祝昊，尚暉，張洋，陳瑞，沈天宇，向治成

（湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 脊柱外科，湖北 十堰 442000）

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degeneration,IDD）是導致下腰痛的常見原因，全球有80% 以上的人都受到了相關問題的困擾［1］，同時也成為全球致殘和巨大醫(yī)療開支的重要原因［2］。腰椎間盤由髓核（nucleus pulposus,NP）、纖 維 環(huán)（annulus fibrosus,AF）以 及 終 板（endplate）三部分組成，隨著年齡的增加，椎間盤的組成成分和微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定的變化，如髓核因結(jié)合水的能力降低而收縮變小，進而導致椎間盤在承受負荷時纖維環(huán)出現(xiàn)受損或分層，加速椎間盤及其周圍組織的退行性變化，造成嚴重的后果。目前針對這種疾病的治療手段主要有兩種，第一種是通過藥物或其它物理療法進行保守治療，第二種是通過手術(shù)的方式進行椎間盤的切除，達到解除壓迫，緩解癥狀的目的。盡管手術(shù)方式多樣［3］，但手術(shù)會造成自身及相鄰組織的進一步退變，遠期預后不佳［4］。因此，解決退變組織內(nèi)的炎癥問題［5］，減少功能細胞的損失，恢復細胞外基質(zhì)含量，才能實現(xiàn)有效的治愈。細胞椎間盤退變的逆轉(zhuǎn)對脊柱健康有潛在的巨大影響［6］。在這樣的背景下，通過組織工程的手段對已損傷的椎間盤進行修復受到了更多的關注，相關領域的探索、創(chuàng)新也在不斷進行。

高分子材料的應用是組織工程的重要組成，以高分子材料為載體，模仿髓核的理化性質(zhì)，配合種子細胞、生長因子的研究在近些年取得了較大的進展。目前大多數(shù)研究中，高分子材料主要用于構(gòu)建支架，作為細胞移植的載體。集成3D 生物打印技術(shù)制備載細胞腰椎間盤支架也有一定的可行性［7］。本文從高分子材料在治療椎間盤退變的應用上分析，結(jié)合近幾年的研究作一個綜述。

1 高分子材料作為支架材料的應用

高分子材料作為移植細胞的載體，可以為植入的細胞提供適宜的生存環(huán)境，以保證移植細胞植入后的效果。另外，治療椎間盤退變的組織工程結(jié)構(gòu)必須適應缺氧和炎癥退變的椎間盤微環(huán)境［8］。目前常用作載體的高分子材料主要分為天然材料與合成材料兩種，通常結(jié)合分子交聯(lián)等手段形成互穿聚合物網(wǎng)絡水凝膠［9］。

1.1 天然材料

用于構(gòu)建髓核支架的天然高分子材料主要有膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、海藻酸鈉等。由它們參與構(gòu)成的水凝膠是組織再生的有效結(jié)構(gòu)［10］。天然材料與植入細胞之間可以產(chǎn)生良好的聯(lián)系［11］，使其擁有更加廣闊的應用前途。

殼聚糖（chitosan,CH）化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，擁有良好的生物官能性和相容性，在體內(nèi)也有較高的安全性，同時，被證明可以用于增加復合材料的強度［12］。KUANG等［13］利用脫細胞髓核基質(zhì)與殼聚糖組成的混合水凝膠培養(yǎng)髓核干細胞，發(fā)現(xiàn)添加了生長因子的混合水凝膠中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的基因表達得到增強。ADOUNGOTCHODO等［14］在基于殼聚糖的水凝膠中添加了名為Link N的天然肽后，發(fā)現(xiàn)補充有LN 的殼聚糖水凝膠可以幫助在椎間盤退化的早期階段恢復NP 的功能。YUAN 等［15］用殼聚糖水凝膠作為在體外構(gòu)造的組織工程椎間盤的髓核支架，發(fā)現(xiàn)其很好地滿足椎間盤的天然結(jié)構(gòu)以及力學的相關要求。ALINEJAD等［16］研究了幾種新型的溫敏性殼聚糖水凝膠，這些新型水凝膠是由CH 與三種膠凝劑（碳酸氫鈉和/或β-甘油磷酸和/或磷酸鹽緩沖液）的不同組合混合而成，通過測量植入的髓核細胞存活率、新陳代謝和蛋白多糖的合成來評估水凝膠的細胞相容性和功能，發(fā)現(xiàn)了能更好表現(xiàn)出與人NP 組織相似的力學性能，并能更好地刺激NP 細胞蛋白多糖的合成和保留的溫敏性殼聚糖水凝膠。SCHMITT等［17］選擇10 只椎間盤受損的綿羊，每只均有3個椎間盤受損，采用注射的方式給每只綿羊的2個椎間盤注入裝載脂肪來源干細胞（adiposederived stem cells,ASCs）的殼聚糖羧甲基纖維素水凝膠支架，12 個月后，與未治療的受損IVD 相比，治療后的椎間盤高度穩(wěn)定，退行性變進展明顯減輕。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA），又稱糖醛酸、玻尿酸，是一種由雙糖（D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺）基本結(jié)構(gòu)組成的糖胺聚糖，是結(jié)締組織、上皮組織、神經(jīng)組織和天然細胞外基質(zhì)的主要成分［18］，它的透明質(zhì)分子具有吸收500 倍體積以上水的能力。RAJAN 等［19］發(fā)現(xiàn)利用石墨烯、殼聚糖以及透明質(zhì)酸制得的復合材料支架，相對于普通透明質(zhì)酸水凝膠具有更有利于種子細胞存活及分化的膠孔隙率、密度、溶脹等特性。YAMAMOTO 等［20］發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸可以通過調(diào)節(jié)p38 和ERK1/2 通路抑制椎間盤退變，改善椎間盤的炎癥情況。KAZEZIAN 等［21］證明了透明質(zhì)酸作為一種抗炎分子，通過將椎間盤環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟暮铣纱x狀態(tài)，并通過促進天然椎間盤(intervertebral disc,IVD)基質(zhì)的產(chǎn)生而起到了抗炎分子的作用。CHEN 等［22］開發(fā)了一種光交聯(lián)明膠-甲基丙烯酸透明質(zhì)酸水凝膠用于培養(yǎng)脂肪基質(zhì)細胞髓核樣分化，發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)條件下的脂肪基質(zhì)細胞向髓核細胞分化效果良好，大鼠髓核基質(zhì)明顯增多，椎間盤高度指數(shù)明顯升高。MOHD ISA等［23］在椎間盤損傷的大鼠模型中植入透明質(zhì)酸水凝膠，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸可以有效減輕炎癥和疼痛。KIM 等［24］利用多孔聚己內(nèi)酯及透明質(zhì)酸水凝膠組建復合的組織工程椎間盤，并將其植入大鼠尾棘5周，觀察到5 周后結(jié)構(gòu)仍然保持完整。

海藻酸鈉（sodium alginate,SA）是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產(chǎn)物，其在醫(yī)藥領域用作生物可降解無毒材料［25］，擁有可以在溫和輻射條件下加工的優(yōu)勢［26］。海藻酸鹽在與生理環(huán)境接觸時會凝膠化成更柔軟的結(jié)構(gòu)，從而限制了其在軟組織再生中的潛力，不適合與承重身體部位相關的使用［27］。海藻酸鈉易于陽離子形成凝膠，同時也可以在結(jié)構(gòu)中加入多種有機材料增加其強度，海藻酸鈉中的醛端基可以主導其與明膠的交聯(lián)［28］。ERWIN 等［29］利用海藻酸鈉水凝膠在3D 培養(yǎng)基中培養(yǎng)犬的脊索細胞，發(fā)現(xiàn)在缺氧的條件下，脊索細胞產(chǎn)生了與體內(nèi)觀察到的結(jié)構(gòu)高度相似的結(jié)構(gòu)。MIETSCH 等［30］比較了3D微球培養(yǎng)和海藻酸鹽微球，以及不同培養(yǎng)基組成，通過加入人富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）或轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-1）在靜水壓作用下對人間充質(zhì)干細胞與髓核細胞軟骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)在適宜因子的體外誘導下，海藻酸鹽在支架的構(gòu)建中可以發(fā)揮出理想的生物學作用。WANG等［31］以藻酸鹽水凝膠為載體，比較不同種子細胞植入后的效應，發(fā)現(xiàn)相同條件下軟骨終板來源的干細胞的成骨效應相較于纖維環(huán)或髓核來源的干細胞優(yōu)越。TSUJIMOTO 等［32］發(fā)現(xiàn)超純化海藻酸鹽（ultra-purified alginate,UPAL）凝膠與人類IVD 細胞具有生物相容性，并在椎間盤切除術(shù)后促進細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，顯示出足夠的生物力學特性而沒有材料突出。URA 等［33］在椎間盤切除術(shù)的動物模型中，植入UPAL 凝膠，證明UPAL 凝膠植入抑制TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生，下調(diào)TrkA 的表達，抑制IVD 變性，減少傷害性行為。SUN 等［34］采用全氟三丁胺（perfluorotributylamine,PFTBA）作為海藻酸鹽支架的氧氣調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)富含PFTBA 的海藻酸鹽可恢復椎間盤高度和細胞外基質(zhì)含量，促進植入的髓核細胞的增殖。NAQVI 等［35］研究骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）在常氧（20%）和低氧（5%）條件下三維培養(yǎng)時對不同pH 環(huán)境［血液（pH 7.4）、健康椎間盤（pH 7.1）、輕度退變椎間盤（pH 6.8）和嚴重退變椎間盤（pH 6.5）］的反應。發(fā)現(xiàn)在低于pH 6.8 時，由海藻酸鈉包裹的干細胞增殖出現(xiàn)障礙，細胞不能存活和積累髓核樣基質(zhì)成分（糖胺聚糖和膠原）。HUDSON 等［36］發(fā)現(xiàn)低氧（1%～5%O2）條件下培養(yǎng)三維結(jié)構(gòu)可以增加原代IVD 細胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生。DU 等［37］將以包裹NP 細胞的海藻酸鈉水凝膠為核心的工程化IVD 植入物在裸鼠皮下植入后，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，顯示出逐漸的組織形成，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)的沉積和組織以及機械性能的增強。

還有一些天然材料也常應用于髓核的組織工程中。膠原（collagen）是髓核的重要組成成分之一。WANG 等［38］利用戊二醛交聯(lián)型膠原構(gòu)建一種新的人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)和分化的支架，發(fā)現(xiàn)與Ⅰ型膠原相比，Ⅱ型膠原涂層板培養(yǎng)的干細胞表現(xiàn)出了sox-9、Ⅱ型膠原和aggrecan 基因表達的增加。XU 等［39］將髓核細胞封裝在膠原蛋白水解物、明膠和甲基丙烯酸酯（GelMA）組成的光敏水凝膠中，通過調(diào)節(jié)GelMA 水凝膠濃度觀察不同濃度下髓核細胞增殖、存活的狀態(tài)，得到了最佳的水凝膠濃度（5%）。CHOY 等［40］用膠原蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）制作了一個雙相支架，并且通過機械測試測得其恢復率（82%～89%）接近原生椎間盤（99%），并且動態(tài)剛度和阻尼系數(shù)與原生椎間盤相似。CHIK 等［41］以骨髓間充質(zhì)干細胞和膠原等高分子材料為原料，采用基于模塊的一體化方法構(gòu)建具有復雜層次結(jié)構(gòu)的多組分脊柱運動節(jié)段（spinal motor segmen,SMS），創(chuàng)造了研究組織成熟和功能重塑的三維模型。

通過脫細胞過程獲得的脫細胞材料也可用作支架材料，這項技術(shù)的特點是其可以保持關鍵的天然細胞外基質(zhì)（ECM）成分［42］。WU 等［43］通過脫細胞與凍干、交聯(lián)的處理，制備了豬源脫細胞基質(zhì)作為集成雙相IVD 支架，熒光顯微鏡和掃描電鏡顯示，該支架為AF 和NP 細胞的黏附和增殖提供了合適的三維環(huán)境，在保留了大量的膠原蛋白的同時，提供了較好的力學性能。CHAN 等［44］利用脫細胞技術(shù)對牛IVD 進行脫細胞處理，構(gòu)建完整的終板到終板IVD 支架，通過改變化學和物理脫細胞參數(shù)，實現(xiàn)了高達70%的內(nèi)源性細胞的去除，并能夠保存椎間盤的糖胺聚糖含量、膠原纖維結(jié)構(gòu)和機械性能。

1.2 合成材料

目前常用的人工合成材料包括聚乳酸和聚乙醇酸等［44］。聚乳酸（polylactic acid,PLA）又名聚丙交醇，在體內(nèi)可以降解為無害的乳酸，常用來作為人體的植入物。XIANG 等［45］利用聚乳酸支架共培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和胎兒髓核細胞，在植入兔椎間盤12 周后，觀察到植入細胞纖維樣表型，附著在聚乳酸-羥基乙酸（polylactic acid-polyglycolic acid,PLGA）支架上時形態(tài)正常，說明PLGA 支架提供了可行的生長條件、力學性能和空間結(jié)構(gòu)。KIM 等［46］開發(fā)了不同孔徑的多孔聚乳酸-羥基乙酸支架，用于NP 細胞的培養(yǎng)，并研究了孔徑大小對細胞生長和ECM 合成的影響，發(fā)現(xiàn)小孔隙內(nèi)細胞密度高，通過相互連通的孔促進膠原合成和細胞遷移。大孔隙支架細胞增殖和膠原合成較慢。

醫(yī)用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）又稱聚環(huán)氧乙烷，在一般條件下有著良好的穩(wěn)定性和溫和性。NGUYEN［47］等合成了一類新型、結(jié)構(gòu)清晰、機械強度可調(diào)的聚乙二醇基納米復合水凝膠，壓應力為24.2 MPa，壓縮斷裂應變大于98%，展現(xiàn)了強大的抗壓能力。CHEN 等［48］通過四臂聚乙二醇（PEG-SH）與銀離子溶液的Ag-S 配位作用，合成了一種具有可注射性、自愈性、抗菌、可降解性和高吸水性的PEG 水凝膠，發(fā)現(xiàn)其與椎間盤的作用機制完全匹配。JEONG 等［49］以羥基磷灰石（HA-SH）和聚乙二醇乙烯基砜（PEG-VS）大分子單體為原料，制備了8 種不同的水凝膠，并將其作為NP 和AF 細胞體外培養(yǎng)的基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)低分子量HA-PEG 水凝膠的NP 和AF 細胞數(shù)最高，而低分子量HA-PEG 水凝膠的NP 和AF 細胞數(shù)也較高。

其它諸如納米高分子材料等。WAN 等［50］以生物相容性、可剪切性和納米纖維結(jié)構(gòu)為特征的新型自組裝肽水凝膠（self-assembling peptide hydrogel,SAPH），作為髓核組織工程的細胞載體和支架材料，發(fā)現(xiàn)用其培養(yǎng)髓核細胞過程中，細胞存活率很高，同時，表型與體內(nèi)的髓核細胞類似，活細胞群保持穩(wěn)定。MA 等［51］設計的新型的RADA16-Link N 自組裝肽支架材料，并將其與生物活性基序Link N 直接偶聯(lián)，得到了Link N 納米纖維支架材料（LN-NS），發(fā)現(xiàn)其能顯著促進植入細胞的黏附與細胞外基質(zhì)的積累。

2 高分子材料的其它應用

有一些研究嘗試直接采用復合合成材料代替髓核。KHANDAKER［52］等使用電紡纖維固定在硅膠盤上，組成ENAS 盤，對植入ENAS 椎間盤的兔尾進行了離體機械測試，發(fā)現(xiàn)ENAS 椎間盤的粘彈性高于硅膠椎間盤，可與人類髓核的粘彈性相媲美。但該法不屬于目前常見的組織工程方法研究范圍，故在這里不作過多的敘述。

3 結(jié)語與展望

髓核具有優(yōu)良的可塑性，其形態(tài)可隨脊柱作各種運動時因重心不同而改變，起著類似軸承一樣滾動支撐椎體的作用。在醫(yī)用植入材料中，金屬材料應用廣泛，但其在體內(nèi)的生物相容性與生物降解性仍存在一定的問題?；谒z的新策略可能有助于揭示IVD 退行性疾病的新可能性。高分子材料具有良好的生物相容性，是目前髓核組織工程中用于構(gòu)建支架材料的常用生物材料，也是目前最受關注的研究對象。膠原、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽等材料制成的水凝膠給種子細胞適宜的生長環(huán)境，結(jié)合合適的生長轉(zhuǎn)化因子，可以達到誘導分化的目的，對于控制炎癥、提高椎間盤的含水量、補充細胞外基質(zhì)以及恢復椎間盤高度有著十分重要的意義；合成材料的創(chuàng)新應用也給研究帶來了更多思路與方向。由于椎間盤特殊的微觀組成及力學特性，需要選擇合適的方式對支架材料進行構(gòu)建，進一步測量材料的動態(tài)性能，以滿足力學強度的要求。在此基礎上，選擇種子細胞及適宜生長因子，最終構(gòu)建完整的組織工程髓核，實現(xiàn)受累椎間盤的修復再生。目前構(gòu)建的水凝膠載體多以注射的方式注入椎間盤組織內(nèi)，雖然已有的研究證明了注射的安全性［53］，但注射造成的纖維環(huán)損傷及可能的退變?nèi)匀恍枰P注，除了注射工具的口徑，注射的部位及路徑還需要更多的實踐證據(jù)。同時，也需要建立更多的動物模型，進一步探究通過組織工程手段治療椎間盤退行性病變的時機，過早或過晚的干預都達不到預期的效果。目前許多組織工程手段如天然高分子的改性、合成高分子的制備等已廣泛應用于臨床，還有許多技術(shù)成果未來將應用于臨床.所以，是否能夠解決患者的疼痛問題應該被重視，疼痛可能來源于多方面，構(gòu)建疼痛模型，觀察治療效果，也應作為目前研究的重點。