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 15種鎮(zhèn)靜劑及14種內(nèi)標(biāo)化合物的提取離子流色譜圖Figure 1 Extracted ion chromatograms of the 15 kinds of sedatives and 14 kinds of isotope internal standards

2.2 樣品提取劑選擇

地西泮等15種鎮(zhèn)定劑為脂溶性物質(zhì)，常用的提取劑有乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑[21-25]。研究比較了乙腈、1%甲酸—乙腈、1%氨水—乙腈、1%氨水—乙酸乙酯、1%甲酸—乙酸乙酯、乙酸乙酯6種提取劑對(duì)目標(biāo)化合物提取效果的影響。由于1%氨水—乙酸乙酯、1%甲酸—乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，提取液較為混濁且出現(xiàn)不同程度的乳化現(xiàn)象，分離效果差，因此在試驗(yàn)前期予以排除。其他4種提取劑的試驗(yàn)結(jié)果(如圖2)表明，乙酸乙酯相對(duì)乙腈系列的提取溶劑來(lái)說(shuō)，其總體回收率偏低，尤其是2′-氯地西泮和2-羥乙基氟拉西泮，其回收率僅為55.8%和60.1%；1%氨水—乙腈、1%甲酸—乙腈和乙腈作為提取溶劑時(shí)目標(biāo)化合物的提取效果相差不大，考慮到地西泮等15種鎮(zhèn)靜劑的極性較弱，易溶于甲醇、乙腈等試劑，不易溶于水，而乙腈相對(duì)操作簡(jiǎn)便，因此選擇乙腈作為目標(biāo)化合物的提取劑。

2.3 濃縮過(guò)程優(yōu)化

藥物殘留分析過(guò)程中常用的濃縮方法有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹、真空濃縮、冷凍干燥等，而氮吹由于干燥速度快、處理樣品個(gè)數(shù)多、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[26-27]。研究以15種鎮(zhèn)靜劑標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)象，考察了不同溫度下(35，40，50，60 ℃)氮吹對(duì)回收率的影響。由圖3可知，在不同的溫度進(jìn)行氮吹，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值有所差異，溫度越高耗時(shí)越短。35 ℃時(shí)氯安定和氯硝西泮的回收率低于70%，60 ℃時(shí)溫度過(guò)高，氯硝西泮和去甲基氯硝西泮回收率低于70%，而且各目標(biāo)物的回收率比40 ℃ 和50 ℃ 的顯著降低，而在40 ℃和50 ℃下氮吹各目標(biāo)物的回收率均達(dá)到70%～120%，由于在40 ℃下氮吹耗時(shí)較50 ℃下的長(zhǎng)，因此，選擇50 ℃為適宜氮吹溫度。

1. 地西泮 2. 硝西泮 3. 氯安定 4. 奧沙西泮 5. 氟拉西泮 6. 氟硝西泮 7. 氯甲西泮 8. 勞拉西泮 9. 普拉西泮 10. 替馬西泮 11. 7-氨基氟硝西泮 12. 去甲西泮 13. 去甲基氟硝西泮 14. 2-羥乙基氟拉西泮 15. 2′-氯地西泮 以草魚(yú)為基質(zhì)，加標(biāo)水平10 μg/kg

2.4 凈化方法選擇

研究考察了Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱、Waters Oasis HLB固相萃取柱和Waters C18固相萃取柱對(duì)鎮(zhèn)定劑的凈化效果。結(jié)果(圖4)表明，Waters C18固相萃取柱凈化效果較差，勞拉西泮、奧沙西泮、2′-氯地西泮等目標(biāo)化合物在Waters C18固相萃取柱凈化后回收率低于60%；Waters Oasis HLB固相萃取柱和Waters Oasis PRIME HLB柱對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果無(wú)顯著差異，但Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱與傳統(tǒng)的Waters Oasis HLB固相萃取柱相比，省去了活化、平衡步驟，樣品提取液直接過(guò)柱，簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，同時(shí)又能有效去除95%以上的脂肪、磷脂等基質(zhì)干擾物，樣品更加干凈，基質(zhì)效應(yīng)更小，因此選擇Waters Oasis PRIME HLB為凈化小柱。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

由于同位素內(nèi)標(biāo)和待測(cè)化學(xué)物質(zhì)的性質(zhì)相似，因此采用同位素稀釋方法，能夠有效抵消基質(zhì)效應(yīng)。根據(jù)式(1)計(jì)算不同基質(zhì)中15種鎮(zhèn)靜劑的基質(zhì)效應(yīng)(ME)[28]。

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)，%；

K1——基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

K2——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

ME值為80%～120%，表示基質(zhì)效應(yīng)較弱，即目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中的信號(hào)強(qiáng)度差別不大；ME值<80%，表示有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，使得目標(biāo)化合物信號(hào)顯著減弱；ME值>120%，表示有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，使得目標(biāo)化合物信號(hào)顯著增強(qiáng)。

如圖5所示，在草魚(yú)、南美白對(duì)蝦和中華絨螯蟹3種不同的基質(zhì)中15種鎮(zhèn)靜劑均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)。地西泮、硝西泮、氯甲西泮等鎮(zhèn)靜劑在草魚(yú)、南美白對(duì)蝦和中華絨螯蟹中基質(zhì)抑制效應(yīng)較大，而奧沙西泮鎮(zhèn)靜劑在中華絨螯蟹基質(zhì)中有明顯基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此，為有效降低基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液中添加內(nèi)標(biāo)的方法來(lái)進(jìn)行定量分析，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1. 地西泮 2. 硝西泮 3. 氯安定 4. 奧沙西泮 5. 氟拉西泮 6. 氟硝西泮 7. 氯甲西泮 8. 勞拉西泮 9. 普拉西泮 10. 替馬西泮 11. 7-氨基氟硝西泮 12. 去甲西泮 13. 去甲基氟硝西泮 14. 2-羥乙基氟拉西泮 15. 2′-氯地西泮

2.6 方法的線性范圍和檢出限

在草魚(yú)空白基質(zhì)液中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4和1.5的條件進(jìn)行測(cè)定。以各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，目標(biāo)化合物峰面積和對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，15種鎮(zhèn)定劑在質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)作為方法的檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)作為方法定量限(LOQ)。

2.7 方法準(zhǔn)確度和精密度

在2.00 g空白樣品中添加質(zhì)量濃度為50 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，質(zhì)量濃度為100 μg/L的15種鎮(zhèn)定劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100，200，500 μL，即添加水平為5，10，25 μg/kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，其加標(biāo)回收率為78%～125%，RSD為1.52%～12.02%，見(jiàn)表3。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用上述檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)上常見(jiàn)的20份不同類型水產(chǎn)品(草魚(yú)、鯽魚(yú)、南美白對(duì)蝦、中華絨螯蟹等)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在1份草魚(yú)樣品中檢出地西泮含量為0.85 μg/kg，其余樣品中均未檢出苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑。

表2 15種鎮(zhèn)靜劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3 15種鎮(zhèn)靜劑的準(zhǔn)確度和精密度

3 結(jié)論

研究建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中15種苯二氮卓類鎮(zhèn)定劑的分析方法，對(duì)提取溶劑、凈化條件、濃縮方式、基質(zhì)效應(yīng)等因素進(jìn)行了優(yōu)化，采用同位素稀釋，有效抑制基質(zhì)效應(yīng)干擾，提高了試驗(yàn)準(zhǔn)確性。該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效，方法的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度均能滿足日常檢測(cè)要求，適用于實(shí)驗(yàn)室大批量水產(chǎn)品樣品的快速測(cè)定。