朱雅婷 張明清 吳妤莘 趙會宏 張海發(fā) 舒 琥①

(1. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510006; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院 廣東廣州 510642; 3. 廣東省海洋漁業(yè)試驗中心廣東惠州 516081)

赤點石斑魚(Epinephelus akaara)隸屬鱸形目、鱸亞目、 鮨科, 分布于北太平洋西部, 我國產(chǎn)于南海和東海南部。作為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 其具有病害少、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等特點, 深受消費者的喜愛。由于過度捕撈, 自2003 年以來, 赤點石斑魚已被國際自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature)列為瀕危物種(Ahnet al, 2018)。為滿足廣大消費者需求, 大規(guī)模人工繁育赤點石斑魚顯得尤為重要。赤點石斑魚是一種雌雄同體且雌性先熟的海洋魚類。在自然條件下, 大多數(shù)個體在2～3 齡時成熟為雌性, 然后在5～6 齡時反轉(zhuǎn)為雄性(Heet al, 2011)。在正常養(yǎng)殖條件下, 雌魚會在養(yǎng)殖初期占據(jù)親魚的主導(dǎo)地位, 這不可避免地導(dǎo)致成熟雄魚稀缺(Heet al,2011)和精液質(zhì)量差(Mylonaset al, 2017)等問題, 嚴(yán)重影響繁育和生產(chǎn), 使赤點石斑魚的人工養(yǎng)殖受到極大的限制(Leeet al, 2020)。因此, 對其精子生物學(xué)開展相關(guān)研究很有必要。

魚類大多數(shù)為體外受精, 配子的質(zhì)量及受精時的環(huán)境會影響魚類的受精效果。精子質(zhì)量可以被定義為精子利用其游動能力達(dá)到卵母細(xì)胞并使其受精的能力(Fauvelet al, 2010)。據(jù)報道, 精子的超微結(jié)構(gòu)可被視為判斷精子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一(Kestemontet al,2015)。同時, 受精環(huán)境也會極大影響精子活力, 相關(guān)研究表明, 魚類精子活力與多種環(huán)境因素有關(guān)。Alavi等(2005)發(fā)現(xiàn)激活介質(zhì)的溫度和pH 會影響精子的運動時間、受精能力和速度。Griffin 等(1998)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度高于或低于最適鹽度 16 時, 太平洋鯡魚(Clupea pallasi)游動精子的數(shù)量逐步減少。Mylonas等(2003, 2017)闡述了激素和季節(jié)變化對精子活力的影響。由此可見, 魚類精子活力與溫度、pH、鹽度、離子濃度、激素及季節(jié)變化等因素有關(guān), 這是魚類精子生理與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果(潘德博等, 2002; 劉鑒毅等, 2014; 鄭學(xué)斌等, 2018)。因此, 研究不同的環(huán)境因子對赤點石斑魚精子活力的影響, 對提高精子受精率、增強(qiáng)人工繁育及增殖能力具有重要意義。目前,赤點石斑魚尚未見相關(guān)方面的報道。

本文對赤點石斑魚精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察分析, 探討了環(huán)境因子(溫度、鹽度、pH 及不同離子濃度等)對其精子活力的影響, 并探究其相關(guān)影響機(jī)制,旨在為赤點石斑魚規(guī)?；斯し庇峁┗A(chǔ)資料和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 親魚來源

實驗用赤點石斑魚(Epinephelus akaara)采自廣東省大亞灣海洋漁業(yè)試驗中心養(yǎng)殖網(wǎng)箱, 選用繁殖季節(jié)健康且發(fā)育良好的雄性親魚10 尾(全長35.2～41.0 cm, 體質(zhì)量770～1 060 g)。

1.2 精子采集與觀察

1.2.1 精子采集 用潔凈的干毛巾擦干魚體生殖孔及周圍的水分, 沿腹鰭向臀鰭方向擠壓腹部, 擠出精巢內(nèi)的精液, 用滅菌的滴管吸取精液, 放入取樣管中并立即進(jìn)行精子活力觀察。采集的精液為乳白色,干凈且無尿液、糞便及體表水分污染。

1.2.2 超薄切片標(biāo)本的制備 取收集的精液加入等量2.5%的戊二醛溶液(pH 7.4), 雙層紗布過濾, 制成精子懸液, 3 500 r/min 離心5 min, 去上清液, 加適量2.5%的戊二醛溶液(pH 7.4)于4 °C 固定。然后, 樣品經(jīng)磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗、1%的鋨酸后固定, 各級乙醇脫水, Epon812 樹脂包埋, 切片后使用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色, 在TECNAI 12 透射電鏡觀察、測量并拍照。

1.2.3 掃描電鏡標(biāo)本的制備 精子樣品用2.5%的戊二醛和1%的鋨酸雙重固定, 各級乙醇脫水, 入丙酮、醋酸異戊酯, 臨界點干燥儀干燥, 鍍金后, 使用FEI-XL30 環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察、測量并拍照。

1.3 精子活力觀察

將天然海水過濾后滅菌, 使用海水晶(鹽通, 江蘇)和ddH2O 調(diào)節(jié)過濾海水的鹽度, 設(shè)置10、15、20、25、30、33、40 共7 個鹽度梯度, 其中大亞灣海區(qū)天然海水鹽度為33。用0.1 mol/L 的NaOH 和HCl 溶液調(diào)節(jié)過濾海水的pH 值, 設(shè)置6.5、7、7.5、8.1、8.5、9、9.5 共7 個pH 梯度, 天然海水pH 值為8.5。取適量過濾海水于燒杯中, 置于恒溫箱中, 設(shè)置4 個溫度梯度(23、27、31、34 °C)。使用去離子水配制不同濃度的NaCl、KCl、EDTANa2、CaCl2、MgCl2溶液, 本研究所用NaCl、KCl、EDTANa2、CaCl2、MgCl2均為分析純。

精子活力觀察方法參照文獻(xiàn)(趙會宏等, 2003)并加以改進(jìn), 觀察具體方法如下: 在凹面載玻片上滴加適量的無菌過濾海水, 然后用微量進(jìn)樣器取等量的精液與載玻片上的海水混勻, 同時計時。觀察精子活力的方法和指標(biāo)為: (1) 快速運動時間, 精子自激活開始到約90%原處顛動前的激烈運動; (2) 壽命, 精子自激活開始到約90%停止顛動。每個處理重復(fù)3次, 結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理均使用統(tǒng)計軟件SPSS 26.0 進(jìn)行,所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 赤點石斑魚精子的超微結(jié)構(gòu)

2.1.1 掃描電鏡下精子的形態(tài) 在掃描電鏡下,赤點石斑魚精子由頭部、頸部(中段)和尾部(鞭毛)三部分組成?？汕逦^察到精子頭部呈圓形, 表面光滑, 無頂體, 頭長1.65～2.02 μm, 直徑約為(1.8±0.095) μm,頸部(中段)寬(0.94±0.35) μm, 長為(0.73±0.26) μm,尾部(鞭毛)自頭部后端的正中部向后伸出, 細(xì)且長,約為(30.16±2.49) μm (圖1: 10～12)。

2.1.2 透射電鏡下精子內(nèi)部結(jié)構(gòu) 透射電鏡下,赤點石斑魚精子頭部在不同切面呈圓形或卵圓形,直徑為1.65～2.05 μm, 頭部幾乎全部由細(xì)胞核組成,細(xì)胞質(zhì)相對較少(圖1: 1～3)。細(xì)胞核圓形, 核膜雙層,核質(zhì)由電子染色深的顆粒組成, 呈現(xiàn)出較大的電子密度。精子頭部有質(zhì)膜, 細(xì)胞質(zhì)包裹在核外周, 有波浪形的皺褶, 頭部未見頂體或類似頂體的結(jié)構(gòu)(圖1:2, 3, 9)。袖套位于核后端、呈筒狀, 圍繞軸絲形成的空腔稱為袖套腔; 袖套兩側(cè)不對稱, 分布著大小、數(shù)量不等的線粒體和囊泡(圖1: 4～7)。線粒體排列也不對稱, 袖套的縱、橫切面均可見到2～4 個線粒體。頭部細(xì)胞核后端有一較淺的凹痕稱為植入窩(圖1: 2, 3)。

尾部細(xì)長。起始部分位于袖套腔中(圖1: 1, 8), 大部分伸出袖套腔外。尾部的核心結(jié)構(gòu)為軸絲。尾部起始端由細(xì)胞質(zhì)、線粒體和軸絲前段構(gòu)成。中心粒復(fù)合體包括近端中心粒和基體兩部分, 位于植入窩內(nèi)(圖1: 4)。由基體與軸絲相連發(fā)出“9+2”微管結(jié)構(gòu)(圖1: 6),即9 組外周二聯(lián)微管及1對中央微管對。整個尾部的結(jié)構(gòu)一致, 無主段末段之分。

圖1 赤點石斑魚精子的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 The ultrastructure images of E. akaara spermatozoon

2.2 赤點石斑魚精子活力觀察

2.2.1溫度對精子活力的影響 水溫對赤點石斑魚的精子活力影響見圖2。精子活力從23 °C 開始緩慢升高, 到27.5 °C 升至最高值, 此時精子的快速運動時間和壽命分別為27 min 和37 min, 之后開始下降。精子的快速運動時間在23～27.5 °C 變化不大, 在27.5 °C 達(dá)到最高值后快速下降。精子活力在23～31 °C范圍內(nèi)較好。

圖2 赤點石斑魚精子活力與水溫的關(guān)系Fig.2 The impact of water temperature on the motility duration and lifetime of E. akaara spermatozoa

2.2.2鹽度對精子活力的影響 由圖3 所示, 鹽度為10 時精子無活力, 之后隨著鹽度升高精子活力快速上升, 在鹽度為15 時達(dá)最高值, 此時精子的快速運動時間和壽命分別為43 min 和50 min。之后, 伴隨鹽度升高, 精子活力開始下降, 但在鹽度為30 時又開始升高, 并于鹽度為33 時達(dá)到一新的峰值, 此時精子的快速運動時間和壽命分別為20 min 和35 min。隨后, 精子活力伴隨鹽度的升高而下降, 在鹽度為35以后快速下降。

圖3 鹽度與赤點石斑魚精子活力的關(guān)系Fig.3 The impact of water salinity on the motility duration and lifespan of E. akaara spermatozoa

2.2.3pH 值對精子活力的影響 由圖4 可見, 在不同的pH 值下赤點石斑魚精子的快速運動時間和壽命的變化不大; 從pH 8.1 開始, 該魚精子運動的壽命逐漸延長, 到pH 9 時精子的壽命達(dá)到最高值33 min,此后精子壽命迅速下降; 而精子的快速運動時間則在pH 8.1 時就達(dá)到最高值26 min, 此后便緩慢下降。

圖4 pH 值與赤點石斑魚精子活力的關(guān)系Fig.4 The impact of water pH value on the motility duration and lifespan of E. akaara spermatozoa

2.3 不同濃度離子溶液對赤點石斑魚精子運動能力的影響

由表1 可知, 赤點石斑魚精子在400～700 mmol/L的NaCl 溶液和400～600 mmol/L KCl 溶液中均具有較好的活動能力, 在EDTANa2溶液中精子呈抑制狀態(tài),在500 mmol/L 的CaCl2溶液中精子活動能力亦佳。在MgCl2溶液中, 精子活力表現(xiàn)不佳。

表1 不同濃度的NaCl、KCl、EDTANa2、CaCl2、MgCl2 溶液對赤點石斑魚精子運動能力影響Tab.1 Effect of different solutions and concentrations on the motility of E. akaara spermatozoa

3 討論

3.1 赤點石斑魚精子細(xì)胞核的超微結(jié)構(gòu)

赤點石斑魚精子頭部濃縮的細(xì)胞核具有較高的電子密度, 非常致密, 細(xì)胞核中核質(zhì)部分高度凝聚,沒有空隙(即核泡)存在(圖1: 1, 2), 其他一些魚類精子頭部的細(xì)胞核中亦有相似之處(魏剛等, 1995; 胡謀等, 2014)。此外, 赤點石斑魚精子的核膜緊貼于質(zhì)膜,與鯉魚(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、七帶石斑魚(E. septemfasciatus) (廖光勇等,2011)、興國紅鯉(C. carpiovar.singguoensis) (林光華等, 1998)類似, 但與某些硬骨魚類的精子不同。管汀鷺等(1990)發(fā)現(xiàn)金魚(Carassius auratus auratus)精子核膜與質(zhì)膜之間有液泡存在, Liu 等(2015)在大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus)中也有類似報道。此外,在斜帶石斑魚(E. coioides) (趙會宏等, 2003)、日本鰻鱺(Anguilla japonica) (張濤等, 2010)中觀察到精子核膜與質(zhì)膜存在較大間隙的現(xiàn)象。林光華等(1998)對革胡子鲇(Clarias gariepinus)精細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 其頭部核后端具有較為豐富的細(xì)胞質(zhì)。但硬骨魚精子頭部核膜與質(zhì)膜間空間的大小及所含細(xì)胞質(zhì)的多少對精子活力究竟有何影響, 對受精過程有何生理意義,目前尚不清楚, 需進(jìn)一步研究。

3.2 赤點石斑魚精子近端中心粒

赤點石斑魚精子植入窩不在核正中, 而是偏向一側(cè), 中心粒復(fù)合體不在細(xì)胞核的主軸上, 也偏向核的一側(cè), 近端中心粒和基體不呈常見的“T”字形排列,而是有一定的角度, 與鯽魚(C. auratus)相似。通常硬骨魚精子的植入窩多位于細(xì)胞核后端, 但也有位于核的一側(cè)。如鯉魚精子的植入窩就位于核的一側(cè)(尤永隆等, 1996), 同赤點石斑魚精子類似。但鯉魚的近端中心粒和基體垂直, 呈“T”字形排列。而赤點石斑魚精子的近端中心粒和基體的排列形式與鯽魚、紅鰭東方 鲀(Takifugu rubripes) (張筱蘭等, 1999)類似, 與大黃魚(Larimichthys crocea) (尤永隆等, 1997)不同,它的中心粒復(fù)合體的走向與細(xì)胞核長軸平行。Madhavi 等(2015)也曾指出: 中心粒復(fù)合體的相對位置具有種間特異性, 從平行狀態(tài)到垂直狀態(tài)均有出現(xiàn), 差異較大。

3.3 赤點石斑魚精子尾部結(jié)構(gòu)

赤點石斑魚精子尾部軸絲為典型的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖1: 6), 與真鯛(Pagrus major) (Liuet al, 2007)、大西洋牙鲆(Liuet al, 2015) 、 鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)、云紋石斑魚(E. moara)、 鯉魚、長吻鮠(Leiocassis longirostris)等魚類相同。此外, 赤點石斑魚精子尾部的軸絲起始段無中央微管對結(jié)構(gòu), 這與大黃魚、紅鰭東方 鲀相似; 軸絲具有極少量的外周囊泡, 軸絲之外無其他明顯結(jié)構(gòu), 缺少某些硬骨魚會出現(xiàn)的結(jié)構(gòu), 如白梭吻鱸(Sander lucioperca)精子尾部的側(cè)鰭(lateral fin) (k?i??anet al, 2014)、大黃魚精子尾部的簍狀結(jié)構(gòu)(basket-like structure)等。

3.4 赤點石斑魚精子活力

3.4.1 溫度、鹽度和pH 值對赤點石斑魚精子活力的影響 Lahnsteiner 等(2012)發(fā)現(xiàn)精子的供能酶和鞭毛運動與溫度密切相關(guān), 過低和過高的溫度都會影響精子的活力。研究表明溫度與精子快速運動時間的關(guān)系是一個開口向下的二次曲線函數(shù)關(guān)系(Van Deurset al, 1973)。本研究中, 在23～34 °C 范圍內(nèi), 赤點石斑魚精子的活力先逐步升高, 到臨界溫度時再下降,說明其精子活力的適宜溫度范圍是23～31 °C, 最適溫度為 27.5 °C, 這與繁殖季節(jié)的最適水溫范圍(24～28 °C)相符合。

鹽度對魚類精子的影響主要與滲透壓和離子濃度的變化相關(guān)聯(lián)。研究表明, 魚類精漿的適宜滲透壓為656.8～838 kPa。因魚類大多數(shù)為體外受精, 精子在性腺或精液中通常不運動(Cossonet al, 2008), 而是在釋放到水生環(huán)境中后開始運動, 由性腺和水生環(huán)境之間的物理(滲透壓)或化學(xué)(離子組成、pH)差異觸發(fā)(Byrneet al, 2015)。涉及精子活動激活的機(jī)制在物種之間差異很大(Herreraet al, 2021)。例如, 在海洋硬骨魚類中, 精子活力因暴露于高鹽受精環(huán)境相關(guān)的高滲溶液而被激活(Tierschet al, 2012)。相比之下, 在淡水魚類中, 精子活力因暴露于淡水受精環(huán)境相關(guān)的低滲溶液而被激活(Alaviet al, 2006)。從魚類精子的適鹽性與環(huán)境鹽度的關(guān)系來看, 精子所需的適鹽范圍與該物種繁殖季節(jié)的鹽度密切相關(guān)。從本試驗結(jié)果來看, 赤點石斑魚精子的適宜鹽度范圍較廣, 在15～35 之間, 能很好地適應(yīng)大亞灣海區(qū)赤點石斑親魚產(chǎn)卵階段的鹽度(28～34.8)。由于赤點石斑魚的卵屬于浮性卵, 即正常鹽度的海水能夠起到篩選卵子的作用, 而精子活力也只是在這一較窄范圍內(nèi)活力最高,這也反映了它對環(huán)境的適應(yīng)。此外, 赤點石斑魚精子對pH 值的變化適應(yīng)性較強(qiáng), 這與大多數(shù)海水魚類相似(區(qū)又君等, 2011)。

3.4.2離子濃度對赤點石斑魚精子活力的影響

離子濃度是影響精子活力的重要因素。魚類精漿中一般富含K+、Na+、Ca2+和Mg2+等, 因此精子激活的直接動力被認(rèn)為源于精漿與海水中這些離子含量的差異(嚴(yán)安生等, 1993)。適宜的Na+、K+濃度, 是保持魚類精子活力的重要條件。Na+對魚類精子活力的影響已被許多研究所證實。薩羅羅非魚(Sarotherodon melanotheron)在NaCl 濃度為30 時精子快速運動時間最長(羅明坤等, 2014); 鯉、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)在5 的NaCl 溶液中快速運動及壽命最長(嚴(yán)安生等, 1993); 寬體沙鰍(Sinibotia reevesae)精子活力在4 時達(dá)到最高(王永明等, 2016); 點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)在15 的NaCl 溶液中壽命最長(王小剛等, 2013)。在本試驗中, 赤點石斑魚精子在400～700 mmol/L 的NaCl 溶液中, 活動精子可達(dá)90%以上。NaCl 濃度在 200 mmol/L 以下及 900 mmol/L 以上不能激活赤點石斑魚精子。

赤點石斑魚精子在400～600 mmol/L 的KCl 溶液中活動能力較佳, 變化趨勢與精子在NaCl 溶液中相似。薩羅羅非魚在K+濃度為0.5%時精子活力最強(qiáng),壽命也最長。寬體沙鰍在0.4%的KCl 時精子活力最強(qiáng), 存活時間也最長。此外, Morisawa 等(1983)發(fā)現(xiàn),K+的存在增加了鯉科魚類精子的游動速度。Lahnsteiner(2014)也發(fā)現(xiàn), 0.25 mmol/L 濃度的K+使河鱸(Perca fluviatilis)精子的游動速度增加。但同時,Billard 等(1987)與Cosson 等(1989)發(fā)現(xiàn)20～40 mmol/L的K+濃度完全抑制了虹鱒魚精子的活力。Dumorné等(2018)報道K+對鮭魚精子的運動性具有抑制作用。嚴(yán)安生等(1993)對鯉、團(tuán)頭魴等鯉科魚類的研究表明,K+對精子的影響表現(xiàn)與Na+相似, 并且相同滲透壓的K+具有延長精子壽命的作用。本研究也可得出類似的結(jié)果, K+對赤點石斑魚精子活力的影響與Na+類似,但同樣在800～1 000 mmol/L 的高離子濃度下, 精子在K+環(huán)境中的活動能力強(qiáng)于Na+。

Ca2+、Mg2+離子是精漿中的重要組成成分, 但它們對精子的作用與Na+、K+離子不同。Morisawa 等(1983)發(fā)現(xiàn), 0～16 mmol/L 的Ca2+或Mg2+溶液不影響大馬哈魚精子的運動時間。赤點石斑魚精子僅在500 mmol/L 的CaCl2溶液中精子活力較佳, 高于或低于此濃度, 精子活力明顯下降, 產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。在MgCl2溶液中, 精子活力均受到抑制?？赡苁怯捎谕庠葱缘腃a2+、Mg2+離子引起精子內(nèi)部的滲透壓或內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化從而導(dǎo)致活力下降, 該結(jié)果與金屬離子對中華倒刺 鲃(Spinibarbus sinensis) (張春霖等,1999)及中華鱘精子的研究結(jié)果一致。

EDTANa2為二價金屬離子的螯合劑, 它們對赤點石斑魚精子的抑制作用可能是由于其螯合了Ca2+、Mg2+引起的, 這與鰻鱺(Anguilla japonica)、牙鲆(P.olivaceus) (王宏田等, 1999)的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

赤點石斑魚成熟精子的結(jié)構(gòu)特點是細(xì)胞核圓形或卵圓形, 核內(nèi)染色質(zhì)致密, 核膜緊貼于質(zhì)膜, 沒有核泡(核空隙)。精子植入窩和中心粒復(fù)合體偏向核的一側(cè), 尾部細(xì)長, 橫切面為典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)。精子的最適溫度范圍與繁殖季節(jié)的最適水溫范圍符合,適宜鹽度范圍較廣, 對pH 值的變化適應(yīng)性較強(qiáng), 符合海水魚類的特性。精子在NaCl、KCl、CaCl2溶液中活動能力較強(qiáng), 在MgCl2溶液和EDTANa2溶液中呈抑制狀態(tài)。