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        臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)大鼠卵巢功能作用及機(jī)制研究

        2022-11-26 02:34:08趙瑩瑩陳莉莎王愷悅劉星池于月新
        臨床軍醫(yī)雜志 2022年11期
        關(guān)鍵詞:血清水平檢測(cè)

        趙瑩瑩, 陳莉莎, 閆 麗, 王愷悅, 魏 威, 劉星池, 于月新

        北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,遼寧 沈陽(yáng) 110003

        卵巢早衰是一種嚴(yán)重影響女性健康的卵巢功能障礙性疾病,會(huì)出現(xiàn)一系列由于激素紊亂導(dǎo)致的臨床癥狀[1-3]。過(guò)度激活的細(xì)胞凋亡或排卵期間無(wú)健康的卵泡發(fā)育是卵巢早衰的主要病因。目前,臨床對(duì)于卵巢早衰缺少有效的治療方法,如何修復(fù)卵巢損傷成為臨床亟待解決的問(wèn)題[4-6]。雌激素相關(guān)治療可改善患者的臨床癥狀,但對(duì)卵巢功能重建的作用甚微,不能從根本上改善卵巢功能。有研究報(bào)道,干細(xì)胞移植或卵巢冷凍移植可挽救部分卵巢早衰。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes,MSCs-exo)是具有生物活性的納米級(jí)囊泡,具有易提取、免疫原性低的特點(diǎn),能夠執(zhí)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)功能,調(diào)節(jié)目標(biāo)組織器官的正常生理功能和異常病理過(guò)程[7]。有學(xué)者將MSCs-exo用于多種損傷模型,均呈現(xiàn)出了良好的功能修復(fù)與治療效果,其作用機(jī)理和生物學(xué)功能是目前再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[8-10]。但MSCs-exo對(duì)卵巢早衰動(dòng)物模型的作用和機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討MSCs-exo對(duì)大鼠卵巢功能的修復(fù)及保護(hù)作用,并初步研究其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 24只SD大鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司,飼養(yǎng)于 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,溫度維持(22±3)℃,濕度維持45%~65%,自由飲食飲水。MSCs-exo購(gòu)自遼寧潤(rùn)基生物科技有限公司;去氧乙烯基環(huán)己烯(VCD)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;大鼠ELISA試劑盒和細(xì)胞染料購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;Western blot抗體購(gòu)自abcam公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7 d后,將其隨機(jī)分為空白組、模型組和干預(yù)組3組,每組各8只??瞻捉M腹腔注射芝麻油,模型組和干預(yù)組腹腔注射VCD溶液(160 mg/kg),連續(xù)注射15 d后干預(yù)組尾靜脈注射MSCs-exo懸液(150 μg/kg)。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠處死后使用75%乙醇浸泡10 min消毒,取卵巢置于預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)中,剪碎后加入0.25%胰酶(含0.01% EDTA),室溫消化,濾網(wǎng)過(guò)濾,離心后DMEM/F12培養(yǎng)液制成顆粒細(xì)胞懸液,置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、飽和濕度)中培養(yǎng),每隔48 h更換1次培養(yǎng)液。模型組、干預(yù)組采用VCD濃度為30 μmol/L的完全培養(yǎng)基建立顆粒細(xì)胞損傷模型,干預(yù)組加入10 μg MSCs-exo。

        1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 每孔加入10 μl的CCK-8試劑,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度值。檢測(cè)細(xì)胞活力,每2 d測(cè)定1次,連續(xù)測(cè)定10 d。以細(xì)胞活力為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

        1.4 激素分泌檢測(cè) 細(xì)胞接種于24孔板后進(jìn)行分組處理,在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng),3 d后收集培養(yǎng)液,按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)雌二醇和孕激素水平。

        1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 利用流式細(xì)胞儀,采用Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞中的存活細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞及凋亡晚期細(xì)胞的比例。細(xì)胞經(jīng)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后加入染料,孵育后上機(jī)檢測(cè)。

        1.6 血清激素水平測(cè)定 大鼠麻醉后眼眶取血,將取好的血液在室溫下靜置30 min,4℃、1 500 r/min離心15 min,取上清液,采用ELISA法測(cè)定血清激素水平。

        1.7 Western blot法 提取細(xì)胞和組織蛋白,測(cè)定總蛋白,將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫封閉1 h,分別用Ras(abcam,ab52939,1∶1 000)、Erk(abcam,ab109282,1∶1 000)、Bax(abcam,ab32503,1∶1 000)、Caspase-3(abcam,ab184787,1∶1 000)一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次,加入相對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,用ECL Western印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠顆粒細(xì)胞增殖率比較 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組、干預(yù)組干預(yù)2 d、4 d、6 d、8 d、10 d的顆粒細(xì)胞增殖率均低于空白組,且模型組低于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

        圖1 各組大鼠顆粒細(xì)胞增殖率變化 圖2 各組大鼠激素水平比較(a.顆粒細(xì)胞雌二醇水平;b.顆粒細(xì)胞孕激素水平;c.血清雌二醇水平;d.血清孕激素水平) 圖3 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白水平比較(a.各組細(xì)胞三周之情況;b~d.各組Bax、caspase-3蛋白表達(dá)) 圖4 各組大鼠Ras、Erk蛋白表達(dá)水平比較(a.Western blot法檢測(cè)Ras、Erk表達(dá);b.Ras相對(duì)表達(dá)量;c.Erk相對(duì)表達(dá)量)

        2.2 各組大鼠激素水平比較 模型組、干預(yù)組顆粒細(xì)胞雌二醇水平、顆粒細(xì)胞孕激素水平、血清雌二醇水平、血清孕激素水平均低于空白組,且模型組低于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

        2.3 各組大鼠卵巢細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白水平比較 模型組、干預(yù)組顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量高于空白組,且模型組高于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、干預(yù)組大鼠卵巢組織Bax和Caspase-3表達(dá)水平高于空白組,且模型組高于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

        2.4 各組大鼠Ras、Erk蛋白表達(dá)水平比較 模型組、干預(yù)組卵巢組織Ras、Erk蛋白表達(dá)水平低于空白組,且模型組低于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

        3 討論

        卵巢能夠產(chǎn)生卵細(xì)胞并分泌激素,卵巢中的卵母細(xì)胞或者顆粒細(xì)胞被機(jī)體內(nèi)外的各種生理病理因素?fù)p傷會(huì)導(dǎo)致卵巢功能下降或衰竭[11]。有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡會(huì)對(duì)卵巢功能造成嚴(yán)重影響[12-14]。閉鎖卵泡中的大部分顆粒細(xì)胞均發(fā)生了凋亡,而發(fā)育卵泡中的顆粒細(xì)胞并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡,因此,顆粒細(xì)胞凋亡可能是卵巢早衰的重要原因[15]。本研究成功建立了卵巢損傷模型,采用MSCs-exo干預(yù)后,顆粒細(xì)胞增殖和卵巢激素分泌功能有所改善,提示顆粒細(xì)胞凋亡影響了激素分泌功能。本研究結(jié)果顯示,模型組、干預(yù)組大鼠卵巢組織Bax和Caspase-3表達(dá)水平高于空白組,且模型組高于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因,其蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿。細(xì)胞漿內(nèi)活化的Bax蛋白可以插入并改變線粒體膜的通透性,引起細(xì)胞色素C釋放,Caspase-3被激活,啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志性蛋白酶,正常狀態(tài)下以酶原形式存在,當(dāng)?shù)蛲龃碳ひ蜃蛹せ頒aspase-3,可引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17-19]。

        Ras-Erk信號(hào)通路在卵巢顆粒細(xì)胞激素分泌和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EGFR/Ras通路下游靶激酶Erk1/2在卵巢早衰顆粒細(xì)胞中被破壞會(huì)影響細(xì)胞凋亡、增殖和遷移,導(dǎo)致激素分泌功能降低[20]。因此,本研究在明確了MSCs-exo干預(yù)對(duì)卵巢的作用后,進(jìn)一步檢測(cè)了Ras-Erk信號(hào)通路的變化,闡明了MSCs-exo可能通過(guò)Ras-Erk減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,促進(jìn)卵巢功能。

        綜上所述,MSCs-exo能夠有效調(diào)節(jié)卵巢功能,促進(jìn)細(xì)胞增殖,其可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ras-Erk通路,減少細(xì)胞凋亡。

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