毛秀榮，李 雷，朱 俊，鄧?yán)^武，石 榴，朱勇強(qiáng)，祝陳英，郭丹蝶

(四川省達(dá)州市種子管理站，四川 達(dá)州 635000)

種業(yè)提升計(jì)劃的推行，我國(guó)培育審定和登記的農(nóng)作物品種逐年增多，據(jù)報(bào)道，截止2018年底全國(guó)選育農(nóng)作物品種4萬(wàn)多個(gè)。農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和消費(fèi)市場(chǎng)的日益變化，品種更新?lián)Q代顯著加快，市場(chǎng)和產(chǎn)業(yè)基地中同名異物、同物異名、一物多名、一名多物，以假充真、魚(yú)目混珠等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)等新型育種技術(shù)的應(yīng)用，使單一性狀的改變成為可能，在原品種基礎(chǔ)上改良少數(shù)或者單個(gè)性狀的派生性品種大大增加，這給品種的鑒定篩選、選育、保護(hù)及種質(zhì)資源的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、管理、維權(quán)等帶來(lái)了不同程度的困難，甚至給農(nóng)民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。學(xué)術(shù)和實(shí)踐中，基于基因表達(dá)型的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、孢粉學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記，以及直接反映DNA水平差異的分子標(biāo)記都是較為常用的鑒定方法。但形態(tài)學(xué)標(biāo)記易受環(huán)境條件與人為觀測(cè)因素影響，同時(shí)存在標(biāo)記數(shù)量少、多態(tài)性差等缺點(diǎn)。孢粉學(xué)標(biāo)記不適合用于同種不同品種間親緣關(guān)系的研究，在同種質(zhì)類型內(nèi)的意義不大。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記信息挖掘需要大量的人力和時(shí)間，而標(biāo)記的數(shù)量有限；同工酶種類較少，且對(duì)不同果樹(shù)品種的鑒定能力不強(qiáng)，在實(shí)際應(yīng)用中更是難以辨別出品系間的差異。分子標(biāo)記最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠準(zhǔn)確且直接展現(xiàn)基因組DNA的差異，因而具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。為此，文章以筆者在聚丙烯酰氨凝膠電泳實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的實(shí)際問(wèn)題為例，對(duì)問(wèn)題產(chǎn)生的原因和可能的解決辦法進(jìn)行了探討分析，以期為聚丙烯酰氨凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展和真實(shí)數(shù)據(jù)的獲得提供啟示和幫助。

1 條帶圖譜不理想

1.1 未檢測(cè)到目標(biāo)條帶

未檢測(cè)到目標(biāo)條帶甚至無(wú)條帶，最可能出現(xiàn)的原因一是PCR產(chǎn)物跑出凝膠；二是PCR未有效擴(kuò)增，未獲得足夠有效的PCR產(chǎn)物。問(wèn)題一解決思路是降低產(chǎn)物在PAGE膠中的移動(dòng)速度，可降低電壓、縮短電泳時(shí)間，參考maker條帶的在凝膠的位置，結(jié)合目標(biāo)條帶的大小，判斷是目標(biāo)條帶否跑出凝膠。接通電源，在5V/cm(長(zhǎng)度以兩個(gè)點(diǎn)極之間的距離計(jì)算)條件下電泳30～40min，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加樣孔的一端)。問(wèn)題二解決思路，首要保障引物質(zhì)量，確定PCR反應(yīng)體系的配置，包括模板、引物、MIX混合液和水的配置比例等，其次是PCR擴(kuò)增程序是否合理，引物的來(lái)源，建議通過(guò)一級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI、GDR等(原始文獻(xiàn))查詢獲得。

1.2 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

在真實(shí)性實(shí)驗(yàn)中，非特異性條帶并不是我們想要的，非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)最可能的原因一是引物的選擇，二是引物的退火溫度，三是PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)過(guò)大，PCR擴(kuò)增過(guò)程中延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，循環(huán)數(shù)多，非特異性產(chǎn)物量也隨之增多。問(wèn)題一、二解決思路是要找到最適合的引物，以高差異性品種為模板，通過(guò)多次引物適宜性和多態(tài)性篩選，選取合適的引物。同時(shí)，以0.5～1℃為梯度，篩選最適合退火溫度(可將退火溫度相近的引物一起篩選，提高效率)。問(wèn)題三可適當(dāng)減少PCR循環(huán)次數(shù)，適當(dāng)提高退火溫度，使得擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)多次對(duì)比分析，35個(gè)循環(huán)較為合適。

1.3 出現(xiàn)拖帶或彌散

出現(xiàn)這種情況的原因是多方面的，聚丙烯膠在配置過(guò)程中未充分混勻，導(dǎo)致分離效果不明顯，出現(xiàn)條帶彌散。所以配置聚丙烯膠時(shí)一定要仔細(xì)，不可漏加，少加藥品，還需充分搖勻。電泳液也要勤換，這樣才能保證電泳效果；同時(shí)，點(diǎn)樣時(shí)只圖速度，所點(diǎn)樣品飄散在加樣孔，也造成圖譜拖帶或者空白。因此，移液槍點(diǎn)樣一般1～3μL，且速度要緩慢，注意盡量不要吸到石蠟油，待樣液自然落入樣孔底部，所得帶型清晰、美觀。

1.4 出現(xiàn)圖譜很淡，呈灰色

問(wèn)題可能是一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量過(guò)少，二是銀染時(shí)間不足。擴(kuò)增產(chǎn)物不足，可以選擇增加點(diǎn)樣量，一般108孔的可以選擇0.8～1.2uL，孔越大加樣量越大。考慮硝酸銀易吸水和見(jiàn)光分解，可適當(dāng)提高硝酸銀溶液的濃度，延長(zhǎng)染色的時(shí)間，及時(shí)將使用后的硝酸銀置于棕色瓶低溫避光保存。顯色液配置時(shí)要先加氫氧化鈉，待后氫氧化鈉溶解完全溫度降低室溫時(shí)再加入甲醛，低溫保存，減少甲醛揮發(fā)，保證顯影液質(zhì)量。搖床晃動(dòng)染色、顯色時(shí)，用純水沖洗過(guò)的玻璃棒將重疊在一起的膠塊輕輕撥開(kāi)，使得每塊膠均勻染色，以保證圖譜質(zhì)量和清晰度。

1.5 條帶彎曲、不整齊

問(wèn)題可能一是聚丙烯酰氨凝膠不均勻，二是電泳液緩沖能力下降。問(wèn)題一的解決思路:均勻制作凝膠版，可先將膠液、凝固劑、加速劑分別配置母液，使用時(shí)在稀釋混勻。在實(shí)際操作中，通過(guò)灌膠時(shí)適當(dāng)加大電泳槽傾斜角、減緩灌膠速度，減少膠中的氣泡。制作好的膠放入垂直電泳槽時(shí)，從一邊緩緩浸入，排除膠板底部間隙氣泡，確保兩邊受力一致，避免膠帶損壞。電泳液使用時(shí)間較長(zhǎng)，離子濃度降低，pH上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。問(wèn)題二的解決思路:建議配置好的緩沖液用PH試紙測(cè)溶液強(qiáng)度，連續(xù)使用，每星期更換1次電泳緩沖液最佳。

2 DNA質(zhì)量控制不當(dāng)

2.1 DNA溶液反復(fù)凍融

由于基因組DNA反復(fù)凍融，導(dǎo)致DNA含量下降。因此建議對(duì)提取的DNA分裝保存，需要使用時(shí)取出，融化后應(yīng)該立即使用，使用結(jié)束后，剩余DNA及時(shí)于4℃冰箱中保存。同時(shí)，DNA存放時(shí)間不宜超過(guò)14d，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致降解，試驗(yàn)徒勞無(wú)功。

2.2 DNA質(zhì)量不高

由于陳種子提取的DNA純度低，擴(kuò)增效果差，導(dǎo)致結(jié)果不明顯或者帶型不一致的，干擾結(jié)果分析。采取室內(nèi)發(fā)芽獲取幼嫩植物組織，CTAB法提取DNA。也可采集鮮葉放于自封袋中，并加入100-200 g變色硅膠，使硅膠與葉片的質(zhì)量比在20:1左右，同時(shí)輕微搖動(dòng)使硅膠與葉片接觸充分、均勻，常溫放置，可長(zhǎng)時(shí)間保存用于DNA提取。DNA提取后應(yīng)當(dāng)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，一是通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶亮度、形狀，有無(wú)彌散、拖尾、蛋白污染等。二是通過(guò)濃度檢測(cè)，一般合格的DNAOD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA較純。幼苗提取的DNA濃度較高，需要稀釋20ng/μL備用，原液置于-20℃保存，稀釋液置于4℃保存使用。

3 點(diǎn)樣過(guò)程不規(guī)范

3.1 點(diǎn)樣不方便

由于購(gòu)買的樣梳齒子太長(zhǎng)，點(diǎn)樣孔過(guò)深，長(zhǎng)槍頭不能觸及樣孔底部，樣液不能全部、快速落入底部，所得圖譜不夠清晰，影響圖譜分析。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可用剪刀剪去樣梳齒子長(zhǎng)度的四分之一，這樣移液槍點(diǎn)樣時(shí)，樣品自然、快速落入底部，不會(huì)彌散在孔中，提高了圖譜分析時(shí)的辨識(shí)度。

3.2 點(diǎn)樣方法不當(dāng)

點(diǎn)樣前注意移液槍吸樣，將搶頭伸到底部，吸樣后稍停留待長(zhǎng)頭搶充分吸取樣液，再加入樣孔底部；點(diǎn)樣時(shí)，為避免邊緣效應(yīng)，最好左右兩端空幾個(gè)點(diǎn)樣孔，然后再加樣，這樣可以避免兩邊膠孔拔時(shí)斷裂，加樣串孔。在實(shí)驗(yàn)中如有多人，大批量做檢驗(yàn)，必須用maker做好標(biāo)記，膠板左、中、右部分至少留有一條Maker，以便分析條帶，比對(duì)圖譜。

4 引物存放不當(dāng)

制作模板時(shí)，稍有不慎可能會(huì)有不換槍頭吸取另一引物的情況，此時(shí)就造成了引物整管污染，出現(xiàn)雜帶，干擾結(jié)果分析；引物多次反復(fù)凍融，會(huì)使得其存放時(shí)間變短，所得圖譜明顯沒(méi)有剛開(kāi)始亮。為防止不規(guī)范操作造成引物污染及多次凍融導(dǎo)致引物變質(zhì)降解，我們將稀釋后的前后引物混合并裝，可有效減少加樣次數(shù)，在-20℃冰箱保存，就可避免整管被污染和反復(fù)凍融失效。

5 硝酸銀用量不當(dāng)或存放過(guò)長(zhǎng)失效

在染色時(shí)，應(yīng)待硝酸銀完全溶解并混勻后才可倒入，否則銀顆粒會(huì)潛入膠中，使得背景雜亂。硝酸銀量不足會(huì)使DNA帶變淺，硝酸銀失效，導(dǎo)致膠板變空白；量過(guò)多，導(dǎo)致較多銀離子殘留在膠板上，背景深而影響顯帶。因此，在試驗(yàn)中若染色不佳，可適當(dāng)?shù)亩嗉酉跛徙y或適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)染色時(shí)間，以保證染色效果。

6 膠帶的長(zhǎng)期保存

顯色完全用后清水洗去殘留的顯影液和硝酸銀液后，可以用保鮮薄膜將膠帶完全包裹，并用除去膠帶上多余的水，用馬克筆在膜上記下相關(guān)重要信息，置于低溫下可長(zhǎng)時(shí)間保存?zhèn)溆谩?/p>

聚丙烯酰氨凝膠電泳檢驗(yàn)檢測(cè)準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)，但試驗(yàn)步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，因此，檢驗(yàn)人員在聚丙烯酰氨凝膠電泳實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)致，需進(jìn)一步加強(qiáng)專業(yè)素養(yǎng)，提升操作技能，為品種檢測(cè)、鑒定把好質(zhì)量關(guān)。