呂蕊花，陳 萌，趙 倩，馮 昭，史琳娜，張喜榮

（陜西中醫(yī)藥大學 醫(yī)學技術學院，陜西 咸陽 712046）

核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）菌核是菌絲在生長中遇到有限的營養(yǎng)環(huán)境，進行復雜的生理結合相互纏繞形成的堅硬結構，菌核在核盤菌侵染循環(huán)中起核心作用，可萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子作為侵染源可以通過氣流傳播到寄主的根、莖、葉等器官而引起發(fā)病。植物一旦感染菌核病將很難得到控制，發(fā)病率也會逐年升高，甚至絕收，嚴重影響現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展[1]。因此，揭示核盤菌菌核形成機制，對于防控該病害的發(fā)生以及靶向殺菌劑的開發(fā)具有重要的理論和實踐意義。

核盤菌菌核形成同時受外界環(huán)境條件的誘導和內部信號分子的調節(jié)。光照、pH 值、碳源、活性氧、生物群落等因素[2?3]通過調節(jié)細胞內信號轉導途徑來調控菌核的生長發(fā)育過程，核盤菌菌核發(fā)育主要受環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶（Cyclic adenosine monophosphate?dependent protein kinase A，cAMPPKA）信號通路調控。1998 年，ROLLINS 等[4]以菜豆中分離出來的S.sclerotiorum為研究對象，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基 中 腺 苷-3′，5′-環(huán) 磷 酸（Adenosine 3′，5′cyclic monophosphate，cAMP）添加量為5 mmol/L 便可抑制菌核的形成；同樣地，在不能形成菌核的灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）突變菌株中，cAMP 含量也明顯上升[5?6]，表明cAMP 是抑制菌核形成的一個重要因素。磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDEs）作為細胞內水解cAMP 的酶類，與絲狀真菌的很多生命活動密切相關[7?8]。柑橘褐斑病菌（Alternaria alternatatangerine pathotype）的低親和性磷酸二酯酶基因（Low?affinity cAMP phosphodiesterase，Pdel）缺失會使病原菌分生孢子的產(chǎn)孢量以及黑色素沉著減少，并且Pdel在胞內cAMP水平的調控中發(fā)揮著重要作用[9]。黃曲霉（Aspergillus flavus）PDEs 缺失突變株（ΔpdeH）產(chǎn)生的分生孢子和菌核數(shù)目均明顯減少[10]。阿托品（Atropine）作為毒蕈堿受體抑制劑，可以抑制PDEs 水解cAMP，從而增加細胞內cAMP水平[11]。

PDEs是一個多基因大家族，其成員在不同真菌中的功能不盡相同，PDEs 家族具體如何調控cAMP水平而影響核盤菌菌核形成，目前尚未見報道。鑒于此，分析PDEs 在cAMP-PKA 途徑中對核盤菌菌核生長發(fā)育的調控過程，明確該通路系統(tǒng)調控菌核形成的機制，為核盤菌靶向殺菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

菌株：核盤菌（菌株編號：CCTCC AF 2021085Sclerotinia sclerotiorumSs10715）前期分離自油菜秸稈并保存于陜西中醫(yī)藥大學生物技術教學實驗中心。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，由去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉12 g、蒸餾水1 000 mL制成。

試劑：PCR 擴增、檢測及產(chǎn)物克隆所用試劑盒均購自TaKaRa 公司，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自OMEGA 公司，瓊脂糖、核酸Marker、預染EB 均購自生工生物工程（上海）有限公司，RNA 提取試劑盒、反轉錄及定量PCR 所用試劑盒均購自TaKaRa公司，cAMP、阿托品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器：定量PCR 儀器購自Applied Biosystems 公司，光學顯微鏡購自日本Olympus 公司，雙壓電泳儀和電泳槽購自北京君意公司。

1.2 PDEs對核盤菌生長發(fā)育的影響檢測

配制PDA 培養(yǎng)基并分裝，高壓滅菌后于無菌條件下分別加入cAMP和阿托品至終濃度為2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L 和8 mmol/L，將核盤菌菌絲塊接種于含不同濃度cAMP 和阿托品的培養(yǎng)基上，每個濃度重復5 次，于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不添加cAMP和阿托品的PDA培養(yǎng)基上接種的核盤菌菌絲作為對照（CK），統(tǒng)計核盤菌菌絲生長速率以及菌核形成情況。菌絲生長速率=測量的菌落直徑/接種天數(shù)。

1.3 核盤菌PDEs的克隆與表達分析

收集PDA 培養(yǎng)基上不同生長時期（菌絲生長期、菌絲形成菌絲團、菌絲團產(chǎn)生黑色素、成熟菌核）的核盤菌，按照TaKaRa公司RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠檢測RNA 提取質量并用微量紫外分光光度計測定濃度。以提取的總RNA 為模板，將其反轉錄為cDNA，以EF引物（表1）檢測cDNA的質量，檢測合格后以此為模板進行后面試驗。

從核盤菌基因組數(shù)據(jù)庫中共檢索得到8 個PDEs基因序列，采用同源克隆的方法進行擴增。以反轉錄得到的cDNA 為模板進行PCR 擴增，引物見表1，將回收的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T simple vector連接并轉化E. coliDH5α 感受態(tài)細胞，挑選PCR 鑒定為陽性的菌株送生工生物工程（上海）有限公司進行測序，并對測序結果進行分析。根據(jù)測序獲得的8 個PDEs 序列進行qRT-PCR 引物（表1）在線設計（https：//www.genscript.com/tools/real?time?pcr?taqman?primer?design?tool），以β-tubulin作為內參，每組試驗重復3次，應用2-△△Ct進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 PDEs對cAMP-PKA通路的調控分析

為了進一步探究核盤菌菌核原基形成時cAMP-PKA通路中AC（F：5′-ACCGGATCTGGAAA?GTGAAG-3′，R: 5′-GGCATGTTCCACAATCTCAC-3′）、PDE1（F：5′-AGCATGGTATCCGACCGATT-3′,R: 5′-CTCCTGTACATCCAGCTCGT-3′）、PDE2（F:5′-TCTACCGGAGCATTCCCATC-3′，R：5′-AGCGA?AGCAGGGAAGTAAGA-3′）、PKA（F：5′-CGTTCGG?TTCTTGCAGATGT-3′，R：5′-CTCGTCGAATCGTTT?GGCTT-3′）和RAS（F:5′-AGGGCGAGAGACAAGTT?TCA-3′，R：5′-TAGCACCACCAGCTGTGTAA-3′）的表達量，分別收集在含1、2、3、4 mmol/L 阿托品的PDA 培養(yǎng)基上生長8 d（菌核原基形成時）的菌絲，提取其RNA，并檢測濃度，將合格樣品反轉錄為cDNA，以此為模板進行qRT-PCR，每組試驗重復3次，應用2-△△Ct進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 PDEs對核盤菌生長發(fā)育的影響

在PDA 培養(yǎng)基上添加PDEs 特異性抑制劑阿托品對核盤菌菌絲生長具有抑制作用。當添加阿托品濃度為2 mmol/L 時，對菌絲生長速率影響很小，但當阿托品濃度為4 mmol/L 時，菌絲生長緩慢，抑制率可達80%以上，阿托品濃度大于6 mmol/L 時菌絲不生長，而菌絲可在cAMP 濃度為8 mmol/L 的培養(yǎng)基上生長（圖1A、1C）。表明PDEs 在核盤菌菌絲生長發(fā)育過程中具有重要作用。除此之外，添加阿托品的培養(yǎng)基對菌核產(chǎn)生的數(shù)目也有影響，當阿托品濃度為1～3 mmol/L 時，培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生菌核，濃度越高菌核產(chǎn)生的數(shù)目越多。其中，當添加阿托品濃度為3 mmol/L 時，每皿（8 cm 直徑）平均可產(chǎn)生47 個菌核，而對照每皿產(chǎn)菌核的數(shù)目平均為21 個（圖1D）。當添加的阿托品濃度為4 mmol/L時，形成的菌絲較疏松，不能形成菌核（圖1B），表明PDEs不僅影響核盤菌菌絲發(fā)育，而且在菌核形成過程中也具有重要作用。

圖1 PDEs對核盤菌菌絲生長和菌核形成的影響Fig.1 Effects of PDEs on mycelial growth and sclerotia formation of Sclerotinia sclerotiorum

2.2 核盤菌PDEs的克隆與表達

采用同源克隆的方法從核盤菌中共擴增到8個PDEs 基因片段（圖2），測序后比對分析發(fā)現(xiàn)，8 個PDEs序列與目的片段同源性在99%以上。由qRTPCR 分 析 結 果 發(fā) 現(xiàn)，XM_001587616（PDE1）和XM_001588027（PDE2）在菌絲形成菌核的4 個階段表達量均較高，其中，這2 個基因在S1 階段表達量最高，而其他6 個基因表達量在這4 個階段均較弱（圖3）。將PDE1和PDE2提交NCBI，得到基因登錄號分別為MZ611861和MZ611862。

圖2 擴增的PDEs瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Determination of amplified PDEs gene through agarose gel electrophoresis

圖3 菌絲形成菌核不同階段PDEs的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of PDEs in different stages of sclerotia formation

2.3 PDEs對cAMP-PKA通路的調控

收集在不同濃度阿托品培養(yǎng)基上生長8 d 的核盤菌菌絲為材料，檢測PDEs 對菌核原基形成的影響。由檢測結果可知，當培養(yǎng)基中添加阿托品濃度為1～4 mmol/L 時，cAMP-PKA 通路中相關基因表達趨勢相同，PDEs 上游基因AC和RAS表達量上調，PDE1、PDE2和PKA表達量均下降，但PDEs 抑制劑對PKA表達量的抑制作用并非呈典型的濃度對應關系（圖4）。表明PDEs 與菌核原基的形成密切相關，PDEs 抑制劑通過抑制PDE1/2的表達使得下游因子PKA表達量下降，進一步影響菌核原基的形成。

圖4 cAMP-PKA途徑相關因子表達量Fig.4 Expression levels of cAMP-PKA pathway related factors

3 結論與討論

菌核在核盤菌侵染循環(huán)中起核心作用，阻止菌核形成是切斷傳染源最有效的策略?，F(xiàn)階段，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上預防菌核病發(fā)生的最有效措施還是噴灑殺菌劑，主要包括苯并咪唑類和二甲酰亞胺類，但長期使用這幾類殺菌劑會造成抗藥性和交叉抗性[12]，因此，新型靶向殺菌劑的開發(fā)顯得尤為重要。

本研究從菌核形成的重要途徑cAMP-PKA 出發(fā)，以該通路中發(fā)揮調控作用的PDEs 為著手點，從8 個PDEs 中篩選出2 個表達量較高的PDE1/2作為研究重心。研究發(fā)現(xiàn)，當在培養(yǎng)基中添加阿托品時，cAMP-PKA 通路中PDEs 上游基因AC和RAS表達量上調，PDE1、PDE2和下游因子PKA表達量均下降。腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC）作為cAMP 的上游作用因子，其缺失菌株可以產(chǎn)生更多的小分生孢子且致病性缺失，最終形成畸形的菌核[13]。蛋白激酶A（PKA）作為cAMP-PKA 途徑的下游效應物，既可以調控病原菌的生長水平，同時對菌株毒力和致病力也發(fā)揮著重要調控作用。例如敲除尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）中的FoCPKA和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中的PKAC-1，均可導致其生長水平和產(chǎn)孢能力下降[14?15]。在S.sclerotiorum中，PKA 活性水平在由菌絲生長發(fā)育為白色菌核時最高，而在不產(chǎn)生菌核的突變株中PKA的表達水平則很低[16]，由此可知，cAMP-PKA 通路中AC 和PKA 對菌核形成非常重要。本研究在添加了PDEs 抑制劑后檢測出的AC表達量上調，而PKA表達量較低，說明PDEs 抑制劑通過抑制PDE1/2的表達使得下游因子PKA表達量下降，進一步影響菌核原基的形成，本研究結果可為開發(fā)以PDEs 為靶標的殺菌劑提供理論基礎。