王 瑩，張建海，王勇亮，來(lái) 靜，張 鑫，周麗媛，朱迎春,*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西省食品研究所，山西 太原 030000）

羊肉中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為腐敗微生物生長(zhǎng)繁殖提供了適宜條件，如假單胞菌、乳酸菌、大腸桿菌和李斯特氏菌等，它們對(duì)羊肉的感官和品質(zhì)有直接影響。目前，羊肉生產(chǎn)和銷售過(guò)程中最常見(jiàn)的包裝方式有托盤包裝、真空包裝（vacuum packaging，VP）和氣調(diào)包裝等。這些包裝技術(shù)可以防止冷鮮肉二次污染、抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖、保持肉品的嫩度和顏色，同時(shí)還可以抑制蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化，減少質(zhì)量損失[1]。馬惠敏等[2]研究托盤包裝、VP、高氧氣調(diào)包裝（75% O2＋25% CO2）和低氧氣調(diào)包裝（50% O2＋50% CO2）對(duì)4 ℃貯藏羊肉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)采用VP的羊肉剪切力較低，亮度（L*值）和紅綠度（a*值）明顯高于托盤包裝和氣調(diào)包裝，保鮮效果最好。dos Santos-Donado等[3]研究VP、高氧氣調(diào)包裝（75% O2＋25% CO2）和一氧化碳?xì)庹{(diào)包裝（60% CO2＋0.2% CO＋39.8% N2、40% CO2＋0.4% CO＋59.6% N2）對(duì)（2±1）℃貯藏牛排品質(zhì)的影響，認(rèn)為一氧化碳?xì)庹{(diào)包裝和VP牛排的脂肪及蛋白質(zhì)氧化程度較低，且一氧化碳?xì)庹{(diào)包裝的牛排顏色更紅，與高氧氣調(diào)包裝相比品質(zhì)更好。貼體包裝（skin packaging，SP）作為近年來(lái)新興的一種VP形式，不僅具有VP氧含量低的特點(diǎn)，而且其包裝膜更適應(yīng)食品外形，減少了包裝褶皺，降低了汁液損耗和血水析出，并且與普通VP相比，肉品顏色更為紅艷[4]。Li Xin等[5]將牛排經(jīng)SP、VP和高氧氣調(diào)包裝（80% O2＋20% CO2）后貯藏7 d，發(fā)現(xiàn)SP能更好地維持牛排顏色穩(wěn)定性，而且品質(zhì)優(yōu)于其他兩種包裝方式。

冰溫貯藏技術(shù)是一種將生鮮食品貯藏于0 ℃以下、冰點(diǎn)以上的冰溫帶，使食品始終處于非凍結(jié)狀態(tài)的低溫保鮮技術(shù)，其避免了因凍結(jié)而使食品組織結(jié)構(gòu)損傷、汁液流失增多的缺陷，能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保持食品的新鮮狀態(tài)[6]。辜雪冬等[7]分析冰溫（-2 ℃）和冷藏（0 ℃）條件下用聚乙烯/尼龍復(fù)合自封袋包裝牦牛肉感官品質(zhì)、菌落總數(shù)、丙二醛含量變化以及水分遷移的規(guī)律，結(jié)果表明，冰溫保鮮對(duì)牦牛肉的貯藏效果更好，可使貯藏期延長(zhǎng)6 d，同時(shí)冰溫下牦牛肉結(jié)合水、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。Zhang Xinxiao等[8]將雞肉經(jīng)氣調(diào)包裝（80% CO2＋20% N2）后分別在冰溫（-2 ℃）和冷藏（4 ℃）條件下貯藏，發(fā)現(xiàn)冰溫條件下雞肉貨架期延長(zhǎng)了16 d。

高通量測(cè)序是最近10 年新興發(fā)展起來(lái)的免培養(yǎng)的新一代測(cè)序技術(shù)[9]。近年來(lái)，基于16S rDNA的高通量測(cè)序廣泛應(yīng)用于分析微生物的組成和多樣性，有助于全面了解食品中微生物群落動(dòng)態(tài)，以便提高食品品質(zhì)、控制微生物安全[10]。而利用高通量測(cè)序監(jiān)測(cè)食品貯藏過(guò)程中微生物菌群變化對(duì)于構(gòu)建適當(dāng)?shù)馁A藏條件、抑制特殊腐敗菌增殖具有非常重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)主要探討空氣包裝（air packaging，AP）、VP和SP以及（4±1）℃冷藏和（-1.7±0.2）℃冰溫貯藏對(duì)宰后羊肉貯藏過(guò)程中微生物數(shù)量及菌落多樣性的影響，并基于京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對(duì)微生物菌群代謝途徑進(jìn)行分析，以期為冷鮮羊肉保鮮貯藏過(guò)程中有效實(shí)施質(zhì)量安全控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉 山西邊塞牧羊科技服務(wù)有限公司。選取體質(zhì)量相近、飼養(yǎng)方式相同的36 月齡蓋州絨山羊10 只（公羊、去勢(shì)）進(jìn)行屠宰，宰后在排酸庫(kù)（4 ℃）成熟48 h后取背最長(zhǎng)肌作為實(shí)驗(yàn)材料。

MRS培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂（manitol salt agar，MSA）培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；真空包裝袋、貼體包裝盒及蓋膜、空氣包裝盒及蓋膜 上?，B一實(shí)業(yè)有限公司。包裝材料主要參數(shù)如表1所示。

表1 包裝材料主要參數(shù)Table 1 Information about packaging materials tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海深安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BCD-267WKR3NPGA冷藏冷凍變溫冰箱 青島海信容聲冰箱有限公司；SC-228D冷藏冰柜青島海爾特種電冰柜有限公司；DZ/DZQ-5002SB真空包裝機(jī) 杭州艾博機(jī)械工程有限公司；DQ440VSL型真空貼體包裝機(jī) 溫州達(dá)盛智能設(shè)備有限公司；T100梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、GelDoc XR＋凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將宰后成熟的羊背最長(zhǎng)肌剔除多余脂肪后切成（200±12）g，分別進(jìn)行AP、VP、SP，AP為PP托盤，用聚乙烯/聚酰胺膜封口；VP真空度為0.2 kPa（極限真空）；SP采用PP托盤，用PA/EVOH/PE作為蓋膜，極限真空小于0.2 kPa。每個(gè)處理組共30 個(gè)樣品，將包裝好的樣品置于含冰袋的保溫箱中，在2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，分別于（4±1）℃冷藏和（-1.7±0.2）℃冰溫下貯藏，在貯藏第0、5、10、15、20、30天時(shí)分別從每個(gè)處理組中隨機(jī)選擇3 盒/袋取樣進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品作3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。同時(shí)在第0、10、20、30天時(shí)于無(wú)菌環(huán)境下對(duì)各處理組取樣，每個(gè)樣品取3 個(gè)重復(fù)，放入自封袋內(nèi)，置于-80 ℃冰箱貯藏用于后續(xù)高通量測(cè)序。

編號(hào)設(shè)置：冰溫貯藏標(biāo)記為A，冷藏標(biāo)記為B。樣品編號(hào)方式為包裝方式＋貯藏溫度＋貯藏時(shí)間，例如樣品SPA10表示SP、冰溫貯藏10 d的樣品。0 d樣品作為對(duì)照組編號(hào)為CK。

1.3.2 微生物指標(biāo)測(cè)定

微生物菌落總數(shù)（total viable count，TVC）測(cè)定按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[11]；假單胞菌數(shù)按照SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計(jì)數(shù)方法》[12]進(jìn)行測(cè)定；乳酸菌數(shù)按照GB 478935—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[13]進(jìn)行測(cè)定；霉菌酵母菌數(shù)按照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[14]進(jìn)行測(cè)定；嗜冷菌數(shù)測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基于7 ℃培養(yǎng)10 d；葡萄球菌/微球菌數(shù)測(cè)定用MSA培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)前根據(jù)肉樣的新鮮程度選取2～3 個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度作3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將培養(yǎng)皿放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。

1.3.3 總DNA提取

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)不同貯藏時(shí)間的羊肉樣品基因組DNA進(jìn)行提取，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

以提取的基因組DNA為模板，對(duì)樣品16S rDNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，純化后的樣品用DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量，產(chǎn)物回收后送至嘉興邁維代謝生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.5 生物學(xué)信息分析

將測(cè)序得到的PE Reads根據(jù)Overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，然后對(duì)序列進(jìn)行過(guò)濾得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)，之后對(duì)樣本進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類分析，基于OTUs進(jìn)行物種多樣性分析及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，用Excel 2020軟件和Statistix 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，用Origin 8.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏條件下微生物數(shù)量的變化

肉的腐敗變質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由多種微生物作用引起，包裝方式和貯藏溫度對(duì)肉中的微生物生長(zhǎng)繁殖具有很大影響。TVC是衡量肉新鮮與否的重要指標(biāo)。根據(jù)GB/T 16869—2005《鮮、凍禽產(chǎn)品》[15]規(guī)定，冷鮮肉菌落總數(shù)超過(guò)6（lg（CFU/g））即視為腐敗變質(zhì)，不可食用。由圖1A可知，羊肉的初始TVC為2.96（lg（CFU/g）），貯藏至30 d時(shí)，冷藏的AP、VP和SP組TVC分別為8.76、7.89（lg（CFU/g））和7.60（lg（CFU/g）），而冰溫貯藏20 d時(shí)AP、VP和SP組TVC達(dá)到6.13、5.95（lg（CFU/g））和5.63（lg（CFU/g）），其中SP組和VP組仍未超過(guò)6（lg（CFU/g））。比較而言，冰溫條件下SP組和VP組羊肉貨架期較冷藏延長(zhǎng)了10 d，AP組延長(zhǎng)了5 d。

乳酸菌是一種兼性厭氧菌，在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)受到抑制，一般認(rèn)為乳酸菌是無(wú)氧條件下的優(yōu)勢(shì)菌群[16]。由圖1B可知，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，冷藏組羊肉中乳酸菌數(shù)快速增長(zhǎng)，至30 d時(shí)，乳酸菌數(shù)達(dá)到8.18～8.43（lg（CFU/g）），顯著高于冰溫貯藏組的6.39～6.67（lg（CFU/g））（P＜0.05）。即使是有氧包裝的AP組，冷藏30 d時(shí)乳酸菌數(shù)也高達(dá)8.43（lg（CFU/g）），這可能是貯藏后期AP內(nèi)氧氣被消耗，有利于厭氧的乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，此外乳酸菌產(chǎn)生乳酸，乳酸積累導(dǎo)致pH值降低，為厭氧乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖提供了適宜條件。

葡萄球菌/微球菌在自然界中分布廣泛，Li Miaoyun等[17]認(rèn)為葡萄球菌/微球菌是冷卻肉貯藏過(guò)程中的主要菌群。由圖1C可知，冷藏和冰溫貯藏的各組羊肉中葡萄球菌/微球菌數(shù)量在貯藏期間均快速上升。貯藏10～30 d，冰溫組除AP外，VP和SP葡萄球菌/微球菌的數(shù)量顯著低于冷藏組（P＜0.05），特別是SP冰溫貯藏組，第30天時(shí)其葡萄球菌/微球菌數(shù)為6.14（lg（CFU/g）），顯著低于其他各組（P＜0.05）。

假單胞菌是典型的嗜冷菌，具有很強(qiáng)的產(chǎn)生氨氣等腐敗產(chǎn)物的能力，是冷鮮肉腐敗的重要原因。由圖1D可知，貯藏0～5 d，冷藏和冰溫組假單胞菌數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），但從10 d開(kāi)始，冷藏組假單胞菌數(shù)急劇上升（P＜0.05），尤其是AP組上升數(shù)量最多。到貯藏結(jié)束時(shí)，冰溫組假單胞菌數(shù)仍在6（lg（CFU/g））以下，特別是冰溫SP和VP組，假單胞菌數(shù)均低于5 （lg（CFU/g）），顯著低于其他組（P＜0.05）。貯藏后期假單胞菌數(shù)較乳酸菌數(shù)低1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)，這是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境下乳酸菌的生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)大于假單胞菌，此外，乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸和乳酸菌素等也會(huì)抑制假單胞菌的生長(zhǎng)[18]。

霉菌和酵母菌也會(huì)造成肉品腐敗變質(zhì)，但其致腐能力較低。圖1E反映了羊肉貯藏過(guò)程中霉菌和酵母菌數(shù)量的變化。羊肉中的初始霉菌和酵母菌數(shù)量為1.30（lg（CFU/g）），隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組霉菌和酵母菌數(shù)量均有所上升，其中冷藏AP組快速上升（P＜0.05），30 d時(shí)達(dá)到5.11（lg（CFU/g）），而其他5 個(gè)處理組霉菌和酵母菌數(shù)量增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，在貯藏終點(diǎn)均未超過(guò)5（lg（CFU/g））。

嗜冷菌數(shù)是評(píng)價(jià)低溫貯藏肉品微生物安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由圖1F可知，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，所有樣品的嗜冷菌數(shù)均呈上升趨勢(shì)，貯藏20 d時(shí)，冷藏AP組達(dá)到6.27（lg（CFU/g）），顯著高于其他5 組（P＜0.05）；不同貯藏溫度比較，冰溫貯藏效果整體優(yōu)于冷藏，30 d時(shí)，冰溫SP組的嗜冷菌數(shù)為6.16（lg（CFU/g）），顯著低于其他處理組（P＜0.05）。

圖1 羊肉貯藏過(guò)程中微生物數(shù)量的變化（n＝3）Fig. 1 Changes in microbial load in mutton during storage (n = 3)

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與OTU分析結(jié)果

57 個(gè)羊肉樣品經(jīng)高通量測(cè)序獲得的原始序列總數(shù)為5 730 342，經(jīng)質(zhì)控和優(yōu)化后共得到3 593 277 條平均長(zhǎng)度為424 bp的有效序列，在97%相似水平下對(duì)樣品序列進(jìn)行后續(xù)分析。

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，能夠比較直觀地表現(xiàn)樣本的物種組成相似性及重疊情況[19]。由圖2可知，冰溫和冷藏10、20、30 d后，AP、VP和SP組的共有OTU數(shù)分別為25、33和60，說(shuō)明隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)羊肉中微生物種類逐漸趨于相似。此外，冰溫貯藏組OTU數(shù)明顯低于冷藏組，其中SP組OTU數(shù)低于AP和VP組。

圖2 羊肉樣品基于OTU水平的Venn圖Fig. 2 Venn diagrams showing the numbers of unique and shared OTUs among mutton samples

2.3 Alpha多樣性分析結(jié)果

采用Alpha多樣性指標(biāo)的ACE、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)對(duì)微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估[20]。ACE和Chao1指數(shù)越大表明菌落豐富度越高；Shannon指數(shù)越大說(shuō)明群落多樣性越高。

由表2可知，所有樣品的Coverage指數(shù)均達(dá)99%以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能夠有效反映樣本微生物的多樣性。與CK組相比，貯藏終點(diǎn)時(shí)樣品的ACE、Chao1和Shannon指數(shù)呈下降趨勢(shì)（除冷藏VP組），說(shuō)明微生物物種多樣性和豐富度整體隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低，冷藏組ACE和Chao1指數(shù)均高于冰溫組，說(shuō)明冷藏羊肉菌落豐度較高，如冷藏10 d SP組的Chao1指數(shù)為548.19±51.23，而冰溫貯藏10 d SP組為273.60±21.06。不同包裝方式比較，貯藏期間SP組羊肉中微生物的豐富度和多樣性整體低于其他兩種包裝方式，如冰溫貯藏10 d時(shí)，SP組的Shannon指數(shù)為2.52±0.08，而AP和VP組分別為4.07±0.09和4.54±0.06。

表2 貯藏期間羊肉中微生物的Alpha多樣性變化（n＝3）Table 2 Variation in microbial alpha diversity in mutton during storage (n = 3)

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

不同包裝羊肉貯藏過(guò)程中微生物菌群門水平相對(duì)豐度變化如圖3所示。所有樣品的細(xì)菌群落分屬于10 個(gè)門，其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）是主要的細(xì)菌門。CK中變形菌門和厚壁菌門占主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度分別為58.43%和21.03%，其次是不動(dòng)桿菌門和擬桿菌門，相對(duì)豐度分別為7.16%、2.21%。

圖3 羊肉貯藏過(guò)程中微生物群落門水平相對(duì)豐度變化（n＝3）Fig. 3 Changes in relative abundance of microflora at the phylum level in mutton during storage (n = 3)

冷藏期間，AP、VP和SP組樣品中厚壁菌門相對(duì)豐度均大幅升高，貯藏結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度由貯藏初始的21.03%分別增加至91.36%、94.20%和94.85%；變形菌門相對(duì)豐度從初始的58.43%降低到30 d的4.37%～7.56%。冰溫貯藏下雖然貯藏終點(diǎn)時(shí)厚壁菌門相對(duì)豐度也上升到76.24%～89.77%，但低于冷藏組；變形菌門總體呈下降趨勢(shì)，貯藏終點(diǎn)時(shí)相對(duì)豐度達(dá)到2.06%～13.32%。貯藏終點(diǎn)時(shí)，冰溫貯藏和冷藏條件下各組擬桿菌門和不動(dòng)桿菌門相對(duì)豐度均下降；除冰溫貯藏30 d VP組擬桿菌門相對(duì)豐度為5.16%，其余處理組豐度均小于1%。

不同包裝羊肉貯藏過(guò)程中微生物菌群屬水平相對(duì)豐度變化如圖4所示。CK組中假單胞屬（Pseudomonas）占優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)豐度為19.77%，其余依次是芽孢桿菌屬（Bacillus）（13.06%）、卡斯特蘭尼氏菌屬（Castellaniella）（8.89%）和Diaphorobacter（6.91%）。

冰溫貯藏10 d AP組假單胞菌屬迅速增長(zhǎng)至相對(duì)豐度為65.01%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬，之后顯著降低，冰溫貯藏30 d時(shí)僅為0.88%，而肉食桿菌屬（Camobacterium）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）和乳桿菌屬（Lactobacillus）明顯增加，相對(duì)豐度分別為18.00%、14.79%和53.21%，此時(shí)乳桿菌屬占主導(dǎo)地位。冷藏AP組中主要菌屬的變化趨勢(shì)與冰溫貯藏AP組類似，貯藏30 d假單胞菌屬比例下降為5.35%，而乳桿菌屬持續(xù)增長(zhǎng)至相對(duì)豐度為34.88%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬。

冰溫貯藏10 d SP與CK組微生物菌落結(jié)構(gòu)較為相似，之后肉食桿菌屬相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)，貯藏30 d時(shí)相對(duì)豐度達(dá)到11.70%；而此時(shí)環(huán)絲菌屬和乳桿菌屬的相對(duì)豐度分別為27.32%和43.54%，乳桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌屬。冷藏過(guò)程中，SP組乳桿菌屬相對(duì)豐度增至最大值（47.89%，20 d）后略有下降（43.38%，30 d），但仍為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次為肉食桿菌屬（25.83%，20 d）和環(huán)絲菌屬（17.78%，30 d）。

VP組在冰溫貯藏前期以不動(dòng)桿菌（29.25%，10 d）和發(fā)光桿菌（Photobacterium）（18.41%，10 d）為主，冰溫貯藏中期肉食桿菌屬相對(duì)豐度增至13.52%（20 d），冰溫貯藏后期環(huán)絲菌屬（25.20%，30 d）和乳桿菌屬（43.51%，30 d）成為優(yōu)勢(shì)菌屬。冷藏過(guò)程中，貯藏20 d VP組環(huán)絲菌屬相對(duì)豐度升高至21.89%，但貯藏30 d時(shí)降低至8.29%，此時(shí)乳桿菌屬和肉食桿菌屬相對(duì)豐度分別為41.55%和21.00%，乳桿菌屬依然占優(yōu)勢(shì)地位。

圖4 羊肉貯藏過(guò)程中微生物群落屬水平相對(duì)豐度變化（n＝3）Fig. 4 Changes in relative abundance of microflora at the genus level in mutton during storage (n = 3)

2.5 Beta多樣性分析結(jié)果

主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，用于研究樣本群落組成的相似性或差異性[21]。樣本距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。如圖5所示，PC1貢獻(xiàn)率為44.73%，PC2為36.33%，PC1與PC2的綜合差異能夠解釋全部結(jié)果的81.06%，可以解釋組間差異。SPB30、VPB30和VPB20等聚集在第4象限，APA10、APA20和VPA10等聚集在第3象限，表明貯藏溫度對(duì)菌落結(jié)構(gòu)組成的影響大于包裝方式。值得注意的是，SPA10和CK聚集在第2象限，這表明SP結(jié)合冰溫保鮮羊肉在貯藏10 d時(shí)其菌落結(jié)構(gòu)仍與新鮮羊肉相似。冷藏20 d和30 d的AP、VP和SP樣品在圖中距離較近，說(shuō)明冷藏條件下貯藏后期各處理組菌群結(jié)構(gòu)相似性較高。

圖5 羊肉貯藏過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)PCoA圖Fig. 5 PCoA of microfloral structure in mutton during storage

由圖6可知，所有樣品的遺傳相似系數(shù)在0.10～0.85之間，其中SPB30和APB30、APB20和VPB20相似系數(shù)最大為0.83，這與PCoA分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明冷藏條件下，無(wú)論何種包裝方式，貯藏后期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均趨于一致。SPA30、SPA20和APA30相似系數(shù)均接近0，這表明冰溫條件下，即使是貯藏后期，包裝方式的不同也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大遺傳差異。

此外，SPA20、APB10和VPB10遺傳相似系數(shù)均大于0.7，表明冰溫條件下SP貯藏20 d的樣品與冷藏條件下VP、AP貯藏10 d的樣品遺傳相似度較高，進(jìn)一步說(shuō)明了冰溫貯藏的有效性。此外，CK和SPA10的相似系數(shù)接近0.7，再次證明冰溫貯藏10 d SP羊肉菌落結(jié)構(gòu)與新鮮羊肉相似，表明SP結(jié)合冰溫貯藏保鮮效果較好。

圖6 羊肉貯藏過(guò)程中微生物群落聚類分析圖Fig. 6 Clustering analysis of bacterial community in mutton during storage (n = 3)

2.6 差異基因的KEGG富集分析結(jié)果

微生物代謝途徑的豐富程度能夠反映食品中成分進(jìn)行物質(zhì)代謝的狀態(tài)，可以了解食品中微生物的代謝活性和食品變質(zhì)過(guò)程[22]，通過(guò)差異基因的KEGG富集分析可以進(jìn)一步深入了解不同代謝途徑（碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝）對(duì)羊肉變質(zhì)進(jìn)程的影響。根據(jù)16S rDNA測(cè)序結(jié)果繪制樣品中微生物主要代謝途徑，如圖7所示，包裝方式和貯藏溫度不同，微生物的代謝途徑有所差異。本實(shí)驗(yàn)中富集基因較多的代謝通路包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝。CK組樣品氨基酸代謝通路的基因相對(duì)豐度最高，隨著貯藏過(guò)程的進(jìn)行，氨基酸代謝通路的基因相對(duì)豐度降低。冷藏條件下，AP、VP和SP組氨基酸和核苷酸代謝通路基因的相對(duì)豐度均低于冰溫貯藏，而碳水化合物代謝通路的基因相對(duì)豐度均高于冰溫貯藏。

圖7 羊肉貯藏過(guò)程中微生物群落代謝功能預(yù)測(cè)Fig. 7 Predicted metabolic functions of microbial community in mutton during storage

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)協(xié)同平板計(jì)數(shù)方法考察包裝方式和貯藏溫度對(duì)微生物數(shù)量和群落組成的影響。實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)鑒別性培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法考察了羊肉貯藏過(guò)程中常見(jiàn)6 種微生物數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)冰溫（-1.7 ℃）組TVC、乳酸菌數(shù)、假單胞菌數(shù)、嗜冷菌數(shù)、葡萄球菌數(shù)及霉菌和酵母菌數(shù)均明顯低于冷藏（4 ℃）組。冰溫貯藏是繼冷凍和冷藏之后的第三代保鮮技術(shù)，既可防止食品中冰晶的形成，避免食品組織結(jié)構(gòu)受到損傷，又能很好地抑制微生物生長(zhǎng)，延緩生理生化反應(yīng)速率。文獻(xiàn)報(bào)道顯示冰溫貯藏能較好地抑制羊肉中腐敗菌的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)貨架期[23]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法再一次證明了該結(jié)論。特別是與冷藏相比，冰溫貯藏組乳酸菌數(shù)、葡萄球菌/微球菌數(shù)和假單胞菌數(shù)均降低了2 個(gè)數(shù)量級(jí)。就包裝方式而言，SP作為近些年出現(xiàn)的新型包裝方式，具有方便、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，與AP和VP比較，SP降低了微生物數(shù)量，這可能是因?yàn)镾P的表面與羊肉貼合更緊密，減少了包裝褶皺，汁液無(wú)法滲出，減少了微生物繁殖[24]。劉義等[25]也證實(shí)SP鱘魚(yú)片微生物數(shù)量顯著低于SP和托盤包裝。

高通量測(cè)序技術(shù)可以全面研究羊肉貯藏過(guò)程中微生物的物種組成及豐度信息，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，微生物群落多樣性下降但某些菌屬的豐度上升，尤其在貯藏末期，乳桿菌屬、環(huán)絲菌屬和肉食桿菌屬占據(jù)羊肉微生物物種的80%以上，說(shuō)明這些菌屬成為優(yōu)勢(shì)致腐菌并抑制其他菌屬的生長(zhǎng)。

假單胞菌是典型的嗜冷菌，即使在低溫條件下也能生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還是好氧微生物，在有氧條件下可分解肉中的蛋白質(zhì)和脂肪等產(chǎn)生具有特殊氣味的硫化物、酯和酸等代謝產(chǎn)物[26-27]，導(dǎo)致羊肉腐敗變質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，AP樣品貯藏10 d時(shí)假單胞菌快速生長(zhǎng)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度最高達(dá)到65.01%（冰溫），而貯藏30 d時(shí)，乳桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬；冷藏10 d時(shí)VP和SP組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌，冰溫貯藏10 d時(shí)VP和SP的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為不動(dòng)桿菌和卡斯特蘭尼氏菌，但貯藏30 d時(shí)，VP和SP的優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬。乳桿菌屬作為兼性厭氧菌，能夠利用肉中的碳水化合物產(chǎn)生乳酸，還會(huì)使肉產(chǎn)生酸腐味和奶酪味，為無(wú)氧條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[28]，貯藏過(guò)程中還會(huì)通過(guò)氨基酸代謝產(chǎn)生大量二氧化碳，進(jìn)一步降低包裝中氧氣濃度，為自身生長(zhǎng)提供有利條件[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論何種包裝方式和貯藏溫度，乳桿菌屬均為貯藏終點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬，特別是冷藏結(jié)束時(shí)SP組和VP組豐度分別達(dá)到43.38%和41.55%。Zhao Fan等[30]研究也發(fā)現(xiàn)乳桿菌為真空包裝豬肉低溫貯藏結(jié)束時(shí)的優(yōu)勢(shì)微生物。

環(huán)絲菌屬無(wú)論在有氧還是無(wú)氧條件下都能夠生長(zhǎng)繁殖，無(wú)氧包裝對(duì)其抑制效果不顯著，該菌屬具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)和脂肪分解能力，在豬肉、牛肉和羊肉中均存在，會(huì)產(chǎn)生惡臭的奶酪或乳制品腐敗氣味，產(chǎn)生綠色液體使肉發(fā)綠，是原料肉中的主要腐敗菌[31]。本實(shí)驗(yàn)中環(huán)絲菌屬在6 組樣品的不同貯藏時(shí)期豐度均較高，特別是SP組樣品，豐度最高達(dá)到44.54%（SPA20），貯藏30 d時(shí)，冰溫VP和SP組樣品中環(huán)絲菌屬相對(duì)豐度高于AP組，而冷藏VP和SP組的環(huán)絲菌屬相對(duì)豐度低于AP組。Li Miaoyun等[17]研究表明，環(huán)絲菌是真空包裝豬肉貯藏末期的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

肉食桿菌屬存在于魚(yú)、肉和其他各種食物中，該菌屬能夠分解糖類產(chǎn)生乳酸，降低貯藏環(huán)境的pH值，它還能夠利用精氨酸產(chǎn)生氨類物質(zhì)，產(chǎn)生不愉快氣味[32]。Egan[33]研究發(fā)現(xiàn)，真空包裝牛肉在0 ℃下貯藏10～12 周，肉食桿菌屬為其優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一。本實(shí)驗(yàn)中肉食桿菌屬多存在于冷藏樣品中，特別是在貯藏30 d后，3 種包裝樣品中肉食桿菌屬的豐度達(dá)到18.94%～25.00%，高于冰溫貯藏樣品的2.68%～13.31%，可見(jiàn)冰溫貯藏對(duì)肉食桿菌屬生長(zhǎng)具有抑制作用。

微生物代謝途徑?jīng)Q定了食品腐敗變質(zhì)的程度。本實(shí)驗(yàn)中富集基因較多的代謝通路包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝，與Reis等[34]對(duì)冷鮮羊肉的研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)中所有樣品中碳水化合物代謝富集最顯著，碳水化合物代謝是能量代謝的過(guò)程。羊肉表面存在著大量代謝活躍的微生物，在酶作用下微生物利用葡萄糖等碳水化合物進(jìn)行自身生長(zhǎng)代謝。其中假單胞菌、乳酸菌和環(huán)絲菌主要以葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖為底物，分解代謝產(chǎn)生乳酸、甲酸和乙酸，最終導(dǎo)致食品基質(zhì)pH值的降低[28]。酸性物質(zhì)的積累有利于乳酸菌的生長(zhǎng)，所以貯藏后期乳酸菌大量繁殖，冷藏樣品的乳酸菌數(shù)高于冰溫貯藏，而對(duì)應(yīng)碳水化合物代謝的基因相對(duì)豐度也較高。

氨基酸代謝包括兩個(gè)途徑：一為合成自身蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)的途徑，可為微生物生長(zhǎng)提供氮源；二為分解氨基酸為α-酮酸、胺類及二氧化碳的途徑，而且其中α-酮酸可轉(zhuǎn)化為糖、脂質(zhì)或非必需氨基酸，也可以參與三羧酸循環(huán)生成二氧化碳和水，并釋放能量[35]。Li Ning等[22]認(rèn)為，與碳水化合物代謝相比，假單胞菌屬對(duì)氨基酸代謝貢獻(xiàn)更大，本實(shí)驗(yàn)支持該結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)中氨基酸代謝主要表現(xiàn)在貯藏前期，假單胞菌和肉食桿菌等利用氨基酸代謝為自身生長(zhǎng)繁殖提供能量，但隨著假單胞菌在貯藏后期豐度的減弱，氨基酸代謝通路的基因相對(duì)豐度也降低。與冷藏比較，冰溫貯藏樣品中假單胞菌數(shù)低2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，但冰溫樣品的氨基酸代謝通路的基因相對(duì)豐度略高于冷藏樣品。

核苷酸分為嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸兩大類，這兩種核苷酸的代謝均包括合成和分解代謝。核苷酸水解酶將核苷酸水解生成核苷，最終生成堿基和磷酸核糖，參與糖酵解或三羧酸循環(huán)[36]。核苷酸代謝為羊肉中微生物生長(zhǎng)提供了可利用的碳源，增強(qiáng)了微生物的增殖能力。研究顯示乳酸菌中含有調(diào)控核苷酸合成代謝的兩個(gè)主要調(diào)節(jié)因子——嘌呤和嘧啶調(diào)節(jié)因子[37]，這表明乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程與核苷酸的合成代謝密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中核苷酸代謝通路基因相對(duì)豐度的變化與乳酸菌數(shù)量變化一致，說(shuō)明乳酸菌增殖的過(guò)程也是核苷酸代謝的過(guò)程。

4 結(jié) 論

微生物計(jì)數(shù)結(jié)果表明無(wú)論何種包裝方式，冷藏AP、VP和SP組羊肉貨架期均為10 d，而冰溫貯藏SP和VP組羊肉貨架期為20 d，AP組為15 d。貯藏第20天時(shí)，冰溫SP組TVC僅為5.63（lg（CFU/g）），顯著低于其他貯藏組（P＜0.05），由此說(shuō)明SP協(xié)同冰溫貯藏可提高羊肉的微生物安全性。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在不同包裝的冷藏和冰溫貯藏羊肉微生物中鑒定出10 個(gè)菌門和30 個(gè)菌屬，厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門；新鮮羊肉的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌和芽孢桿菌，貯藏后期環(huán)絲菌屬、肉食桿菌屬和乳桿菌屬為所有樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬。多樣性分析結(jié)果表明冰溫貯藏能夠有效降低羊肉微生物菌群的多樣性和豐富度，代謝途徑分析結(jié)果顯示貯藏前期以氨基酸代謝為主，貯藏后期主要以碳水化合物代謝和核苷酸代謝為主。包裝方式和貯藏溫度的不同導(dǎo)致羊肉貯藏期間的菌群數(shù)量、組成發(fā)生差異，從而導(dǎo)致代謝途徑及豐度不同，而SP協(xié)同冰溫貯藏具有較好的貯藏效果。