王彤彤 張留所

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室 山東青島 266237; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071; 4. 中國科學院大學 北京 100049)

全球氣候變化影響海洋動物的生長發(fā)育、繁殖和代謝等生命過程, 變化的海洋環(huán)境如何影響海洋動物發(fā)育的分子機制還不清楚。本研究團隊構(gòu)建了潛在的海洋線蟲Litoditismarina模式動物研究體系和平臺(Xieet al, 2020; Zhaoet al, 2021), 動物早期發(fā)育階段對環(huán)境變化非常敏感(叢巖懿等, 2020; Xieet al, 2021),但海洋線蟲早期發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚。

秀麗線蟲Caenorhabditiselegans的發(fā)育起始于受精卵, 經(jīng)過多輪的細胞分裂和分化, 孵化為幼蟲, 依次經(jīng)歷L1、L2、L3 和L4 共四個幼蟲階段發(fā)育成為具有多種組織和細胞類型的成蟲(Zhanget al, 2015)。在20 °C 的條件下, 秀麗線蟲從L1 幼蟲發(fā)育到成蟲約需3 d (Zhanget al, 2015)。Sulston 等科學家首次繪制出了秀麗線蟲從受精卵到成體的完整細胞譜系, 在20 °C下, 從受精卵孵化為L1 約需16 h, 剛孵化的L1 幼蟲含558 個細胞, 幼蟲通過細胞分裂和分化并最終發(fā)育成具有959 個體細胞的成體, 不同個體間細胞發(fā)育譜系高度一致(Sulstonet al, 1977, 1983)。

研究發(fā)現(xiàn)約3 千萬年前分化的兩種同屬線蟲C.elegans和C.briggsae在發(fā)育過程中mRNA 和蛋白質(zhì)的變化高度保守, 但同一物種內(nèi)mRNA 和蛋白質(zhì)的變化關(guān)聯(lián)較弱, 該報道也對秀麗線蟲胚胎期和L1 幼蟲間的轉(zhuǎn)錄組變化特征進行了詳細描述(Grünet al,2014)。另一項研究報道胚胎時期幾乎一半的基因表達參與DNA 復(fù)制和染色質(zhì)形成, 以實現(xiàn)快速的細胞分裂和細胞類型增加(Boecket al, 2016)。通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序, 已有報道量化了16 細胞期前基因表達變化, 發(fā)現(xiàn)胚胎期轉(zhuǎn)錄本多樣性隨著時間推移而增加(Tintoriet al, 2016)。通過全長轉(zhuǎn)錄組測序分析, 研究報道秀麗線蟲胚胎轉(zhuǎn)錄本比幼蟲階段的轉(zhuǎn)錄本長,進一步揭示了秀麗線蟲發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化(Liet al, 2020)。

我們團隊聚焦的海洋線蟲L.marina與陸生模式動物秀麗線蟲同屬線蟲動物門小桿線蟲科, 屬于海-陸線蟲近緣物種(Xieet al, 2020; Zhaoet al, 2021)。秀麗線蟲發(fā)育機制研究已經(jīng)比較深入, 而海洋線蟲早期發(fā)育階段的研究基本處于未知階段。海洋線蟲L.marina為雌雄異體, 其發(fā)育起始于受精卵, 受精卵在線蟲子宮內(nèi)完成早期胚胎發(fā)育, 產(chǎn)出體外的胚胎(eggs)孵化后為L1 幼蟲, 20 °C 下, 從L1 幼蟲發(fā)育為成體約需4～5 d(Xieet al, 2020, 2021)。L.marina從L1 幼蟲發(fā)育為成體依次經(jīng)過L2、L3 和L4 幼蟲階段, 從L1 幼蟲發(fā)育為L2 約需46 h, 從L2 幼蟲發(fā)育為L3 約需19 h, 從L3 幼蟲發(fā)育為L4 約需16 h, 而從L4 幼蟲發(fā)育為成體約需15 h (Zhaoet al, 2021)。研究人員通過繪制L.marina的胚胎發(fā)育細胞譜系, 發(fā)現(xiàn)L.marina與秀麗線蟲胚胎細胞譜系同源性高達95.5%, 但末端細胞分化命運的相似度只有76.4%, 表明了細胞分化和發(fā)育命運決定機制在海陸線蟲近緣種間既有相似性又有物種特異性(Houthoofdet al, 2003)。為了初步探究海洋線蟲與秀麗線蟲早期發(fā)育的異同, 本研究對L.marina胚胎時期和孵化后L1 發(fā)育階段2 h、4 h 和6 h 的樣品進行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析, 研究結(jié)果表明, 海洋線蟲與秀麗線蟲早期發(fā)育過程中的調(diào)控機制高度相似, 秀麗線蟲作為一種優(yōu)秀的模式生物, 具有豐富的研究資源,這些資源將極大地輔助海洋線蟲的基礎(chǔ)生物學研究。同時進一步通過基因編輯和轉(zhuǎn)基因營救等技術(shù)和方法深入比較研究L.marina和C.elegans發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因的功能將為海-陸近緣線蟲間的發(fā)育進化機制、海洋線蟲對潮間帶環(huán)境適應(yīng)以及全球氣候變化應(yīng)答的分子機制研究提供新認知。

1 材料與方法

1.1 品系的獲得與培養(yǎng)

本研究所用的海洋線蟲L.marina野生型品系HQ1 采集自青島匯泉灣潮間帶的表層泥沙, 已在實驗室連續(xù)培養(yǎng)5 年, 在20 °C 的條件下, 將其培養(yǎng)于90 mm SW-NGM 平板(Xieet al, 2020)上, 以大腸桿菌E.coliOP50 為食物。

1.2 海洋線蟲大規(guī)模同步化

將海洋線蟲在20 °C 下擴大培養(yǎng)到30 個板以上,待其生長至成蟲且交配產(chǎn)生了大量的卵時, 將平板上的全部線蟲、卵以及菌用滅菌海水洗脫至15 mL離心管中, 靜置5 min 使大蟲自然沉降, 卵及細菌在上清中, 將上清轉(zhuǎn)移至新的15 mL 離心管中, 3 000g離心1 min, 棄上清。加入滅菌水, 混勻, 1 300g離心1 min, 棄上清, 重復(fù)三次。加入3 mL 滅菌水 + 3 mL裂解液[4 mL 高樂式?漂白水(≥6.25%的次氯酸鈉溶液) + 1 mL 10 mol/L NaOH + 5 mL 滅菌水], 充分震蕩75～90 s, 再加入滅菌水到12 mL, 1 300g離心, 棄上清, 重復(fù)3 次。此時得到大量的卵, 將其轉(zhuǎn)移至海水中孵化18～20 h 得到大量同步化的幼蟲L1。

1.3 RNAseq 樣本制備

將同步化后孵化前得到的卵通過400 目網(wǎng)篩過濾,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管, 8 000g離心, 棄上清, 置于液氮中速凍30 min 后保存在–80 °C, 得到胚胎樣品。將同步化的L1 依次通過450 目和500 目網(wǎng)篩過濾后, 置于OP50 的SW-NGM 板上分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h 后, 將平板上的L1 用滅菌海水洗脫至15 mL 離心管, 600g離心1 min, 棄上清。加入滅菌水, 600g離心2.5 min, 棄上清, 重復(fù)3 次。將L1 轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中, 加入滅菌水, 3 000g離心1 min, 棄上清, 置于液氮中速凍30 min 后保存至–80 °C, 得到L1 期2 h、4 h 和6 h 的樣品。

1.4 RNAseq 建庫及分析

提取樣本 RNA, 并使用 NanoDrop 2000 測量RNA 濃度和純度, 使用Agilent 生物分析儀2100 系統(tǒng)的RNA Nano 6000 檢測試劑盒對RNA 完整性進行評估。使用Illumina 的NEBNext UltraTMRNA Library Prep Kit (NEB, USA)試劑盒生成測序文庫。使用TruSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumia)在cBot Cluster Generation System 上對指標編碼的樣本進行聚類, 然后在Illumina 平臺上對文庫進行測序生成雙端reads, 最終獲得文庫。

原始fastq 數(shù)據(jù)過濾掉含接頭和低質(zhì)量的reads后, 得到高質(zhì)量Clean Data。使用HISAT2 (Kimet al,2015)將其比對到參考基因組得到Mapped reads, 然后利用String Tie (Perteaet al, 2015)將比對上的reads進行組裝和定量。對各樣品中的Mapped reads 的數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長度進行歸一化, 采用FPKM (Floreaet al,2013)作為衡量基因表達水平的指標, 對每個樣本分別進行基因表達水平定量。使用DESeq2 (Loveet al,2014)對兩組樣品進行差異表達分析, 將Fold Change≥1.5 且FDR≤0.05 作為差異表達基因篩選標準[差異倍數(shù)(Fold Change)表示兩樣品(組)間表達量的比值;錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate, FDR)是使用Benjamini 和Hochberg 的方法通過對差異顯著性P值(P-value)進行校正得到的]。將差異表達基因注釋到KEGG (Kanehisaet al, 2008)數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/), 使用KOBAS (Maoet al, 2005)軟件來檢測KEGG 通路中差異表達基因的統(tǒng)計富集, 篩選出兩個樣本間FDR≤0.05 的顯著性差異通路。

1.5 實時熒光定量PCR 分析

本研究以EVM0015995_esyt-2為內(nèi)參基因, 隨機選擇11 個關(guān)鍵基因(表1)進行qPCR 驗證。使用ReverTra AceTMqPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒將RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA中加入SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑和正反向引物, 在QuantStudioTM6 Flex 熒光實時定量PCR 系統(tǒng)中檢測, 每個樣品設(shè)三個生物學重復(fù)。算出每個比較組合的ΔΔCt 后取平均, 2–ΔΔCt即為該基因在兩個比較組合之間的倍數(shù)變化。使用Graphpad 對qPCR 和RNAseq 數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析和T 檢驗, 得到兩組數(shù)據(jù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)和P值。

表1 qPCR 驗證基因的引物序列Tab.1 The primer sequences of genes verified by qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋線蟲L. marina 轉(zhuǎn)錄組分析

選取L.marina胚胎期(Embryo, EM)和L1 幼蟲2 h、4 h、6 h 四個階段, 每個階段設(shè)三個生物學重復(fù), 使用二代Illumina 技術(shù)對其進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過PCA主成分分析, 發(fā)現(xiàn)相同發(fā)育階段的生物學重復(fù)高度相關(guān), 不同發(fā)育階段能夠清晰區(qū)分(圖1)。

圖1 海洋線蟲L. marina 早期發(fā)育轉(zhuǎn)錄組主成分分析(PCA)Fig.1 Principal component analysis of marine nematode L.marina in early developmental stages

通過分析不同樣品間的差異表達基因數(shù)目, 發(fā)現(xiàn)L1 期2 h、4 h 和6 h 三個發(fā)育時期相較于EM, 均有超過9 000 個基因的表達發(fā)生了顯著變化, 而L1 2 h、4 h 和6 h 間的差異基因數(shù)目較少(表2)。通過KEGG通路富集分析, 發(fā)現(xiàn)L1 幼蟲2 h、4 h 和6 h 相較于EM 有超過30 個通路發(fā)生顯著上調(diào)(圖2), 而超過20個通路發(fā)生了顯著下調(diào)(圖3)。

圖2 海洋線蟲L. marina 各比較組合中上調(diào)基因的KEGG 富集情況Fig.2 KEGG enrichment of up-regulated genes in the marine nematode L. marina in each combination

圖3 海洋線蟲L. marina 各比較組合中下調(diào)基因的KEGG 富集情況Fig.3 KEGG enrichment of down-regulated genes in the marine nematode L. marina in each combination

表2 不同組間差異基因數(shù)目Tab.2 The number of differentially expressed genes between groups

2.2 相較于EM, L1 幼蟲核糖體和核糖體發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)

通過KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn), 與胚胎期相比, L1 發(fā)育時期2 h、4 h 和 6 h 的多個核糖體蛋白大亞基編碼基因(如EVM0009601_rpl-1和EVM0014298_rpl-3)和多個核糖體蛋白小亞基編碼基因(EVM0000892_rps-1和EVM0013684_rps-7等)的表達均發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4a), 核糖體發(fā)生通路中的52 個基因(如核仁蛋白EVM0010210_nol-6, Rio 激酶 EVM0005680_riok-1,核糖體RNA 加工蛋白質(zhì)EVM0015730_rrp-8)在L1幼蟲期發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4b), 氨?；?rRNA 生物合成通路中多個氨酰基-tRNA 合成酶(如丙氨?；鵷RNA合成酶EVM0006554_aars-2, 天冬氨酸氨?；鵷RNA合成酶EVM0015786_dars-1, 精氨酸氨?；鵷RNA 合成酶EVM0008023_rars-1)在L1 幼蟲期發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4c)。

圖4 核糖體相關(guān)通路基因表達變化情況Fig.4 Changes in gene expression of ribosomal related pathway

2.3 糖酵解/糖原異生、TCA 循環(huán)和氧化磷酸化通路中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著上調(diào)

通過KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn), 與胚胎期相比, 糖酵解和糖原異生通路中的多個基因(如醛脫氫酶EVM0001434_alh-4和二氫硫辛酰胺脫氫酶EVM0004862_dld-1)在L1 發(fā)生顯著上調(diào)(圖5a)。檸檬酸(TCA)循環(huán)通路中的多個基因(如順烏頭酸酶EVM0011486_aco-2、檸檬酸合成酶 EVM0011427_cts-1)在L1 期發(fā)生顯著上調(diào)(圖5b)。氧化磷酸化通路中的多個基因(如ATP 合成酶EVM0008198_atp-1、液泡型H+ATP 酶EVM0002567_vha-2)在L1 發(fā)生顯著上調(diào)(圖5c)。

2.4 多個神經(jīng)遞質(zhì)受體基因在L1 期轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)

通過KEGG 分析, 發(fā)現(xiàn)L1 期相較于EM, 超過100 個基因在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中上調(diào)(圖6)。EVM0000190_dop-1和 EVM0009467_dop-2等多個多巴胺受體相關(guān)基因在L1 期表達量上調(diào)(圖6a),GABA β 受體相關(guān)基因如 EVM0013292_gbb-2,EVM0015297_gbb-1和GABA 受體基因EVM0014833_gab-1( 圖 6b), 多個神經(jīng)肽受體家族基因如EVM0011355_npr-29和EVM0012055_npr-34等(圖6c),FMRFamide 肽受體家族基因EVM0006577_frpr-3、EVM0008649_frpr-14等也在L1 期表達量上調(diào)(圖6d)。

圖6 不同神經(jīng)遞質(zhì)的基因表達變化情況Fig.6 Changes in gene expression of different neurotransmitters

2.5 DNA 復(fù)制和修復(fù)相關(guān)通路基因的表達在L1 期顯著下調(diào)

通過KEGG 分析, 發(fā)現(xiàn)DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)通路在L1 期下調(diào)。DNA 復(fù)制通路中多個相關(guān)基因(如DNA 解旋酶/核酸內(nèi)切酶EVM0005762_dna-2、DNA 連接酶EVM0006442_pri-1)。錯配修復(fù)通路中多個相關(guān)基因(DNA 復(fù)制因子EVM0005944_rfc-1、復(fù)制蛋白 A EVM0007970_rpa-1)。堿基切除修復(fù)通路中多個相關(guān)基因(如DNA聚合酶EVM0014593_pole-1、無嘌呤/無嘧啶核糖內(nèi)切酶EVM0009978_apn-1)和核苷酸切除修復(fù)通路中多個相關(guān)基因(如復(fù)制蛋白A EVM0002773_rpa-2、DNA 復(fù)制因子EVM0013177_rfc-4)在L1 時期顯著下調(diào)(圖7)。

圖7 DNA 復(fù)制(a)、錯配修復(fù)(b)、堿基切除修復(fù)(c)和核苷酸切除(d)修復(fù)通路中相關(guān)基因表達變化情況Fig.7 Changes in expression of related genes in DNA replication (a), mismatch repair (b), base exicision repair (c) and nucleotide excision repair (d)

2.6 Notch、Hippo 和Hedgehog 等重要發(fā)育相關(guān)信號通路基因在L1 期顯著下調(diào)

Notch 信號通路中30 個基因(如EVM0011417_lag-1, EVM0004706_bir-1, EVM0008121_hda-1)的轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著下調(diào)(圖8a), Hippo 信號通路中10多個基因(如EVM0004098_yap-1, EVM0016569_zyx-1)的轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著下調(diào)(圖8b), Hedgehog 信號通路中10 個基因(如EVM0004427_ptc-3, EVM0015926_wrt-8)的轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著下調(diào)(圖8c)。

圖8 重要發(fā)育通路-Notch 信號通路(a)、Hippo 信號通路(b)和Hedgehog 信號通路(c)的相關(guān)基因表達變化情況Fig.8 Changes in gene expression of important developmental pathways-Notch signaling pathway (a), Hippo signaling pathway (b),and Hedgehog signaling pathway (c)

2.7 剪切體通路中多個剪切因子基因在L1 期顯著下調(diào)

剪切因子對于RNA 的加工至關(guān)重要(Mortonet al,2011)。本研究中, 多個剪切因子(如BCAS 剪切因子EVM0013266_bcas-2、DBI1 剪切因子EVM0005825_dib-1、RSP 蛋白EVM0003635_rsp-6、PRP 剪切因子EVM0016298_prp-6、剪切因子3B 亞基 EVM0010128_sftb-1和 EVM0009161_sftb-2、SLU7 剪 切 因 子EVM0000329_sluh-7在L1 期下調(diào)(圖9)。

圖9 剪切體相關(guān)基因表達變化情況Fig.9 Changes in expression of spliceosomal related genes

2.8 qPCR 驗證組學分析結(jié)果

本研究隨機選擇11 個基因進行qPCR 驗證, 得出倍數(shù)變化(圖10a)。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為衡量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qPCR 數(shù)據(jù)相關(guān)性的指標,r越接近1,相關(guān)性越好。通過Graphpad 分析, 得出轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和qPCR 的結(jié)果相關(guān)性r為0.961 6, 顯著性P值小于0.000 1 (圖10b), 結(jié)果顯示兩者相關(guān)性很高。

圖10 qPCR 驗證結(jié)果Fig.10 Verification results through qPCR analysis

3 討論

3.1 海洋線蟲L. marina L1 幼蟲發(fā)育需要更多的蛋白合成、能量供應(yīng)與代謝活力

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所, 與細胞生長和分裂密不可分(Fromont-Racineet al, 2003; Thomsonet al, 2013), 對秀麗線蟲全基因組RNAi 篩查發(fā)現(xiàn)核糖體編碼基因如rpl-4、rpl-35、rps-7、rps-13等基因的敲降會導(dǎo)致發(fā)育速率減慢(S?nnichsenet al, 2005)。研究發(fā)現(xiàn)RNAi 敲降rps-14導(dǎo)致秀麗線蟲生長緩慢和不育(Chanet al, 2009)。通過GFP 標記秀麗線蟲nog-1(編碼核仁GTP 酶)啟動子, 發(fā)現(xiàn)nog-1在胚胎早期到成蟲均有表達, 使用RNAi 抑制nog-1的功能導(dǎo)致秀麗線蟲孵化數(shù)減少、生長減慢、壽命增加和脂肪儲存增加(Kimet al, 2014)。秀麗線蟲riok-1編碼RIO 激酶,RNAi 抑制riok-1的功能會導(dǎo)致性腺形態(tài)異常, 從而使卵數(shù)量減少(Weinberget al, 2014)。通過EMS 化學誘變和核糖體圖譜分析, 發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲rrp-8(編碼核糖體RNA 加工蛋白)參與核糖體RNA 加工, 對于核糖體的生物發(fā)生具有重要作用(Wuet al, 2018)。氨?；?tRNA 生物合成通路中的氨?；?tRNA 合成酶催化氨基酸與其同源tRNA 的共價連接, 在翻譯過程中具有至關(guān)重要的作用(Rajendranet al, 2018)。rrt-1(rars-1)編碼精氨酰tRNA 合成酶, 通過RNAi 抑制其功能發(fā)現(xiàn),rrt-1對于秀麗線蟲的發(fā)育、運動速度、缺氧敏感性、壽命有至關(guān)重要的作用(Fr?hlichet al,2017)。本研究發(fā)現(xiàn)多個核糖體、核糖體發(fā)生和氨?；?tRNA 生物合成通路相關(guān)基因在L1 時期的表達相較于胚胎期發(fā)生了顯著上調(diào)(圖 4), 意味著在L.marina中, 相較于胚胎時期, L1 期的發(fā)育可能需要更多蛋白質(zhì)合成。據(jù)報道, 在秀麗線蟲中, 相較于胚胎時期, L1 期的多個核糖體編碼基因rpl-和rps-發(fā)生了顯著上調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al,2020), 這種變化模式與本研究海洋線蟲L.marina中發(fā)現(xiàn)的一致。然而在秀麗線蟲中, 相比于胚胎期, 核糖體發(fā)生通路多個基因在L1 期下調(diào), 氨酰基tRNA合成通路中的基因在秀麗線蟲EM 和L1 期之間變化不明顯(Grünet al, 2014), 總之, 我們發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲這兩個通路相關(guān)基因的表達變化特征和L.marina不同, 推測可能和兩種線蟲細胞發(fā)育過程存在的差異相關(guān)。

核糖體的生物發(fā)生是所有細胞中對能量要求最高的生命過程之一(Kressleret al, 2010; Thomsonet al,2013)。本研究中, L1 期相較于胚胎期, 糖酵解/糖原異生通路、TCA 循環(huán)通路和氧化磷酸化通路等與能量相關(guān)的通路中多個基因在L1 期顯著上調(diào)(圖5)。在糖酵解/糖原異生通路中,alh-4編碼醛脫氫酶, 通過正向遺傳篩選發(fā)現(xiàn)其缺失會增加脂肪醛, 減少脂肪的儲存(Zenget al, 2021)。RNAi 抑制秀麗線蟲中dld-1(編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶)的功能, 可改變能量代謝,激活與蛋白酶體降解相關(guān)的通路, 改善細胞間信號傳導(dǎo), 延長壽命(Ahmadet al, 2021)。TCA 循環(huán)中,cts-1編碼的檸檬酸合成酶是TCA 循環(huán)的起始酶和限速酶, RNAi 抑制秀麗線蟲中cts-1的功能, 會導(dǎo)致早期發(fā)育停滯(Hadaet al, 2019)。秀麗線蟲aco-2編碼烏頭酸酶,idha-1編碼異檸檬酸脫氫酶, RNAi 抑制兩者的功能會導(dǎo)致檸檬酸的積累, 并延遲秀麗線蟲的生長和發(fā)育(Yanget al, 2022)。氧化磷酸化通路中:vha-8和vha-19編碼液泡型H+ATP 酶,vha-8是PH 動態(tài)平衡和幼蟲發(fā)育所必需的,vha-19是胚胎發(fā)生所必需的,RNAi 抑制秀麗線蟲vha-8或vha-19的功能會致死(Jiet al, 2006; Knightet al, 2012)。因此, 我們推測在L1期, 這些與能量相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的增加, 為核糖體的生物合成提供了必要的能量, 同時也為L1 幼蟲的發(fā)育提供了充足的能量供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲從胚胎期發(fā)育到L1 期, 上述三個能量通路中的多個基因的表達均發(fā)生顯著上調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020)。因此, 我們推測L.marina早期發(fā)育的能量供應(yīng)機制與秀麗線蟲高度相似。

本研究通過KEGG 富集分析, 發(fā)現(xiàn)在L1 期, 17個代謝通路在L1 期顯著上調(diào), 相關(guān)的通路是碳代謝,嘌呤代謝, 花生四烯酸代謝, 亞油酸代謝, 淀粉和蔗糖代謝, 甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝, D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝, 谷胱甘肽代謝, 2-氧代羧酸代謝,甘油磷脂代謝代謝, 組氨酸代謝, 亞麻酸代謝, β-丙氨酸代謝, 丙酸酯代謝, 氮代謝(圖2)。4 個生物合成通路在L1 期顯著上調(diào), 相關(guān)的通路是氨基酸的生物合成, 精氨酸的生物合成, 葉酸的生物合成, 類固醇的生物合成(圖2)。與海洋線蟲相似, 這些通路中的大部分基因在秀麗線蟲L1 期表達量也顯著高于胚胎期(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020),據(jù)此推測L.marina早期發(fā)育的代謝調(diào)控機制與秀麗線蟲高度保守。

3.2 海洋線蟲L. marina L1 幼蟲神經(jīng)受體基因表達顯著上調(diào)

通過KEGG 富集分析, 發(fā)現(xiàn)L1 期相較于EM, 超過100 個基因在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中上調(diào), 大多是神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽受體, 可能與L1 幼蟲的覓食和運動等行為調(diào)控相關(guān)。多巴胺受體和GABA 受體在L1 表達量較胚胎期顯著上調(diào)(圖6a,6b)。多巴胺和谷氨酸-氨基丁酸(γ-aminobuyric acid,GABA)對于線蟲的基本運動功能至關(guān)重要(Jorgensen,2005; Omuraet al, 2012), 研究發(fā)現(xiàn)編碼多巴胺受體的dop-2在多巴胺能神經(jīng)元中表達, 可以調(diào)節(jié)多巴胺的合成和釋放(Suoet al, 2004), 多巴胺能神經(jīng)元在感覺到細菌食物時釋放多巴胺從而引發(fā)運動減慢反應(yīng)(Suoet al, 2004; Nagashimaet al, 2016)。研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體編碼基因dop-3缺失會導(dǎo)致秀麗線蟲運動缺陷(Chaseet al, 2004)。GABA 是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì), 在線蟲運動和覓食時, 起到放松身體肌肉的作用(Jorgensen, 2005)。研究發(fā)現(xiàn)通過 RNAi 抑制gbb-1(編碼代謝型GABAβ 受體)的功能增強抗氧化能力并延長秀麗線蟲壽命(Yuanet al, 2019)。

多個神經(jīng)肽受體家族基因在L1 期表達量顯著上升(圖6c, 6d)。在秀麗線蟲中, 目前已鑒定出113 個神經(jīng)肽基因, 對于感覺和運動至關(guān)重要(Liet al, 2008)。比如, 通過RNAi 敲降實驗發(fā)現(xiàn), 秀麗線蟲運動和感覺喚醒需要frpr-3(編碼FMRFamide 肽受體) (Chewet al, 2018)。在食物充足的情況下,npr-1(編碼神經(jīng)肽受體)可以導(dǎo)致秀麗線蟲在進食過程中聚集, 并在細菌邊緣聚集(Liet al, 2008)。因此, 隨著線蟲孵化后開始運動, 這些神經(jīng)遞質(zhì)表達量顯著升高。除此之外, 速激肽受體家族TKR, 膽囊收縮素受體CKR, 神經(jīng)調(diào)節(jié)肽NMUR, NMDA 類谷氨酸受體NMR, 代謝型谷氨酸受體家族MGL 等神經(jīng)遞質(zhì)在L1 期表達量較EM均發(fā)生顯著上調(diào)。在秀麗線蟲中, 相比于胚胎期, 多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽受體基因也均在L1 期轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al,2020)。據(jù)此推測, 海洋線蟲和秀麗線蟲在L1 幼蟲發(fā)育階段神經(jīng)受體調(diào)控方面可能具有類似的機制。

3.3 海洋線蟲L. marina 胚胎期復(fù)制與修復(fù)和細胞分化調(diào)控相關(guān)基因表達顯著上調(diào)

DNA 復(fù)制是細胞分裂周期的一個重要方面, 發(fā)生在細胞周期的合成階段(S 期), 準確無誤的DNA 復(fù)制對于保持基因組的完整性必不可少(Bellet al, 2002;Ariaset al, 2007)。在海洋線蟲中DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)通路中的多個基因, 與胚胎期相比, 在L1 幼蟲期顯著下調(diào)(圖7)。研究發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲RPA 蛋白(編碼復(fù)制蛋白A)參與有絲分裂復(fù)制、減數(shù)分裂、同源重組和修復(fù)等多個過程,對于DNA 復(fù)制過程至關(guān)重要, CRISPR/Cas9 敲除rpa-1會導(dǎo)致秀麗線蟲早期幼蟲致死(Hefelet al,2021)。在酵母和哺乳動物中, RFC 蛋白(編碼DNA 復(fù)制因子)參與將某些DNA 聚合酶加工因子加載到單鏈DNA 上, 調(diào)控DNA 復(fù)制過程(Venclovaset al, 2000;Griffithet al, 2002; Bermudezet al, 2003)。秀麗線蟲中,6 個mcm-基因(mcm-2、mcm-3、mcm-4、mcm-5、mcm-6和mcm-7)編碼的6 個MCM 蛋白(微小染色體維持蛋白)形成六聚體復(fù)合體, 作為DNA 復(fù)制前起始復(fù)合體的關(guān)鍵組分, 在DNA 復(fù)制中起到DNA 解旋酶的作用(Korzeliuset al, 2011)。RNAi 抑制秀麗線蟲dna-2的功能會降低胚胎發(fā)育速率、縮短壽命, 其編碼的DNA解旋酶/核酸內(nèi)切酶可以維持基因組的穩(wěn)定性, 在細胞分裂和DNA 復(fù)制中都具有非常重要的作用(Leeet al, 2011)。秀麗線蟲div-1、pola-1、pri-1和pri-2編碼的DNA 聚合酶α-引發(fā)酶復(fù)合物啟動增殖細胞的DNA 復(fù)制, RNAi 抑制這些基因的功能會使得胚胎致死率升高, 此外, 增殖細胞命運的維持需要pola-1、pri-1、pri-2(Yoonet al, 2018)。我們推測, 與之相關(guān)基因在胚胎期的高表達可能反映了胚胎期較高的DNA 復(fù)制率和細胞分裂, 因此, 相較于L1, 胚胎期細胞分裂速度可能更快, 從而需要復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因的高表達。這些基因在秀麗線蟲中, 相較于胚胎期, 其轉(zhuǎn)錄水平在L1 期也均顯著下降(Rünet al, 2014;Boecket al, 2016; Liet al, 2020), 因此L.marina和秀麗線蟲類似, 胚胎時期復(fù)制和修復(fù)等多個通路基因表達顯著上調(diào)可能用以支持快速、精準的細胞分裂和增殖。

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)海洋線蟲在L1 期, Notch、Hippo 和Hedgehog 信號通路中多個基因, 與胚胎期相比, 在L1 期轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。lag-1編碼Notch信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子LAG-1, 在發(fā)育過程中介導(dǎo)細胞間的相互作用, RNAi 敲降lag-1會導(dǎo)致孵化后的L1 秀麗線蟲發(fā)育停滯(Maicaset al, 2021)。Hippo信號通路中,yap-1(編碼Yes 相關(guān)蛋白)參與秀麗線蟲Wnt 介導(dǎo)的神經(jīng)元極化(Leeet al, 2018), 也與秀麗線蟲的耐熱性和衰老有關(guān)(Iwasaet al, 2013)。通過秀麗線蟲EMS 誘變發(fā)現(xiàn),zyx-1(編碼含LIM 結(jié)構(gòu)域的黏著斑蛋白)調(diào)節(jié)秀麗線蟲突觸維持(Luoet al, 2014)。Hedgehog 信號通路中,ptc-3(編碼PTC 蛋白)在秀麗線蟲中的表達是高度動態(tài)的, 通過RNAi 抑制秀麗線蟲ptc-3基因的功能會導(dǎo)致致死、不完全蛻皮、體型縮小、vulva 發(fā)育缺陷等(Solovievet al, 2011)。秀麗線蟲wrt-8(編碼Hedgehog 相關(guān)蛋白)的過度表達會導(dǎo)致軸突缺陷(Riveiroet al, 2017)。三個通路中在秀麗線蟲中的大多數(shù)同源基因, 相較于胚胎期, L1 期的轉(zhuǎn)錄表達也均發(fā)生了顯著下調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020)。因此, 我們推測海洋線蟲和秀麗線蟲在胚胎期均需要更高的發(fā)育和細胞分化調(diào)控因子表達水平。

KEGG 富集分析表明, 相比于胚胎期, 海洋線蟲在L1 期多個剪切體通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。剪切因子對于RNA 的加工過程至關(guān)重要(Mortonet al, 2011)。研究表明prp-40調(diào)控秀麗線蟲可變剪切,其編碼的PRP-40 mRNA 前體加工因子是剪接體的重要組成之一(Choudharyet al, 2021)。通過RNAi 抑制prp-8的功能導(dǎo)致秀麗線蟲剪切異常, 其對于維持整個胚胎發(fā)生過程中的細胞分裂周期調(diào)控起重要作用(Hebeisenet al, 2008)。sftb-1編碼剪切因子3B 亞基,mCherry 標記秀麗線蟲sftb-1發(fā)現(xiàn)其是一種普遍表達的發(fā)育必需基因(Serratet al, 2019)。在秀麗線蟲中,這些剪切因子的基因L1 期表達量也均低于胚胎期(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020)。最近報道發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲胚胎轉(zhuǎn)錄本的平均長度比胚胎后幼蟲階段的較長(Liet al, 2020), 因此推測海洋線蟲與秀麗線蟲在胚胎發(fā)育的過程中, 需要更高的剪切因子相關(guān)基因表達, 可能與胚胎期較長的轉(zhuǎn)錄本特征維持和細胞的快速分裂和分化等相關(guān)。

4 結(jié)論

我們的研究結(jié)果表明, 與胚胎期相比, 孵化后早期L.marinaL1 幼蟲的多個通路如核糖體、核糖體生物發(fā)生、糖酵解/糖原異生、TCA 循環(huán)和氧化磷酸化通路相關(guān)基因發(fā)生了顯著上調(diào); 多個神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽受體基因如dop-、npr-和frpr-等在L1 期轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)。與胚胎期相比, L1 幼蟲DNA 復(fù)制和修復(fù)相關(guān)、Notch、Hippo 和Hedgehog 信號通路和剪切體調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生了顯著下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)的海洋線蟲早期發(fā)育轉(zhuǎn)錄組變化模式與陸生模式生物秀麗線蟲高度相似, 但同一上調(diào)或下調(diào)通路中具體發(fā)生表達變化的基因有些不同。另外,L.marinaL1 幼蟲顯著上調(diào)的核糖體生物發(fā)生通路相關(guān)基因在秀麗線蟲中發(fā)生了顯著下調(diào)。因此,L.marina與秀麗線蟲早期發(fā)育的表達調(diào)控機制高度保守, 秀麗線蟲豐富的生物信息學和突變體庫等資源和成熟的分子生物學和遺傳學等研究手段將極大地輔助海洋線蟲的基礎(chǔ)生物學研究, 并推動模式海洋線蟲體系和平臺構(gòu)建。結(jié)合秀麗線蟲成熟的研究方法, 在L.marina中進一步優(yōu)化基因編輯等遺傳操作將會為海-陸近緣線蟲間的發(fā)育進化機制, 海洋線蟲對潮間帶環(huán)境適應(yīng)以及海洋動物如何應(yīng)答和適應(yīng)全球氣候變化的分子機制研究提供新認知, 也可為蛻皮類經(jīng)濟物種如蝦蟹的遺傳育種與產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供重要理論和技術(shù)支持。